摘要：禽流感病毒（AIV）由于其大流行的潜力和对禽类、鸟类和人类健康的破坏性影响，一直是一个持续引起关注的问题。低致病性禽流感病毒有可能演变成高致病性禽流感病毒，导致其在禽类中迅速传播并引发重大爆发。多年来，已经采取了各种传统和新颖的策略来防止禽流感病毒在禽类中的传播。大规模疫苗接种仍然是一种经济有效的方法，可以建立对临床病毒感染的免疫保护。目前，一些禽流感病毒疫苗已经获得许可，可以进行大规模生产和在禽类产业中使用；然而，其他新型禽流感病毒疫苗目前正在进行研究和开发。在本综述中，我们评估了基于经典和下一代平台的各种禽流感病毒疫苗的最新进展。此外，我们还讨论了核酸疫苗的递送系统，因为这些疫苗在对抗COVID-19中发挥了重要作用，因此吸引了广泛关注。我们还对树突状细胞靶向策略进行了一般介绍，该策略可用于增强禽流感病毒疫苗的免疫效率。本综述可能对禽流感研究社区有益，为设计和开发新的禽流感病毒疫苗提供了思路。

关键词：禽流感病毒、预防、疫苗、递送系统、免疫反应。

1

引言

禽流感病毒（AIV）不仅可以感染鸟类，还可以感染其他动物，如猪、猫、狗甚至人类。禽流感病毒的基因组由八个基因片段组成：血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质（M）、核蛋白（NP）、非结构蛋白（NS）、酸性聚合酶（PA）、碱性聚合酶1（PB1）和碱性聚合酶2（PB2）。流感病毒根据其HA和NA蛋白的抗原性被区分为不同的亚型。目前在禽类中已经鉴定出了16个血凝素（HA）亚型和9个神经氨酸酶（NA）亚型。禽流感病毒的H9、H5和H7亚型分别于1994年、1996年和2013年在中国首次被鉴定出来。动物中循环的流感病毒已经多次传播给人类，其中一些病毒表现出了大流行的潜力。禽流感病毒（AIV）感染导致了对人类和家禽产业的经济损失的增加，特别是与更高死亡率相关的H5亚型禽流感病毒。高致病性禽流感病毒（HPAIV）是一种以禽类为主的病毒，具有较高的发病率和死亡率，导致家禽和人类的死亡。此外，低致病性禽流感病毒（LPAIV）株系在感染后不会直接影响家禽和健康人类，但是失控和持续的家禽感染也会产生严重的后果。例如，LPAIV H9N2亚型在家禽中高度流行，当存在混合因素时，可能与发病率和死亡率相关。令人关注的是，这种病毒可能会将内部基因水平地递送给高致病性禽流感病毒（HPAIV），从而增强其毒力和致病性。在中国，由于拥有三条候鸟迁徙路线和全球规模最大的家禽养殖业，被认为是新型流感病毒出现的有利条件的地理区域，至少在2016年至2019年期间已经确认了六个亚型的禽流感病毒。

中国政府已经投入了大量资源来加强禽流感病毒的兽医管理、教育、研究、调查、监测、应急响应、国际合作、大规模疫苗接种和生物安全改进，以控制禽流感病毒。在这些策略中，大规模疫苗接种仍然是控制禽流感疫情和缓解禽流感病毒引起的严重症状的最有效方法之一。由于禽流感疫情的复杂性，中国已严格执行扑杀和生物安全措施，同时大规模家禽疫苗接种被用作迅速缓解严峻局势的一种合理替代策略。中国政府向养禽户提供了免费的禽流感疫苗。中国实施的大规模疫苗接种策略取得了巨大进展并取得了令人满意的成果。因此，2006年至2013年在中国北方的家禽中广泛传播的H5亚型7.2群体已经基本消除，因为自2014年使用相应疫苗以来，没有再检测到该群体。

尽管大规模疫苗接种策略取得了令人印象深刻的成果，但免疫逃逸偶尔会发生，因此禽流感疫情尚未完全控制。科学家们因此担心，高抗体水平可以在免疫压力下加速病毒变异和多样化，从而导致长期来看疫情变得更加复杂。HA蛋白在病毒与宿主细胞表面受体结合中起着关键作用，从而介导宿主细胞与病毒膜的融合。然而，针对HA的抗体通过干扰病毒与受体之间的结合来阻止这一过程，进而进一步阻断下游的过程。

