2025年12月15日，安徽医科大学孙倍成、武鹏凯、张振及新疆维吾尔自治区维吾尔医医院李治建团队在肝病学领域权威期刊Journal of Hepatology（中科院1区，IF=33）在线发表题为 “Decreased LONP1 expression exacerbates MASH-induced liver fibrosis via elevated orotic acid levels” 的研究论文。该研究聚焦代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）进展过程中肝纤维化的代谢驱动机制，围绕线粒体蛋白酶 LONP1 如何通过调控 DHODH 降解和乳清酸代谢，影响肝细胞与肝星状细胞之间的代谢串扰，并最终推动 MASH 相关肝纤维化展开系统研究。
MASH 是代谢功能障碍相关性脂肪性肝病进展中的关键阶段，其病理特征包括脂肪变性、炎症损伤和纤维化加速。肝纤维化不仅是疾病进展的重要标志，也是影响患者长期预后的核心因素之一。然而，目前针对 MASH 相关肝纤维化的有效治疗手段仍然有限，尤其是驱动肝星状细胞持续活化的代谢信号及其来源仍有待深入阐明。
本研究发现，MASH 患者和小鼠肝脏中线粒体蛋白酶 LONP1 表达显著降低。进一步通过肝细胞特异性 Lonp1 敲除模型，研究者证实 LONP1 缺失可导致肝损伤和纤维化加重，并伴随肝星状细胞活化增强。多组学分析显示，LONP1 缺失后肝脏代谢谱发生显著重塑，其中乳清酸水平明显升高，提示其可能是连接肝细胞线粒体稳态紊乱与纤维化进展的关键代谢物。
机制研究进一步揭示，LONP1 可直接结合并以 ATP 依赖方式降解二氢乳清酸脱氢酶 DHODH。DHODH 是嘧啶合成通路中的关键酶，参与乳清酸生成。当 LONP1 表达下降时，DHODH 蛋白异常积累，导致乳清酸过量生成。升高的乳清酸可被肝星状细胞摄取，并促进其增殖和活化，从而加速胶原沉积和肝纤维化进程。
在下游机制方面，研究显示乳清酸可增强转录因子 ATF3 的核定位和转录活性，进而促进 ACTA2、COL1A1、COL6A1 和 TIMP1 等纤维化相关基因表达。敲低 ATF3 后，乳清酸诱导的肝星状细胞活化被明显削弱，说明乳清酸推动纤维化的作用依赖 ATF3 介导的转录调控。
更重要的是，研究者通过遗传和药物干预进一步验证了这一通路的治疗潜力。肝细胞特异性过表达 LONP1 可降低 DHODH 和乳清酸水平，抑制肝星状细胞活化，并显著缓解 MASH 小鼠肝纤维化。LONP1 激活剂 84-B10 和 DHODH 抑制剂 brequinar 也均可降低乳清酸水平并改善实验性肝纤维化。人群样本分析进一步显示，MASH 及 MASH 纤维化患者中 LONP1 水平降低、DHODH 和乳清酸水平升高，且乳清酸水平与纤维化基因表达和纤维化评分呈正相关。
总体而言，该研究提出了一条新的 MASH 肝纤维化代谢驱动轴：LONP1 下降 → DHODH 积累 → 乳清酸过量生成 → ATF3 介导肝星状细胞活化 → 肝纤维化加重。这一发现不仅拓展了人们对线粒体蛋白质稳态与肝纤维化关系的认识，也提示靶向 LONP1-DHODH-乳清酸轴可能成为干预 MASH 相关肝纤维化的新策略。
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【摘要】
背景与目的：
识别驱动代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）中肝纤维化发生发展的代谢靶点，对于开发有效的预防性治疗策略至关重要。然而，MASH 中发生失调的代谢通路及其潜在分子机制仍不清楚。Lon 肽酶 1（LONP1）是一种线粒体蛋白酶，在维持线粒体蛋白质量监控以及执行高度调控的蛋白水解反应中发挥关键作用。本研究旨在探索 LONP1 如何将蛋白水解监控与肝纤维化中的线粒体代谢重塑联系起来。
方法：
本研究使用了小鼠肝纤维化模型、肝细胞特异性 Lonp1 敲除小鼠模型，以及来自 MASH 患者的肝活检样本。通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，鉴定可能促进 MASH 诱导肝纤维化的潜在代谢物。
结果：
