鞘内病毒注射

小鼠在2%的三溴乙醇（20μL/g）腹腔注射麻醉下，暴露胸（T）13到腰1（L）1之间的椎间隙，撕破硬脊膜并向尾侧插入1根直径0.2mm的导管，深度约5mm，将5μLAAV9病毒注射到鞘内，随后对创口进行缝合消毒。病毒注射后的第21天，用2%的三溴乙醇进行动物麻醉后，使用碘伏对手术区域进行消毒。对小鼠气管插管后，行椎板切除术，在不损伤DRG和脊髓的情况下，切除L4右侧横突，完整暴露DRG。

DRG活体钙成像

暴露小鼠L4节段的DRG后，立即对小鼠L4DRG进行在体钙成像。在1%异氟烷麻醉状态下，用定制脊髓夹将小鼠脊髓固定，以减少实验过程中因呼吸心跳引起的视野漂移。采用Leica10倍空气镜，1倍放大进行成像。用光镜在显微镜下找到目标视野后，微调Z轴确定DRG的纵深，再分别调整X和Y平面使整个DRG包含在视野内。扫描频率为600Hz/帧，分辨率为512×512像素，激发波长为488nm，激光强度为5%，共采集8帧获取实时图像，其中前2帧为DRG的基线荧光强度（刺激前），第3～6帧为干预期间的荧光强度，第7～8帧为停止干预后荧光恢复过程中的强度。实验过程中，实时监测并维持小鼠的呼吸及血氧饱和度，维持小鼠体温在（35.0±0.5）℃。

毛刷刺激的部位在整个后肢，频率为10cm/s，方向为从近心端向远心端刷毛。温度刺激采用2mL贮满水的玻璃螺口瓶并将其浸入恒温水浴槽或冰中，待刺激时即刻取出使用，刺激部位为整个后肢。钳夹刺激部位分为后爪和“足三里”穴区部位，钳夹频率为2次/s。所有的干预均在第3~6帧执行，约（8s/帧）。

Fig1 A为病毒注射时间和注射部位的模式图；B为小鼠钙成像状态下的模式图；C为电针前后实验操作的流程图。

Fig2 DRG神经元对同节段后爪伤害性机械刺激的反应

在手术暴露的活体动物DRG中，监测了约500个神经元的Ca2+活动变化约1～2h。为了在DRG水平观察电针对疼痛信号的调节作用，本实验首先在小鼠后爪给予间断性钳夹刺激，再在“足三里”给予电针干预，随后观察了同样的钳夹刺激对同节段后爪的伤害性机械刺激在DRG神经元水平的群集反应，实验结果显示钳夹后爪激活了不同大小神经元的钙信号，电针后，小神经元和大神经元激活的数量减少，中等大小神经元有减少趋势但无统计学差异，大中小神经元荧光强度变化与电针前相比虽有个别神经元荧光强度增大但整体水平上显著减弱。本实验结果说明，电针可使DRG神经元对同节段后爪伤害性机械刺激的反应降低。

DRG神经元对毛刷非伤害性机械刺激的反应

与刺激前相比，毛刷激活了广泛的神经元钙信号，其中以大、中神经元的钙活动为主，也包含了小神经元的钙活动。相比电针前，毛刷激活的不同大小神经元数量减少，其中小神经元和大神经元仅有减少的趋势。与电针前相比毛刷激活的总神经元荧光强度（ΔF/F0）显著降低。

文献引用：

1.GAO X, HAN S, HUANG Q, et al. Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity [J]. Pain, 2021, 162(4): 1068-81.

2.张妮楠,高昕妍,刘坤,等.活体钙成像探索电针对不同刺激在背根节神经元初级传入水平的影响[J/OL].针刺研究:1-13[2024-05-03].

3.CHEN Z, ZHANG C, SONG X, et al. BzATP Activates Satellite Glial Cells and Increases the Excitability of Dorsal Root Ganglia Neurons In Vivo [J]. Cells, 2022, 11(15).

4.MELTZER S, SANTIAGO C, SHARMA N, et al. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development [J]. Neuron, 2021, 109(23): 3736-57.

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