2

禽流感疫苗

开发一种完全有效的疫苗，可以完全预防禽流感病毒感染，是一项具有挑战性的任务。理想的禽流感疫苗应满足以下要求：生产成本低廉，适用于多种禽类物种，能够方便地区分被感染的鸟类和已接种的鸟群，与流行病毒株抗原接近，免疫后提供长期保护，在存在母源抗体的情况下也能够诱导免疫反应，并能在孵化场或体内一天龄时应用。尽管已经开发了各种形式的疫苗来预防流感病毒，包括传统疫苗和下一代疫苗（图1），但目前没有一种疫苗能够满足所有这些要求。因此，用户必须选择符合尽可能多满足其需求的授权疫苗。目前有几种获得许可的禽流感疫苗，并且中国正在开发一些新的疫苗；然而，每种疫苗都有其优点和缺点。

图1：传统和下一代流感疫苗的优缺点。流感病毒疫苗的开发基于完整的病毒颗粒、表面蛋白、核蛋白、病毒基因组和弱毒化病毒策略。

在这些疫苗中，灭活禽流感疫苗是中国最广泛使用的。由于人类流感病毒的抗原漂移导致免疫逃逸，疫苗的抗原必须定期更换，以确保其抗原性与当前流行病毒的匹配。至于禽流感疫苗，主要问题在于不同亚型、群和亚群的病毒在鸟类种群中循环传播。对于特定亚型的禽流感疫苗，抗原漂移仍然是一个问题。因此，针对某些循环病毒的抗体无法对其他病毒提供保护。尽管禽流感病毒的抗原漂移可以预测，并且全球范围内已经建立了生产灭活禽流感疫苗的基础设施和计划，但这项重复性工作需要持续进行。因此，改进和创新禽流感疫苗是一个持续进行的课题，必须借鉴人类流感疫苗研究经验，包括提高免疫原性，促进交叉保护，并开发新型疫苗或通用疫苗。

2.1 灭活疫苗

灭活禽流感疫苗是通过在鸡胚中培养种毒来制备的，这是最常用的禽流感病毒疫苗生产技术过程。然而，这种方法的效率相对较低，需要大量的有生育能力的鸡蛋来制备足够的抗原。HA蛋白是疫苗开发中一个有吸引力的目标，它呈现出庞大且高度可变的免疫优势球状头域，被宿主免疫系统所识别。先前的研究表明，种子病毒在鸡蛋中的递送可能会改变HA的抗原性，导致与流行株之间的抗原不匹配，从而使疫苗的功效降低。为了避免在鸡蛋中递送引起的HA突变，可以使用培养的哺乳动物细胞系进行病毒繁殖。此外，基于哺乳动物细胞的流感疫苗在动物模型中提供了与基于鸡蛋的疫苗相媲美或改善的免疫保护效果，其安全性和有效性均已通过临床试验得到证实。利用哺乳动物细胞系培养病毒具有几个优点，包括使用完全表征和标准化的细胞以及在新兴大流行病情况下便于大规模培养。此外，基于细胞的疫苗生产过程的效率不仅取决于特定细胞产生病毒疫苗的能力，还取决于大批量病毒疫苗的工艺优化。目前，已经研究了两种用于流感病毒生产的不死细胞系：Madin-Darby犬肾细胞（MDCK细胞）和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）。

收获和纯化的病毒颗粒被灭活，然后与油性佐剂乳化。甲醛经常用于灭活，以制备完整的灭活疫苗，因为它可以与广泛的反应基团相互作用，无论是蛋白质、RNA还是DNA，从而引发烷基化和单功能或双功能交联。然而，使用甲醛存在一些缺点：一是疫苗中残留甲醛引起的毒性，另一个是由于甲醛的化学修饰导致抗原表位的改变。疫苗生产中另一个常用的灭活剂是β-丙内酯。它作为一种烷基化剂发挥作用；然而，在灭活过程中也可能发生大分子的酰化和交联。β-丙内酯可以穿过病毒膜，导致核酸碱基的不可逆烷基化，从而抑制病毒基因组的复制或降解。因此，与甲醛通过蛋白质调节不同，β-丙内酯通过变性核酸来灭活病毒。因此，在β-丙内酯灭活过程中，病毒的抗原结构将得到保持。研究人员已经研究了用甲醛和β-丙内酯灭活的疫苗进行免疫接种。观察到用β-丙内酯灭活的H5N1疫苗免疫后，细胞毒性CD8+ T细胞水平和细胞因子产生水平较高。病毒灭活也是利用逆遗传学技术制造疫苗的重要方面。禽流感病毒的分段基因组使得可以将非致病禽流感病毒内部蛋白质编码基因片段与高致病流行病毒株的表面蛋白质进行重组。逆遗传学技术还可以用于修改HA序列，以提高其在鸡胚或细胞系中的复制能力，进一步增强疫苗生产的效率。最近，在中国已经获得了许多使用灭活逆遗传设计的禽流感病毒疫苗的许可（表1）。家禽接种灭活病毒疫苗通常在2-5周龄开始，第一次免疫后需要4个月进行增强免疫，因为疫苗提供的免疫力不持久。研究人员已经证明，注射灭活禽流感病毒疫苗可以导致孵化后的鸡产生血清转换，并诱导孵化后雏鸡产生免疫应答。