MASH 患者和 MASH 小鼠中的 LONP1 表达降低。肝细胞特异性 LONP1 缺失会导致二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）积累、乳清酸水平升高，并加重 MASH 诱导的纤维化。相反，过表达 LONP1 或使用 DHODH 抑制剂可降低乳清酸水平，并缓解小鼠 MASH 诱导的肝纤维化。机制上，LONP1 可通过 ATP 依赖方式选择性降解 DHODH，从而降低乳清酸水平，并抑制 ATF3（激活转录因子 3）介导的肝星状细胞活化。这些发现也在 MASH 患者中得到验证：血浆乳清酸水平与肝脏 LONP1 水平呈负相关，并与纤维化相关基因表达和纤维化评分呈正相关。
结论：
本研究表明，LONP1-DHODH 相互作用调控乳清酸代谢，并可缓解 MASH 诱导的肝纤维化。
01
研究背景及科学问题
代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）是肝硬化发生的重要原因。代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）是 MASLD 更进展的阶段，其特征包括坏死性炎症、纤维化加速以及肝硬化和肝细胞癌风险升高。该疾病影响约 3%–6% 的成年人，且预计患病率还将进一步上升，使 MASH 成为一个日益严峻的全球健康问题。虽然已有多种药物处于后期研发阶段，但目前针对肝纤维化的有效治疗仍然有限。鉴于 MASH 的病理生理过程复杂且异质性显著，亟需更深入地理解驱动肝纤维化的分子机制。
肝星状细胞（HSCs）在肝纤维化中发挥关键作用。在 MASH 中，受损肝细胞或免疫细胞释放信号，导致 HSC 活化。活化的 HSC 表达 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）并合成胶原，从而导致细胞外基质积累和肝纤维化。MASH 诱导的纤维化涉及 HSC 与肝脏微环境中多种细胞成分之间的复杂相互作用，包括趋化因子、生长因子、活性氧以及代谢物。由于肝脏在全身代谢中处于核心地位，其微环境中含有广泛的代谢物，其中一些会影响纤维化进展，例如乳酸和胆酸。研究表明，二者均可通过改变代谢重编程和转录因子活性，显著影响 HSC 活化。然而，还有许多潜在代谢物尚未被充分探索。
Lon 肽酶 1（LONP1）是一种进化上保守的线粒体蛋白酶，具有 ATP 依赖性活性。作为线粒体蛋白降解的核心调节因子，LONP1 可降解线粒体基质中氧化或受损的蛋白。LONP1 还在机体生长、发育和衰老中发挥重要作用，人类 LONP1 基因突变与 CODAS 综合征相关。在肿瘤细胞中，LONP1 影响细胞凋亡、线粒体能量代谢和氧化应激，并可促进肿瘤进展。既往研究显示，LONP1 调控的底物蛋白周转失衡会导致肌肉功能障碍，且由 LONP1 介导的线粒体代谢微环境会影响脂肪细胞身份。然而，线粒体蛋白水解酶以及受调控的线粒体蛋白水解是否与 MASH 诱导的肝纤维化存在机制联系，目前仍不清楚。
我们假设，肝细胞中的 LONP1 通过尚未明确的代谢物介导途径调控 MASH 诱导的肝纤维化。本研究利用肝细胞特异性 Lonp1 敲除小鼠，发现 LONP1 在控制乳清酸（OA）代谢中发挥关键作用。在 MASH 小鼠模型中，肝脏缺失 LONP1 会导致 DHODH 蛋白周转受损和 OA 代谢紊乱，从而增强肝纤维化。相反，肝细胞特异性过表达 LONP1 或使用 DHODH 抑制剂可保护 MASH 小鼠免受肝纤维化影响。机制上，LONP1 可选择性介导 DHODH 周转，从而维持较低水平的 OA；低水平 OA 进一步抑制 ATF3 介导的 HSC 增殖和活化，进而预防肝纤维化。本研究揭示了线粒体蛋白水解调控在塑造 HSC 状态中的重要性，并为肝细胞与 HSC 之间通过线粒体蛋白酶调控 OA 代谢进行串扰提供了新的认识。这些结果提示，LONP1 介导的 DHODH 周转可能是 MASH 诱导肝纤维化的潜在治疗靶点。
02
重要发现及亮点
肝细胞 LONP1 表达在 MASH 患者和小鼠中降低
对 MASH 患者以及喂食西方饮食（WD）28 周小鼠的肝组织进行组织学检查，结果显示明显的肝脂肪变性、炎症和显著肝损伤。在 MASH 患者和小鼠的肝组织中均观察到胶原沉积增加所形成的纤维化区域。α-SMA 免疫组化分析显示 HSC 明显活化，定量逆转录 PCR 检测也发现促纤维化标志物 COL1A1、TGF-β1、TIMP1 和 ACTA2 的 mRNA 水平升高。