表1.中国H5 AIV亚型疫苗的使用时间

注：HA代表血凝素。缩写：GS-鹅、CK-鸡、DK-鸭、WS-天鹅、GD-广东、SX-山西、AH-安徽、LN-辽宁、GZ-贵州、FJ-福建。

2.2 活疫苗

活病毒弱化疫苗在美国、加拿大和几个欧洲国家可供人类使用。这些疫苗源自冷适应和温度敏感的母体供体病毒，在鸡蛋中培养，导致HA发生适应鸡蛋的突变。经鼻给予的活病毒弱化流感病毒会在鼻粘膜中复制，并诱导免疫反应，但由于其在肺部复制的能力受限，因此会被弱化。活病毒弱化疫苗模拟了自然感染过程，可以诱导产生IgA和IgG抗体，而不会引起严重的不良反应。IgA是黏膜分泌物中的主要亚型，可以在上皮表面和上呼吸道中检测到。IgG是血液和细胞外液中的主要亚型，在初始复制部位提供交叉反应的免疫应答。中国目前没有商业化的禽流感活病毒弱化疫苗。然而，研究人员已经利用活病毒载体表达HA基因或结合神经氨酸酶（NA）基因来开发禽流感疫苗。已经尝试了几种病毒载体，例如禽痘病毒、新城疫病毒和疱疹病毒等，这些疫苗已在至少一个国家获得许可。

禽痘病毒已被广泛应用于全球的研究实验室和家禽养殖场作为高致病禽流感疫苗的载体。禽痘病毒被用作活疫苗来表达A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）病毒的HA和NA基因，并且其有效性在实验室和田间试验中得到证实。这种疫苗可以对抗H5N1和H7N1病毒的挑战，表明疫苗中的N1成分能够对抗异源的H7病毒。然而，如果鸡只之前曾接触过活禽痘病毒或具有禽痘病毒的母源抗体，则禽痘-禽流感病毒的复制和后续免疫反应将减弱或阻断。这一缺点极大地阻碍了禽痘-禽流感疫苗在饲养场中的潜在应用。

新城疫病毒（NDV）也被用作疫苗载体，并具有几个优点，包括易于制备、高产量和能够作为一种双价疫苗对抗新城疫病毒和禽流感病毒。通过使用逆遗传学系统和工程重组的新城疫病毒表达H5N1病毒的HA基因，已经证明这种重组病毒在鸡只中引起了对新城疫病毒和H5禽流感病毒的强烈血凝抑制（HI）抗体反应。在中国，新城疫-禽流感疫苗已获得许可，并在上市后的头两年内使用了约40亿剂次的疫苗。

在20世纪70年代，火鸡疱疹病毒（HTV）被用作马立克病的疫苗，并且也被用于表达禽流感病毒基因进行疫苗开发。HTV载体似乎能够克服母源抗体的干扰，因为病毒主要通过细胞间传播。此外，HTV载体可以在宿主体内持续存在，并在免疫后最长可达9周的时间内达到最高免疫力。此外，这种HTV-禽流感疫苗还能诱导体液和细胞免疫反应，即使对挑战病毒的抗体滴度较低，也能提供良好的临床保护。不同制造商已在三个以上的国家获得了HTV-禽流感疫苗的许可。然而，由于高水平的母源抗体，尤其是在中国，NDV和HTV疫苗的使用受到限制，并已纳入免疫程序中。

2.3 病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒（VLP）疫苗作为禽流感疫苗开发的潜在候选者引起了广泛关注。VLP是自组装的非感染性颗粒，这意味着这些疫苗具有很高的安全性水平。这些颗粒可以从不同的表达系统（如细菌、酵母、昆虫和动物细胞系）中产生，并可用作疫苗开发中的颗粒载体或抗原，因为它们具有免疫原性特征。此外，它们具有与原始病原体相似的特征，如相似的大小、重复的表面几何结构以及刺激抗原呈递细胞（APCs），尤其是树突状细胞（DCs）的能力，以及诱导体液和细胞免疫反应的能力。因此，宿主的免疫系统可以以与完整的灭活病毒疫苗相等的方式识别VLP疫苗，从而促进强大的免疫反应。

基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗在流感疫苗的开发中得到广泛应用，并在提供免疫保护方面取得了令人鼓舞的结果。研究人员已经证明，由包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白1（M1）在内的三种流感病毒蛋白组成的H5N1、H3N2和H9N2 VLP疫苗可以在昆虫细胞中表达并组装成VLPs。胡等人使用杆状病毒表达系统创造了一种双价H5+H7 VLP疫苗，该疫苗表达了HA、NA和M1蛋白。双价VLP疫苗和商业灭活疫苗均诱导了有效的免疫反应，包括产生抑制血凝、中和病毒和针对HA的抗体。双价VLP疫苗在减少鸡只中的病毒排泄和复制方面表现出显著效果，与商业灭活疫苗的效果相当。此外，双价VLP疫苗在减少H7N9病毒感染引起的鸡只肺部病变方面优于商业疫苗。此外，由HA和M1组成的VLP在免疫小鼠和雪貂后诱导了高水平的抗体，并提供了对致命病毒挑战的免疫保护。

2.4 通用疫苗

流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白具有较高的突变率，因此疫苗的种子病毒也需要变化以适应流行的流感病毒。因此，开发一种能够诱导长期免疫应答并提供对多种不同病毒株的保护的通用流感疫苗非常重要。为了开发通用疫苗，进行了一些依赖于保护性保守表位的努力。有希望的通用疫苗候选物包括细胞外基质2（M2e）、HA的干部、HA的受体结合位点（RBS）以及M1和核蛋白（NP）中的某些细胞毒性T淋巴细胞表位（CTL表位）。细胞外基质2（M2）蛋白是一个质子通道，同时决定了病毒颗粒的进入和退出。M2蛋白的细胞外区域的24个氨基酸由于在多种流感病毒株中高度保守，因此成为一个有趣的疫苗靶点。针对M2e的抗体不会阻止病毒进入靶细胞，但可以阻止病毒释放。尽管M2e作为疫苗抗原具有吸引力，但自然感染后的M2e免疫原性较低。为了克服这一障碍，已经开发出创新的方法来诱导针对M2e的抗体反应。通过人工合成产生的与纤维化肽耦合的M2e表位肽疫苗可以在生理盐溶液中自组装成纳米颗粒。这种策略已经证明，使用基于M2的纳米颗粒免疫可以诱导对PR8 H1N1流感病毒和高致病性禽流感H7N9病毒的同源性挑战的免疫保护。M2e的保守性和交叉保护性是改进当前流感疫苗的令人兴奋的特点。尽管已经评估了几种形式的M2e疫苗，但目前市场上还没有获得许可的M2e疫苗。因此，为了解决基于M2e的疫苗的这一挑战，正在考虑与其他保守表位的组合。尽管HA蛋白的突变率很高，但HA的受体结合位点（RBS）在功能上是保守的，因为这个位点对于流感病毒的进入是必需的。针对RBS的抗体显示出很高的交叉中和能力。此外，HA的干部也是高度保守的，使其成为广泛保护性免疫反应的有价值候选物。因此，可以通过将RBS和HA的干部表位组合构建嵌合HA，其中HA的头部可以改变。此外，NP和M1在甲型流感病毒中是保守的，但它们不适合用于疫苗开发中的抗体诱导，因为它们在病毒表面上暴露不足。然而，这些蛋白中的表位负责CTL，从而产生广泛的交叉反应免疫反应。

2.5 DNA疫苗

典型的DNA疫苗是将编码抗原的基因插入非复制的真核表达质粒载体中，通过直接基因转移途径递送给宿主。然后，宿主细胞表达由质粒编码的抗原蛋白，并通过主要组织相容性复合物（MHC）途径呈现给免疫细胞。DNA疫苗诱导的免疫应答是Th1类型的免疫应答，其中细胞介导的免疫对DNA疫苗的免疫优势大于体液免疫。先前的研究表明，DNA疫苗机制模拟了病毒的细胞发病机制。抗原蛋白在细胞内被表达并被内质网蛋白酶体消化成较小的肽段。随后，这些肽段由MHC-I分子呈现，以引发特异性抗原的CD8+ T细胞反应。此外，这些肽段也由MHC-II分子呈现，以激活CD4+ T辅助细胞，进而刺激活化B细胞产生特异性抗体。

早期的研究表明，DNA疫苗编码的HA基因可以通过提高HA特异性血清抗体水平来保护免受致命的同源性挑战。对于高致病性禽流感病毒的有效DNA疫苗，需要约200-400微克的质粒DNA剂量。这种高剂量对于免疫的要求是使用该疫苗的主要障碍。另一方面，宿主中的高效抗原表达是DNA疫苗的关键。根据宿主物种的密码子偏好，可以调节抗原编码序列以增强表达效率。这种策略可以通过改善抗原基因的表达来降低DNA疫苗的剂量。接种经密码子优化的HA质粒的动物与接种野生型HA质粒的动物相比，抗体滴度高出4倍，从而在病毒挑战测试中获得更高的存活率。