线粒体蛋白酶是蛋白质量控制的第一道防线，可通过选择性降解受损线粒体蛋白来维持线粒体功能和正常细胞代谢。与健康对照相比，MASH 患者肝脏中的 LONP1 mRNA 表达显著降低；LONP1 免疫组化染色和免疫印迹进一步证实了这一结果。同样，与对照小鼠相比，WD 喂养小鼠肝组织中的 Lonp1 mRNA 和蛋白水平均显著降低。有趣的是，病例氨酸水解蛋白酶 P（CLPP）在 MASH 患者和小鼠肝脏中也降低，这与既往研究结果一致。
为了进一步探索线粒体蛋白酶与肝纤维化之间的关系，研究者重新分析了来自肝纤维化患者和健康个体的单细胞 RNA 测序数据集，重点评估肝细胞中 LONP1 和 CLPP 的表达。细胞群经重新分类后得到 8 个不同细胞簇。与健康对照相比，纤维化患者肝细胞中的 LONP1 和 CLPP 表达显著降低。既往研究已显示 CLPP 缺失可诱发脂肪性肝炎，并增强高热量饮食诱导的脂肪性肝炎；而 MASH 患者或小鼠肝脏中 LONP1 降低此前尚未被报道。此外，通过单核 RNA 测序、免疫印迹和免疫荧光分析，研究进一步证实 MASH 中肝细胞 LONP1 表达降低。
图 1. MASH 患者和小鼠肝细胞中的 LONP1 表达降低。
(A) 健康对照和 MASH 患者肝组织切片中 Masson、天狼星红和 α-SMA 免疫组化染色代表图。
(B) 普通饮食或西方饮食喂养 28 周小鼠肝组织中 Masson、天狼星红和 α-SMA 免疫组化染色代表图，显示纤维化病灶。
(C) 人和小鼠肝组织中纤维化相关基因表达的 qPCR 分析。
(D、G) 人和小鼠肝组织中 LONP1 表达的 qPCR 分析。
(E、H) 健康对照、MASH 患者以及普通饮食和西方饮食小鼠肝切片中 LONP1 免疫组化染色代表图。
(F、I) 人和小鼠肝组织中 LONP1 蛋白水平的 Western blot 分析。
(J) 单细胞 RNA 测序数据分析显示 LONP1 在不同细胞簇中的表达。
(K) 人肝组织中 LONP1 与肝细胞标志物 HNF4α 的免疫荧光染色。
(L) 从普通饮食和西方饮食小鼠分离的原代肝细胞中 LONP1 的 Western blot 分析。
(M) 小鼠肝组织中 LONP1 与 HNF4α 的免疫荧光染色。数据以均值 ± 标准误表示。
肝细胞特异性 LONP1 缺失可诱导小鼠肝纤维化
研究首先在非 MASH 肝纤维化动物模型中考察 LONP1 下调与肝纤维化的关系。该模型通过连续 8 周腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立。与对照小鼠相比，CCl4 处理小鼠出现显著炎症细胞浸润，血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆汁酸水平升高，提示显著肝损伤。Masson 染色、天狼星红染色、Col1a1 免疫组化和 α-SMA 免疫荧光均显示 CCl4 处理小鼠肝脏胶原沉积和纤维化增加。纤维化相关基因表达也在 CCl4 处理小鼠肝脏中上调，但肝脏 LONP1 蛋白水平没有显著变化。这些结果提示，非 MASH 肝纤维化并不伴随 LONP1 下调。
为评估肝细胞中 LONP1 表达降低是否促进肝纤维化，研究者将 floxed Lonp1 小鼠与 Alb-Cre 转基因小鼠杂交，建立肝细胞特异性 Lonp1 敲除小鼠模型。6 周龄雄性敲除小鼠肝脏中的 LONP1 蛋白显著降低。与野生型同窝对照相比，敲除小鼠体重下降，但肝重/体重比升高。此外，敲除小鼠的空腹血糖、非空腹血糖以及血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平均显著降低。相反，血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆汁酸水平显著升高。