DNA疫苗展示了多种理想的特性，可用于流感控制，并已经在各种疾病的测试中得到应用，包括病毒和细菌感染以及某些类型的癌症。与主要依赖于抗体产生的灭活流感疫苗不同，DNA疫苗具有有效刺激体液和细胞免疫应答的能力。DNA疫苗的制备不需要培养活病毒，并且可以迅速扩大规模以应对新兴的流感大流行情况。尽管具有这些优势，小动物模型（主要是小鼠）中实现的有希望的免疫应答很少能在较大动物中复制。小鼠模型的数据是从经过小鼠适应的流感病毒暴露的高度近交动物的免疫应答中得出的。这为与杂交人群中的疫苗接种结果进行比较提供了不可靠的基础，目标是保护免受流行的流感病毒。较大的动物模型，如雪貂和恒河猴，提供了更相关的数据，因为它们易受人类流感病毒感染。雪貂表现出与人类相似的临床症状、肺部病理和传播模式，而恒河猴对流感表现出类似人类的免疫应答，使其成为预测疫苗在人类中有效性的可靠指标。因此，在较大动物中获得足够的免疫原性要求开发强效的递送系统和佐剂。

2.6 mRNA疫苗

1993年，Martinon等人进行了关于传统mRNA流感疫苗的疗效的开创性研究。他们观察到，在给小鼠注射编码流感核蛋白（NP）的脂质体疫苗后，诱导了细胞毒性T细胞应答。随后，其他研究人员证明，给猪、雪貂和鸡注射编码HA、NA和NP的不同mRNA可以引发可测量的免疫应答。

目前，mRNA疫苗可以分为两种主要类型：传统的非扩增mRNA分子和自扩增mRNA（saRNA），后者保持了来源于RNA病毒载体的自复制活性。非复制的mRNA疫苗可以通过引入各种修饰的核苷酸来生产。许多研究专注于针对流感病毒的这些疫苗的进展。Pardi等人报告称，用单剂量3 µg的mRNA-LNP-HA疫苗免疫小鼠和雪貂，在注射后四周产生了>1:120的NAbs滴度。第二剂次根据剂量和注射途径将这些血凝抑制抗体滴度提高到1280-20,480的值。当小鼠、雪貂和猪皮内注射编码流感HA、NP和NA的RNA疫苗时，观察到了保护性免疫应答。此外，接受PR8 H1N1流感A病毒HA编码未修饰mRNA-脂质复合物静脉注射的小鼠表现出增强的T细胞活化。saRNA疫苗可以以各种形式递送，包括类病毒RNA颗粒、质粒DNA和体外转录的RNA。已经有多个报告关于使用saRNA疫苗对抗流感病毒的研究。Fleeton等人进行了一项研究，其中用编码PR8 H1N1流感A病毒HA的10 mg saRNA疫苗免疫小鼠，在致命的同源病毒挑战中产生了保护性免疫应答。另一项研究使用脂质纳米颗粒封装编码HA的saRNA，经过两次肌肉注射后，在小鼠中诱导出具有保护水平的血凝抑制滴度。

3

DNA疫苗递送策略

在过去的十年中，DNA疫苗的递送策略已经成为研究的热点领域。一个高效的DNA疫苗需要能够进入宿主细胞并实现蛋白表达；此外，该疫苗还必须能够引起免疫系统的警觉并诱导免疫应答。Kim等人指出，在裸DNA疫苗给予后，会快速从注射部位迁移，并伴随着质粒DNA的降解；因此，在小鼠体内，仅在8小时后偶尔能检测到质粒DNA。研究人员一致认为，直接将DNA递送给抗原呈递细胞（APCs）是一个潜在的疫苗递送系统。然而，将质粒DNA疫苗有效递送到细胞核内需要克服几个障碍，包括通过内吞作用或胞浆吞噬作用穿越磷脂细胞膜、面对内体和溶酶体中的降解、抵抗胞浆核酸酶的降解、跨越核膜、最终实现抗原蛋白表达。因此，DNA疫苗递送系统的关键是克服这些生物学障碍，将质粒安全地递送到细胞核，并实现蛋白表达。已经尝试了几种策略来提高DNA疫苗递送的效率，包括聚合物、脂质体、活体细菌等。此外，在COVID-19疫苗开发后，脂质纳米颗粒（LNPs）作为DNA疫苗递送的潜在载体引起了关注。此外，基因枪是一种机械递送装置，可以将大分子引入目标细胞，也被用于DNA疫苗的递送。

3.1 聚合物递送系统

聚合物在组织工程、基因治疗和DNA疫苗等领域被广泛用作递送系统。聚合物可以将DNA材料包装成纳米和微米粒子，以防止核酸酶的损害，并实现可调控的降解和控制释放。此外，这种粒子结构可以被免疫细胞轻易捕获。如今，已经探索了各种聚合物用于DNA疫苗的开发（图2）。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）已被用于包装和递送针对多种动物疾病的DNA疫苗，如流感、口蹄疫病毒（FMDV）和寄生虫感染。将DNA疫苗包装到PLGA中可以增强全身性的、特异性抗体和T细胞增殖反应。此外，报道了DNA包被的PLGA微粒可以增强DNA疫苗对抗原呈递细胞（APCs）的递送。然而，尽管使用PLGA递送DNA已被发现可以诱导免疫反应，但仍存在一些问题，包括封装过程中的DNA降解和由于微米尺寸导致的转基因表达较低。因此，研究人员开发了一种改良的PLGA纳米颗粒，使用甘露聚糖壳层进行双重活细胞追踪和DNA疫苗递送 。这些颗粒可以直接转染朗格汉斯细胞，增强基因转录和表达。因此，PLGA纳米颗粒促进了DNA迁移到淋巴结和初始B和T细胞的激活。

图2. 基于聚合物的DNA疫苗递送设计。聚合物可以由从生物体中获得的单体单元或人工合成的单体单元制成，包括壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乙烯亚胺（PEI）、多肽和其他非离子嵌段共聚物。聚合物可以通过络合或封装来保护DNA免受降解，并将其递送到宿主细胞中诱导免疫反应。

聚乙烯亚胺（PEI）是另一种广泛用于DNA疫苗递送的聚合物。对于DNA疫苗递送，PEI的使用经过了深入研究，并且据报道能够改善H1N1 DNA疫苗的体液免疫反应。然而，DNA/PEI复合物存在毒性问题，在血清蛋白存在下易聚集，并迅速从循环中清除，导致DNA递送效率有限。为了克服这些问题，使用γ-聚谷氨酸来修饰DNA/PEI复合物，通过降低复合物的表面电荷，从而减少在生理环境中的聚集和稳定性。γ-聚谷氨酸由某些芽孢杆菌菌株产生，据推测通过与免疫细胞受体的相互作用来起到佐剂的作用。

一些天然材料也被研究用于其他生物应用，包括基因递送，因为它们具有天然的生物相容性、非毒性、可降解性、稳定性、廉价生产和免疫刺激性。例如，菊粉、透明质酸、藻酸盐以及壳聚糖在疫苗递送领域引起了关注。壳聚糖是从贝壳中部分去乙酰化的壳聚糖，已被广泛研究用于DNA疫苗递送。壳聚糖必须在略微酸性的环境（pH < 5）中溶解；这种性质使其适合进行化学改性，从而改变其溶解性和电荷，使其适用于各种应用。此外，壳聚糖被确认为无毒且生物相容的材料，因此其使用已获得食品药品监督管理局的批准。在壳聚糖包被的微球（20到50微米）中固定的质粒DNA可以诱导黏膜和全身免疫反应。

3.2 脂质体递送系统

脂质体最早在20世纪60年代被发现并用于生物膜研究的模型。所有的脂质体都具有一个共同的特点，即它们是具有阳离子基团的两性分子。在持续的研究中，脂质体的优点包括高载荷能力、可降解性、较高的安全性以及相对容易和低成本的生产。此外，脂质体可以按照模块化原理进行设计，因此可以修改结构、连接剂和亲脂区域以获得更高的递送效率。脂质体有四种主要类型，包括传统脂质体、聚乙二醇修饰脂质体（PEG化脂质体）、配体靶向脂质体和抗体修饰脂质体（图3）。

图3. 脂质体递送系统不同类型的示意图。（A）传统脂质体：脂质体由一个脂质双层组成，可以由正、负或中性脂质构成，其内部包裹着水性核心。（B）PEG化脂质体：通过添加聚乙二醇对脂质体表面进行修饰，以实现立体稳定。（C）配体靶向脂质体：通过添加配体对脂质体表面进行修饰，以实现特异性靶向递送。（D）抗体修饰脂质体：将抗体（单克隆抗体、纳米抗体、Fab和scFv）固定在脂质体表面。

传统脂质体是第一代脂质体，由阳离子、阴离子或中性脂质组成的脂质双层构成。为了增强脂质体的稳定性并改善其在生物体内的循环时间，通过聚乙二醇修饰引入了立体稳定脂质体。此外，配体靶向脂质体为DNA疫苗的特定细胞类型，特别是抗原呈递细胞（APCs），提供了显著的潜力，这些细胞表面选择性地表达或过度表达特定的配体。有许多类型的配体可用，包括肽、蛋白质和小分子。抗体，特别是单克隆抗体（mAb）、纳米抗体和抗体的抗原结合区域，可以固定在脂质体表面，是较为多功能的配体之一。

脂质体形成由磷脂和胆固醇组成的脂质双层的球形囊泡结构，可以与细胞膜融合。质粒DNA可以被包裹在脂质体双层上或封装在脂质体囊泡内。脂质体作为DNA疫苗递送载体的应用引起了极大的兴趣，因为它们能够生成尺寸可调节的实体，提供载体定制，并激活先天免疫受体。脂质体具有生成亚微米级颗粒的能力，有助于大量DNA的包裹，从而防止DNA由于阴离子竞争而被排挤。这一特性确保了大量的DNA有效地被困在脂质双层内。