油红 O 染色显示敲除小鼠肝脏中存在大量脂质积累。H&E 染色显示明显肝损伤；Masson 染色、天狼星红染色和 α-SMA 免疫荧光则表明肝细胞特异性 LONP1 缺失与进行性纤维化和 HSC 活化相关。随后，研究者对敲除小鼠和野生型小鼠肝脏 mRNA 进行 RNA 测序分析。以 2 倍变化和显著性阈值为标准，共鉴定出 2,763 个差异表达基因，其中 1,586 个上调，1,177 个下调。基因集富集分析显示，与胶原形成、胶原生物合成和胶原代谢相关的基因在敲除小鼠肝脏中富集。热图显示多种肝纤维化相关基因显著上调，其中 5 个代表性标志物经 qRT-PCR 验证。这些结果共同提示，肝细胞中 LONP1 缺失可促进肝纤维化，而肝纤维化本身并不会诱导 LONP1 下调。
图 2. 肝细胞特异性 LONP1 缺失导致小鼠肝纤维化。
(A) 敲除小鼠构建示意图。
(B) 6 周龄野生型和肝细胞特异性 Lonp1 敲除小鼠肝脏 LONP1 蛋白水平的 Western blot 分析。
(C) 野生型和敲除小鼠血清 ALT、AST 和总胆汁酸水平。
(D) 野生型和敲除小鼠肝组织 H&E 染色代表图。
(E) 野生型和敲除小鼠肝组织天狼星红、Masson 和 α-SMA 染色代表图。
(F) RNA 测序数据火山图，展示敲除小鼠与野生型小鼠肝脏差异表达基因。
(G) 基因集富集分析显示敲除小鼠肝脏中富集的通路。
(H) 差异表达的纤维化相关基因热图。
(I) 肝组织中代表性纤维化相关基因的 qPCR 验证。数据以均值 ± 标准误表示。
肝细胞特异性 LONP1 缺失导致肝脏乳清酸过量生成
为探究 LONP1 缺失促进肝纤维化的代谢机制，研究者对敲除小鼠和野生型小鼠肝样本进行了非靶向代谢组学分析。置换检验显示两组之间存在明显不同的代谢谱，共鉴定出 690 种代谢物。以 1.5 倍变化和显著性阈值为标准，敲除小鼠肝脏中有 195 种代谢物上调，173 种代谢物下调。分析表明，LONP1 缺失广泛影响氨基酸、脂质和碳水化合物代谢。对显著改变代谢物进行 KEGG 通路富集分析发现，其显著富集于中心碳代谢相关通路，包括三羧酸循环、线粒体电子传递链以及精氨酸和脯氨酸代谢。
为了进一步鉴定参与肝纤维化进展的关键代谢物，研究者对敲除小鼠和野生型小鼠肝组织进行了中心碳代谢靶向代谢组学分析。共鉴定出 49 种差异代谢物，其中嘧啶合成和三羧酸循环相关代谢物水平升高，而糖酵解相关代谢物水平降低。在敲除小鼠肝脏中升幅最大的 6 种代谢物中，乳清酸这一嘧啶代谢关键中间体的增加最为明显。此外，敲除小鼠肝组织表现出嘧啶代谢紊乱。与这些结果一致，WD 喂养小鼠的肝脏和血清乳清酸水平均显著升高，提示 LONP1 缺失会导致肝细胞代谢紊乱，其中包括乳清酸代谢的显著改变。
图 3. LONP1 缺失小鼠、MASH 患者和 WD 喂养小鼠中乳清酸水平升高。
(A) 野生型和敲除小鼠肝组织非靶向代谢组学分析的置换检验结果。
(B) 火山图显示野生型与敲除小鼠之间代谢物水平的相对变化。
(C) 非靶向代谢组学中改变代谢物的 KEGG 通路富集分析。
(D) 肝组织靶向代谢组学分析，显示糖酵解、三羧酸循环和嘧啶代谢改变。
(E) 敲除小鼠肝脏中升幅最显著的 6 种代谢物浓度。
(F) 嘧啶和核苷酸代谢相关代谢物定量。
(G) 普通饮食和 WD 喂养小鼠血清乳清酸浓度。
(H) 普通饮食和 WD 喂养小鼠肝脏乳清酸浓度。数据以均值 ± 标准误表示。
LONP1 靶向降解 DHODH 并抑制乳清酸过量生成
研究者进一步通过系统性蛋白质组学分析，探讨 LONP1 对乳清酸代谢的调控作用。在敲除小鼠和野生型小鼠肝组织中共检测到 6,533 种蛋白；以 1.5 倍变化和显著性阈值为标准，共有 1,841 种蛋白差异表达，其中 999 种上调，842 种下调。对上调蛋白进行 KEGG 富集分析发现，嘧啶和核苷酸代谢位列前 20 个富集通路之一，与代谢组学结果一致。热图显示，嘧啶和核苷酸代谢相关蛋白显著改变，其中包括线粒体 DHODH，这是负责乳清酸生物合成的关键酶，并且显著上调。
免疫印迹显示，敲除小鼠肝脏中 DHODH 明显积累，但 Dhodh mRNA 水平无显著变化。随后，研究者将表达 Cre 的腺病毒或对照载体转导至 Lonp1f/f 原代小鼠肝细胞中，发现 Cre 表达细胞中 DHODH 积累，而对照载体组无此现象。通过 HEK293T 细胞中的环己酰亚胺追踪实验，研究者进一步检测 LONP1 调控 DHODH 蛋白稳定性的能力。此外，与对照组相比，过表达 LONP1 的原代小鼠肝细胞中 DHODH 蛋白水平降低。这些结果提示，DHODH 可能是 LONP1 降解的底物。
随后，研究者通过一系列共免疫沉淀实验评估 LONP1 与 DHODH 的相互作用。首先，将 Flag-LONP1 和 HA-DHODH 表达载体共同转染至 HEK293T 细胞后，使用抗 HA 抗体可共沉淀 LONP1；以 LONP1 作为免疫沉淀靶标时，也可反向拉下 DHODH。其次，肝组织中的共免疫沉淀实验显示 LONP1 与 DHODH 存在物理相互作用。第三，GST pull-down 实验证实纯化的 LONP1 与 DHODH 蛋白可直接相互作用。此外，原代小鼠肝细胞免疫荧光标记显示 LONP1 与 DHODH 在线粒体中共定位。这些结果提示，LONP1 可直接与 DHODH 相互作用。
为确定 LONP1 中负责结合 DHODH 的结构域，研究者分别表达 LONP1 的 N 端结构域、ATPase 结构域和蛋白水解结构域。结果显示，LONP1 的 N 端结构域和蛋白水解结构域均可与 DHODH 强烈相互作用，而 ATPase 结构域不能。进一步的肽酶和蛋白酶实验中，重组 LONP1 与 DHODH 蛋白在有或无 ATP 以及不同 ATP 浓度下共同孵育。结果显示，在存在 LONP1 的情况下，DHODH 蛋白水平随 ATP 浓度升高而降低，提示 DHODH 可被 LONP1 以 ATP 依赖方式直接降解。
图 4. DHODH 是 LONP1 的底物，并可被 LONP1 降解。
(A) 蛋白质组学分析实验设计示意图。
(B) KEGG 分析显示 LONP1 缺失肝脏中上调蛋白富集的前 20 条通路。
(C) 热图显示 KEGG 富集分析中核酸代谢通路内差异表达蛋白。
(D) 指定基因型小鼠肝组织中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析。
(E) 指定基因型小鼠肝组织中 Dhodh mRNA 水平。
(F) HEK293T 细胞经环己酰亚胺处理后 DHODH 蛋白稳定性检测。
(G) HEK293T 细胞中 LONP1 与 DHODH 相互作用的共免疫沉淀实验。
(H) 小鼠肝组织中 LONP1 与 DHODH 相互作用的共免疫沉淀验证。
(I) GST pull-down 实验证明纯化重组 LONP1 与 DHODH 蛋白直接相互作用。
(J) 原代小鼠肝细胞经 MG132 处理后，LONP1 与 DHODH 共定位的免疫荧光图像。
(K) 体外蛋白酶实验：重组 DHODH 与不同量 LONP1 在有或无 ATP 条件下孵育，并通过免疫印迹分析 DHODH 降解。
(L) DHODH 与 LONP1 在不同 ATP 浓度下孵育，以评估蛋白水解的 ATP 依赖性。数据以均值 ± 标准误表示。
乳清酸促进 HSC 活化和增殖
为评估敲除小鼠中升高的代谢物对肝纤维化的潜在影响，研究者使用不同浓度的乳清酸、甘油酸、顺乌头酸、柠檬酸、吲哚乙酸和氧代己二酸处理人 LX-2 细胞。有趣的是，乳清酸可剂量依赖性地刺激 HSC 增殖，而其他 5 种代谢物无此作用；Cy5 标记的乳清酸也可被原代 HSC 摄取。α-SMA 免疫荧光分析显示，乳清酸可有效激活小鼠原代 HSC 和 LX-2 细胞，并且两种细胞中 α-SMA 水平均在乳清酸刺激后显著升高。研究还发现，乳清酸可增强 LX-2 细胞对 TGF-β1 刺激的反应。这些数据提示，乳清酸可促进 HSC 增殖和活化。
为了探究肝细胞来源乳清酸是否通过肝细胞-HSC 串扰形成促纤维化微环境，研究者首先检测了 LONP1 缺失原代小鼠肝细胞对原代 HSC 的影响。研究者从 Lonp1f/f 小鼠原代肝细胞中制备条件培养基，这些肝细胞分别经 Ad-Vector 或 Ad-Cre 处理，再将小鼠原代 HSC 暴露于这些条件培养基中。质谱分析显示，Ad-Cre 组条件培养基中的乳清酸水平高于 Ad-Vector 组。此外，CM-Ad-Cre 组 HSC 的增殖能力及 HSC 活化标志物 COL1A1、ACTA2 和 TIMP1 表达均更高。α-SMA 免疫荧光和免疫印迹显示，CM-Ad-Cre 组中 HSC 向 α-SMA 阳性肌成纤维细胞分化增强。使用 Lonp1-/- 肝细胞与原代 HSC 共培养体系进一步证实了这些发现。
图 5. 乳清酸促进 HSC 活化和增殖。
(A) CCK8 实验评估 LX-2 细胞经乳清酸处理 48 小时后的活力。
(B) EdU 染色显示小鼠原代 HSC 经不同浓度乳清酸处理 48 小时后的 DNA 复制情况。
(C、D) 小鼠原代 HSC 经乳清酸处理 24 小时后，通过免疫荧光和 Western blot 检测 α-SMA 表达。
(E、F) LX-2 细胞经乳清酸处理 24 小时后，通过免疫荧光和 Western blot 检测 α-SMA 表达。
(G) 条件培养基实验示意图：收集 Ad-Vector 或 Ad-Cre 感染肝细胞的条件培养基，并用于处理小鼠原代 HSC。
(H) 不同条件培养基中的乳清酸浓度。
(I) EdU 染色评估条件培养基处理后小鼠原代 HSC 的增殖能力。
(J–L) 小鼠原代 HSC 经条件培养基处理 24 小时后，检测 Col1a1、Acta2 和 Timp1 mRNA 水平，以及 α-SMA 蛋白水平。
(M) 共培养系统示意图。
(N、O) α-SMA 免疫荧光和 Western blot 结果。数据以均值 ± 标准误表示。
乳清酸促进肝纤维化依赖 ATF3
研究者建立肝脂肪变性和纤维化小鼠模型，以研究乳清酸对 MASH 诱导肝纤维化的体内作用。小鼠接受 12 周高脂饮食并联合 2 周 CCl4 处理，最后 2 周添加或不添加 5% 乳清酸。肝切片 H&E 染色确认高脂饮食小鼠出现明显脂肪变性和炎症。Ki67 与 Desmin 共染色显示，与对照小鼠相比，乳清酸处理小鼠肝组织中增殖性 HSC 更丰富。免疫荧光和天狼星红染色显示，乳清酸诱导的 MASH 小鼠中 α-SMA 表达增加，提示纤维化更严重。此外，乳清酸处理小鼠肝脏中促纤维化基因表达显著上调。总体而言，这些结果表明，乳清酸补充会加重高脂饮食小鼠的肝纤维化。
为阐明乳清酸调控 HSC 增殖和活化的分子机制，研究者对接受 HFD/CCl4 处理且有或无 5% 乳清酸补充的小鼠肝组织进行了 RNA 测序分析。以 1.5 倍变化和显著性阈值为标准，共鉴定出 701 个差异表达基因，其中 288 个上调，413 个下调。乳清酸处理显著增加了与细胞基质黏附相关基因的表达。在上调的转录因子中，ATF3 被鉴定出来；ATF3 已被报道可促进纤维化相关基因表达，这与本研究结果一致。此外，乳清酸和 CM-Cre 均可增加 ATF3 的核定位，但不影响其 mRNA 水平；荧光素酶报告实验显示，乳清酸处理可增强 ATF3 的转录活性。研究者随后利用既有 CUT&Tag 数据鉴定 ATF3 调控的纤维化相关基因，包括 ACTA2、COL6A1、TIMP1 和 COL1A1，提示 ATF3 可协调这些基因的表达。染色质免疫沉淀结合 qRT-PCR 进一步显示，与非特异性 IgG 抗体相比，抗 ATF3 抗体对上述 4 个基因启动子片段具有显著更高的结合能力。
随后，研究者通过 leti-shAtf3 敲低原代小鼠 HSC 中的 ATF3，考察 ATF3 在乳清酸诱导 HSC 活化中的作用。ATF3 敲低可消除乳清酸诱导的纤维化相关基因表达效应。α-SMA 免疫荧光显示，ATF3 敲低也可抑制乳清酸和 CM-Ad-Cre 对原代小鼠 HSC 的促纤维化作用。这些发现表明，乳清酸诱导的 HSC 活化依赖转录因子 ATF3。
图 6. 乳清酸以 ATF3 依赖方式促进 HSC 活化。
(A) 原代 HSC 经乳清酸处理 24 小时后 ATF3 的免疫荧光染色。
(B) 原代 HSC 经乳清酸或条件培养基处理 24 小时后 Atf3 mRNA 表达。
(C) 将 Atf3 启动子荧光素酶报告载体转染 HEK293T 细胞后，乳清酸处理 24 小时并检测荧光素酶活性。
(D) ACTA2 和 COL6A1 位点可视化结果，显示 ATF3 协调纤维化基因表达。
(E) ChIP-qPCR 分析 ATF3 和 IgG 在 Acta2、Col6a1、Timp1 和 Col1a1 启动子片段上的占据情况。
(F) 不同处理组原代 HSC 中 Atf3 mRNA 水平。
(G) 不同处理组原代 HSC 中纤维化相关基因 Acta2、Col1a1、Col6a1 和 Timp1 的 mRNA 水平。
(H) 原代 HSC 经慢病毒感染 24 小时后，再接受乳清酸或条件培养基处理 24 小时，通过免疫荧光评估 α-SMA 表达。数据以均值 ± 标准误表示。
肝细胞特异性 LONP1 消融加重小鼠 MASH 诱导的肝纤维化
研究者进一步考察肝脏中 LONP1 耗竭是否会加重 MASH 诱导的纤维化。首先，在 CKO 小鼠和野生型小鼠中通过 16 周高脂饮食诱导脂肪性肝炎。在 LONP1 耗竭的 CKO 小鼠肝脏中，DHODH 蛋白水平略有增加；质谱分析显示，这些小鼠血浆和肝脏中的乳清酸水平均显著升高。共免疫染色同样显示 HSC 增殖和活化增加。qRT-PCR 显示 CKO 小鼠肝脏中 Atf3 mRNA 水平和纤维化基因表达上调。Masson 和天狼星红染色显示 CKO 小鼠肝脏胶原沉积增加。
为了评估出生后肝脏 LONP1 耗竭是否促进 MASH 诱导的肝纤维化，研究者在高脂饮食喂养的 Lonp1fl/fl 小鼠中，通过腺相关病毒 8 介导的 TBG-Cre 递送诱导急性 LONP1 删除。与注射 AAV8-TBG-GFP 的 Lonp1fl/fl 小鼠相比，AAV8-TBG-Cre 小鼠的 LONP1 蛋白水平显著降低，导致 DHODH 水平升高，并伴随肝组织和血清乳清酸水平显著升高。出生后 Lonp1 消融还导致 HSC 增殖和活化增加，但不影响 Atf3 mRNA 水平。此外，qRT-PCR 显示 Lonp1 消融显著增加纤维化相关基因 mRNA 水平。Masson 和天狼星红染色进一步证明，Lonp1 消融增加 MASH 小鼠肝脏胶原沉积。因此，出生后肝脏 LONP1 缺失可促进 MASH 诱导的肝纤维化。
抑制肝脏乳清酸过量生成可改善小鼠 MASH 诱导的肝纤维化
研究者通过向高脂/高果糖饮食喂养小鼠静脉注射肝细胞特异性表达 LONP1 的 AAV8-TBG 或对照 AAV8-TBG-GFP，检验 LONP1 过表达是否可通过降解 DHODH 并抑制肝脏乳清酸过量生成，从而保护小鼠免受 MASH 背景下肝纤维化影响。免疫印迹显示，LONP1 过表达后 DHODH 水平显著降低，并伴随肝组织和血清乳清酸水平均明显下降。共免疫染色显示，LONP1 过表达抑制 HSC 增殖和活化，同时纤维化基因 mRNA 水平显著下降，但 Atf3 mRNA 水平无变化。与注射 AAV-GFP 的小鼠相比，LONP1 过表达的高脂/高果糖饮食小鼠胶原沉积显著减轻。这些结果提示，AAV 介导的肝细胞 LONP1 过表达可保护小鼠免受高脂/高果糖饮食诱导的肝纤维化。
基于上述发现，研究者进一步探索肝纤维化治疗的潜在策略，检测已知 LONP1 激活剂 84-B10 在蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的肝纤维化小鼠模型中的作用。小鼠接受蛋氨酸-胆碱缺乏饮食 5 周，并在连续 4 周内隔日腹腔注射 84-B10。结果显示，84-B10 可增加 LONP1 水平，并降低 DHODH 和血清乳清酸水平。84-B10 还减少 HSC 增殖和活化，并降低该饮食诱导的肝纤维化，而不影响 Atf3 mRNA 水平。由于 WD 模型更接近人类 MASH 的代谢特征，研究者进一步评估 84-B10 对 WD 诱导肝纤维化的抗纤维化作用。84-B10 处理显著减轻肝纤维化，同时伴随肝脏 LONP1 表达增加以及 DHODH 表达和乳清酸水平降低。这些发现表明，84-B10 具有缓解小鼠 MASH 诱导肝纤维化的治疗潜力。
为了研究 DHODH 抑制是否通过降低乳清酸水平缓解 MASH 诱导的肝纤维化，研究者使用强效 DHODH 抑制剂 brequinar（BRQ）处理 MASH 小鼠。小鼠接受 28 周高脂饮食，并在最后 4 周隔日腹腔注射 BRQ。组织学分析显示，BRQ 对肝脏脂质积累或肝细胞气球样变无显著影响，但血清和肝组织中的乳清酸水平均显著低于对照组。免疫荧光研究显示，BRQ 给药抑制 HSC 增殖和活化，减少胶原沉积，并改善纤维化。免疫印迹和 qRT-PCR 均显示，BRQ 处理小鼠中纤维化相关蛋白和基因表达显著降低。这些发现表明，BRQ 可通过降低乳清酸水平有效缓解高脂饮食诱导的 MASH 肝纤维化。
研究者进一步在人类样本中考察 LONP1 调控乳清酸代谢并减轻 MASH 诱导肝纤维化的作用。对 78 例患者肝样本的分析显示，LONP1 mRNA 表达与关键纤维化相关基因 ACTA2、COL1A1 和 TIMP1 呈显著负相关。Lonp1 mRNA 水平还与 NAFLD 活动度评分和纤维化评分呈负相关。纤维化更严重的患者表现出更低的肝脏 LONP1 表达和更高的 DHODH 表达。肝脏和血清乳清酸水平在 MASL 患者中相对不变，但在 MASH 和 MASH 纤维化患者中明显升高。血清乳清酸水平与纤维化相关基因表达和纤维化评分呈显著正相关。值得注意的是，肝脏乳清酸水平也与纤维化基因表达和纤维化评分呈正相关。综上，这些发现提示 LONP1 是乳清酸代谢的负调控因子，抑制肝脏乳清酸过量生成可改善 MASH 诱导的肝纤维化。
图 7. LONP1-DHODH-乳清酸轴调控小鼠 MASH 诱导的肝纤维化。
(A) 实验设计示意图：5 周龄雄性 Lonp1f/f 小鼠接受 28 周高脂饮食诱导肝纤维化，并在最后 10 周注射 AAV-Gfp 或 AAV-Cre。
(B) 指定小鼠肝组织中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析和定量。
(C) 血清和肝组织中乳清酸浓度。
(D) Ki67 和 Desmin 免疫荧光染色，用于评估 HSC 增殖。
(E) α-SMA 免疫荧光染色，用于评估 HSC 活化。
(F) 指定组别肝组织中 Atf3 mRNA 表达水平。
(G) 指定小鼠肝组织中纤维化相关基因的 qPCR 分析。
(H) 天狼星红染色代表图，显示肝纤维化严重程度。
(I) 实验设计示意图：5 周龄雄性 C57BL/6 小鼠接受 28 周高脂/高果糖饮食诱导 MASH 肝纤维化，并在最后 10 周注射 AAV-Gfp 或 AAV-TBG-Lonp1。
(J) 肝组织中 LONP1 和 DHODH 蛋白水平的 Western blot 分析和定量。
(K) 血清和肝组织中乳清酸浓度。
(L) Ki67、Desmin 和 DAPI 免疫荧光染色，用于评估 HSC 增殖。
(M) α-SMA 和 DAPI 免疫荧光染色，用于评估 HSC 活化。
(N) 指定组别肝组织中 Atf3 mRNA 水平。
(O) 指定小鼠肝组织中纤维化相关基因的 qPCR 分析。
(P) 天狼星红染色代表图，显示肝纤维化严重程度。数据以均值 ± 标准误表示。
图 8. LONP1-DHODH-乳清酸轴与人类 MASH 诱导的肝纤维化相关。
(A、B) 肝组织样本中 LONP1 基因表达与纤维化相关基因、NAFLD 活动度评分和纤维化评分之间的相关性分析。
(C、D) 正常个体以及 MASL、MASH 或 MASH 纤维化患者肝组织中 LONP1 和 DHODH 免疫组化、H&E 染色和天狼星红染色代表图及定量。
(E) LONP1 与 DHODH 蛋白水平之间的相关性分析。
(F) 指定组别肝组织中 LONP1 和 DHODH 的 Western blot 分析。
(G) 指定患者血清和肝组织中乳清酸浓度。
(H、I) 血清乳清酸水平与纤维化相关基因表达、NAFLD 活动度评分和纤维化评分之间的相关性。
(J、K) 肝脏乳清酸水平与纤维化相关基因表达、NAFLD 活动度评分和纤维化评分之间的相关性。数据以均值 ± 标准误表示。
【Citation】:Xu D, Zhang Z, Zhu Z, Wei W, Bai Y, Wang W, et al. Decreased LONP1 expression exacerbates MASH-induced liver fibrosis via elevated orotic acid levels.Journal of Hepatology.2026;84:165–180.
【贡献】★★★★★
综上，本研究将乳清酸代谢确定为 MASH 中一个有前景的代谢靶点，并揭示了乳清酸过量生成通过细胞间信号传导驱动肝纤维化的新机制。靶向调控乳清酸或肝细胞 LONP1，可能成为预防 MASH 诱导肝纤维化的新型治疗策略。进一步探索 LONP1 如何将蛋白水解监控与乳清酸代谢联系起来，可能为理解 MASH 诱导肝纤维化的发病机制提供新的见解。
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