在疫苗制剂中，脂质体表现出调节组织内局部分布、增强注射部位滞留和调节细胞转运的能力。使用脂质体制备的疫苗具有多个优势，包括促进抗体产生和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的增强。然而，需要注意的是，脂质体引发的免疫反应的具体特征因脂质组成、颗粒大小、表面电荷和包裹抗原的位置等因素而异。研究表明，脂质体显示出作为递送DNA疫苗到黏膜组织的候选物的潜力。Liu等人使用脂质体系统通过口服途径递送编码流感A病毒M1基因的DNA疫苗，产生了体液和细胞免疫反应，并伴随着IFN-γ产生的增加。

3.3 活菌递送系统

用于DNA疫苗递送系统的细菌是经过基因修改的重组菌株，确保它们的大部分致病性成分已被删除，以确保宿主的安全性。作为DNA疫苗递送系统，细菌分为两大类：非致病性细菌和减毒的致病性细菌。已研究用于DNA递送的减毒细菌包括单核细胞增多李斯特菌（L. monocytogenes）、沙门氏菌属（Salmonella species）、志贺氏菌属（Shigella species）和肠道耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）。致病性细菌以粘膜为感染途径，因此适合粘膜给药。然而，主要缺点是可能引起感染，特别是在婴儿和免疫功能受损的个体中。因此，乳酸菌等非致病性细菌可能更适合作为DNA疫苗递送系统的开发对象。

如果使用细菌递送DNA疫苗，可以通过黏膜途径进行递送，包括鼻腔和口服途径。口服给药不需要特殊技能，更容易管理，而经鼻腔途径给药则可以避免酶反应，并且可以规避肠道中的高酸性条件。经口给药后，携带DNA疫苗的细菌进入消化系统，在Peyer氏斑的M细胞中被识别（图4），并通过肠道表面转运到粘膜下层。宿主中表达的抗原由MHC I呈递，并激活CD8+ T细胞，也可以作为细胞外蛋白质由MHC II呈递，从而激活抗体产生和T辅助CD4+细胞的反应。因此，这种给药途径能够诱导黏膜和全身免疫反应。

乳酸菌是用于工程化DNA疫苗递送的优秀候选菌株。它们自古以来就被用于食品发酵，并被普遍认为是安全的微生物。一些乳酸菌株被认为是益生菌，可以通过抑制病原体在胃肠道的定植和促进黏膜免疫系统来增强对病原体的免疫反应。Yagnik等人报道了乳酸杆菌能够在无化学处理的情况下将质粒DNA转运到Caco-2细胞中。沙门氏菌是革兰氏阴性细菌，通过口肠途径引起沙门氏菌感染。Kong等人构建了一个具有高侵袭表型的重组弱毒沙门氏菌突变株，在进入宿主细胞后有效递送DNA疫苗。作为DNA疫苗递送策略，口服给药是合适的，以模拟其自然感染途径。通过aroA、aroC或aroD基因突变，突变型伤寒沙门氏菌和伤寒鼠伤寒沙门氏菌被开发为DNA疫苗递送载体。

图4.使用活细菌将DNA疫苗递送到哺乳动物细胞的机制的示意图。(A)。在侵入宿主后，细菌被各种细胞类型识别，包括微小褶皱细胞、上皮细胞或免疫细胞。(B)。重组细菌被吞噬溶酶体复合物内化，随后发生溶解。在这个过程中，DNA疫苗从囊泡中释放出来并转运到细胞核中，允许抗原基因的转录。产生的抗原蛋白被呈递给免疫系统，触发细胞和体液免疫反应。

4

树突状细胞靶向增强疫苗免疫效果

B细胞和T细胞通过抗原呈递细胞（APCs）的作用而进入适应性免疫反应，这些细胞从内部环境中捕获抗原并将其呈递给这些淋巴细胞。APCs是一组包括巨噬细胞、B细胞、某些髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）在内的异质性细胞。鉴于APCs在触发免疫反应中的关键作用，已经探索了许多策略来特异性地将抗原靶向到一个或多个APC亚群。在这些不同的细胞类型中，树突状细胞由于其高效的抗原摄取、处理和对T细胞的呈递而被认为特别重要。与靶向材料的接触导致树突状细胞成熟并迁移至淋巴结，从而产生免疫反应。同时，树突状细胞靶向材料还可以通过产生保护性细胞因子（如IL-2、IL-4和IFN-I）发挥作用，这些细胞因子影响适应性免疫反应的不同步骤和先天淋巴细胞的激活。因此，将抗原递送靶向到树突状细胞是一种更直接、更简便的策略，可以诱导有效的免疫反应，近年来引起了相当大的关注。

先天免疫系统的细胞表达模式识别受体（PRRs），也称为病原体识别受体或祖先模式识别受体，因其在适应性免疫发展之前出现而得名。模式识别受体（PRRs）主要分为两大类。第一类是内吞型PRRs，特异性地结合碳水化合物。该类别包括甘露糖受体（MR）、葡聚糖受体和清道夫受体（SR）。第二类是信号型PRRs，包括膜结合的Toll样受体（TLRs）和胞质内的NOD样受体。已在树突状细胞表面鉴定出许多PRRs，包括DC-SIGN、MR、TLR、SR和DEC-205。其中，C型凝集素是一类多样化的凝集素家族，其特点是具有碳水化合物识别结构域。在树突状细胞的背景下，关键的C型凝集素如DC-SIGN、DC-SIGNR、DCAR、DCIR、Dectins和DLEC在诸如运输、免疫突触形成和细胞免疫和体液免疫反应的启动等过程中发挥重要作用。TLRs是先天免疫受体，可以通过模式识别处理配体来检测各种分子，包括组织损伤标志、细菌、病毒、原虫和线虫。已经鉴定出13种已知的TLRs，它们可以识别各种微生物抗原，但在对微生物模式的特异性上有所不同。靶向这些受体正在成为递送抗原的树突状细胞靶向疫苗的有效方法。

树突状细胞靶向策略的利用正在开发针对病毒性病原体和癌症的疫苗（图5）。这些抗原被设计成能够结合到树突状细胞的分子。当这些携带抗原的分子被注射到体内并被树突状细胞摄取后，它们会激活免疫系统产生反应。Jauregui-Zuniga等人描述了对鸡DEC-205受体的碳水化合物识别结构域-2（CRD-2）开发的单克隆抗体（mAb），然后将其与纯化的血凝素（HA）结合，将抗原定向到树突状细胞，从而在鸡体内在初次免疫后的14天即引发强烈的免疫反应。Gudjonsson等人表明，将流感病毒HA和趋化因子受体Xcr1+靶向到树突状细胞可以诱导免疫反应，并提供对流感病毒的保护。此外，一些研究表明，在流感疫苗中添加一种被称为TLR激动剂的佐剂可以增加被激活的树突状细胞数量，从而产生更强大、更持久的免疫反应。

图5. 树突状细胞靶向递送DNA疫苗的引入策略。第一步：DNA疫苗由一个编码抗原基因的质粒组成，质粒中含有哺乳动物启动子。第二步：它被表面修饰有树突状细胞（DC）靶向配体的包装材料所封装。第三步：将DNA递送疫苗复合物定位到树突状细胞后，编码的抗原在树突状细胞内表达，并通过主要组织相容性复合物（MHC）途径呈现加工后的抗原以激活原始T细胞。第四步：通过树突状细胞的MHC II途径触发CD4+ T辅助细胞的激活，而B细胞则通过识别分泌的抗原或活化的CD4+ T辅助细胞来产生不同类别的抗体。第五步：通过MHC I分子呈现在内源性表达的抗原主要激活CD8+ T细胞免疫。释放的细胞因子（干扰素-γ [IFN-γ] 或肿瘤坏死因子-α [TFN-α]）抑制病毒复制并增强MHC II分子的表达。同时，巨噬细胞也被激活以支持细胞介导的免疫反应。

5

结论

总之，大规模疫苗接种仍然是控制禽流感（AIV）感染和传播的多管齐下策略中的关键部分。持续存在的禽流感大流行威胁强调了开发新型疫苗的必要性，这些疫苗具有比现有禽流感疫苗更简化、更易制造的工艺流程，并能有效提供对潜在大流行病毒株的免疫保护。尽管近年来在开发和设计应对禽流感大流行威胁的多种疫苗方面取得了进展，但还有几个方面值得关注，以开发出理想的禽流感疫苗。在禽流感疫苗研究中，高效佐剂的开发是一个关注的领域。正在开发新的佐剂，可以更有效地刺激免疫系统，同时最大程度减少副作用，这可能提高疫苗的功效和安全性。此外，改变免疫接种途径也不容忽视，因为研究表明皮内注射在产生免疫应答方面更有效，并且可能需要更小剂量的疫苗，从而增加疫苗的可获得性。总体而言，本综述提出的多种策略有助于更好地了解当前禽流感疫苗的情况。随着研究人员不断探索创新方法来开发更有效、更易获得的疫苗，疫苗开发的未来看起来是充满希望的。

欢迎来到医食参考新媒体矩阵

2023年疫苗接种攻略

阳过了，该怎么打疫苗？最全接种指导手册来了

撰写| 药时空

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice