姜是多年生草本植物，作为香料和药物被世界各地广泛消费。姜的药用价值主要来源于其具有的生物活性物质，特别是姜酚及其脱水产物姜烯酚。6-姜烯酚（6S）是姜中的主要活性成分，具有抗炎、抗癌、抗氧化、改善阿尔茨海默症、改善肥胖等药理作用。但是6S溶解性差、生物利用度低，在体内会被快速吸收和消除，限制其在功能食品领域的应用。利用食品级基材构建的纳米颗粒作为活性物质的输送载体具有诸多优势而被广泛关注。蛋白质因其独特的结构和功能特性可以用作制备纳米颗粒。
河北农业大学食品科技学院的高就、 吴俊杰、王向红* 等用反溶剂法制备负载6S的玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠纳米颗粒（ZCP-6S），对颗粒进行表征，利用体外模拟消化、Caco-2细胞模型和大鼠药代动力学研究颗粒的生物可及性、细胞吸收和口服生物利用度，以期为疏水活性物质的输送及拓宽纳米颗粒的应用提供一定的理论依据。
01
粒径、电位和PDI
有研究表明，SC与玉米醇溶蛋白质量比为2∶1时纳米颗粒具有较小的粒径及较高的细胞摄取率，因此本实验选择二者的比例为2∶1。颗粒大小是生物聚合物输送载体的一个关键特性，粒径越小其稳定性越强。由表1 可知，所有配方的颗粒粒径范围为（147.23±3.09）～（167.67±1.72）nm，与玉米醇溶蛋白纳米颗粒的典型粒径（100～400 nm）一致。所有配方纳米颗粒的PDI均小于0.15，表明粒径分布均匀。Zeta电位代表纳米颗粒的表面电荷，可以间接衡量颗粒溶液的稳定性，电位的绝对值越大颗粒溶液则越稳定。所有配方的纳米颗粒电位均为负值，表明玉米醇溶蛋白和SC之间存在静电吸引，带负电荷的SC包裹在带正电荷的玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面使ZCP-6S带负电荷，Li Duoduo等报道了类似的结果。本研究所有配方纳米颗粒的Zeta电位均在（-42.13±0.21）～（-23.80±0.31）mV之间，表明 其稳定性较好。
02
包埋率和固载率
包埋率和固载率是纳米颗粒作为药物或者营养物质运输载体的重要指标。如图1所示，纳米颗粒包埋率随6S比例增加呈先增后减的趋势，在玉米醇溶蛋白和6S质量比为2.5∶1时包埋率最高，为（83.08±5.81）%，当6S含量继续增大时包埋率有所降低，说明6S的添加量超出了纳米颗粒的包埋能力。而玉米醇溶蛋白比例越小，固载率就会越大，当玉米醇溶蛋白和6S质量比为2.5∶1时的固载率为（28.90±2.02）%。在其他封装不同活性物质的递送体系中也观察到类似结果。根据以上结果，选择玉米醇溶蛋白和6S质量比2.5∶1进行后续实验，在该比例条件下，纳米颗粒的粒径较小、固载率较高、包埋率最高。
03
TEM观察结果
如图2所示，纳米颗粒呈球形，大部分粒子直径在100～150 nm之间，也存在一些较小的颗粒。TEM观察到的粒径略小于纳米粒度仪测得的粒径（表1）。在一项关于果胶稳定玉米醇溶蛋白纳米颗粒的研究中也出现了类似的结果，这可能是由测试条件和原理差异引起，纳米粒度仪测量的是水合粒径，电镜观察的是干燥且去除水分后的颗粒粒径。
04
FT-IR分析结果
如图3所示，Z-SC1∶2的红外光谱在3 309、1 667 cm-1和1 535 cm-1处显示出典型的吸收峰，分别与O—H伸缩振动、酰胺I带和酰胺II带有关。酰胺I带由肽键中羰基伸缩振动造成，因为玉米醇溶蛋白具有α-螺旋结构。在形成纳米颗粒后，这些特征峰移动到了3 302、1 658 cm-1和1 532 cm-1处，说明玉米醇溶蛋白、SC、6S之间存在氢键和静电相互作用。在6S图谱中1 674 cm-1处产生的峰也是由羰基的伸缩振动产生。此外，6S、Z-SC1∶2、ZCP-6S分别在2 927、2 961 cm-1和2 958 cm-1处均存在C—H键的拉伸倾斜吸收峰。在800～1 600 cm-1之间有许多6S的连续特征吸收峰，对应6S结构中的苯环和—OH。然而，许多特征峰在形成纳米颗粒后都消失，如1 516、1 455 cm-1和1 274 cm-1处的特征峰，表明6S与蛋白质之间形成氢键或发生疏水相互作用，限制了其化学键的伸缩振动。综上可知，6S不是吸附在颗粒表面，而是通过非共价键相互作用力包封在纳米颗粒中。
05
生物可及性
生物可及性是物质在消化过程中从食物基质中释放出来可以被小肠吸收的部分占摄入总量的比值。如图4所示，6S封装在纳米颗粒中后，其生物可及性从（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。6S在水中溶解性较差，在消化液中聚集沉淀，限制了胶束化的形成，导致生物可及性较低，而纳米颗粒能很好地溶解在消化液中。并且玉米醇溶蛋白在消化后被分解为两亲性多肽，与6S自组装形成胶束，有利于6S的溶解，进而提高了6S的生物可及性，此结果与Li Duoduo等的研究结果一致。而利用pH值驱动法制备的玉米醇溶蛋白纳米颗粒中姜黄素的释放率在90%以上。造成这些结果不同的原因，除了涂层材料的特性不同外，还与体外消化模型和纳米颗粒制备方法的差异有关。
06
细胞毒性实验结果
如图5所示，ZCP在6S不同质量浓度下均没有表现出细胞毒性，细胞存活率均大于80%，表明载体材料本身生物相容性良好。在2.5～10 μg/mL范围内，游离6S和ZCP-6S的细胞存活率均高于80%，表明在这些浓度下两者都表现出无细胞毒性。但是当6S的质量浓度增加到20 μg/mL时，ZCP-6S的细胞存活率降为（66.49±2.33）%。因此选择6S质量浓度为10 μg/mL进行后续实验。研究表明6S能够显著抑制结肠癌细胞Caco-2和HCT116的迁移和增殖，并促进细胞凋亡。ZCP-6S的细胞毒性作用增加，可能是由于纳米颗粒使6S能更好地被Caco-2细胞摄取。Xue Jinli等的研究中也出现了类似现象，与游离姜黄素相比，姜黄素纳米颗粒对Caco-2细胞具有更强的抑制增殖作用，被包埋的姜黄素通过内吞作用的细胞内化可能是纳米颗粒细胞毒性增加的原因。
07
细胞摄取实验结果
如图6所示，6S的摄取量随时间的延长而增加，并且ZCP-6S的摄取量在每一个时间点都显著高于游离的6S。处理4 h后，ZCP-6S的摄取量为（0.89±0.09）μg/mg，6S的摄取量为（0.53±0.04）μg/mg，细胞摄取量增加了（0.36±0.06）μg/mg，这表明包封在纳米颗粒中的6S能更有效地被Caco-2细胞吸收。纳米颗粒的摄取量取决于颗粒的粒径、电荷和界面特性等性质，粒径在100～200 nm之间的纳米颗粒具有最佳的Caco-2细胞摄取特性。有研究表明，玉米醇溶蛋白中的某些肽可以通过激活肠上皮细胞的摄取机制提高Caco-2细胞对血红素铁的摄取。而SC吸附在玉米醇溶蛋白纳米颗粒的表面可以降低界面张力，从而改善玉米醇溶蛋白纳米颗粒与细胞膜之间的相互作用。
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细胞转运实验结果
用Caco-2细胞单层模型模拟人小肠上皮细胞的吸收情况。电阻是评价细胞转运模型是否构建成功的重要指标。如图7所示，本实验建立的Caco-2细胞单层模型在培养21 d后电阻达到475 Ω·cm2，说明模型完整性较好，可以进行细胞转运实验。从图8可以看出，ZCP-6S在4 h内的跨膜转运能力显著优于6S，二者的跨膜转运量均表现出时间依赖性。在4 h时，6S的跨膜转运量为（1.20±0.09）μg/mL，ZCP-6S的跨膜转运量达到（2.26±0.04）μg/mL，增加了（1.06±0.06）μg/mL。这一结果表明，使用纳米颗粒作为载体可以提高6S在肠道的吸收。这是由于6S溶解度较低，限制了6S在Caco-2细胞中的吸收和转运，而包封于纳米颗粒中6S的溶解度有所提升。此外，纳米颗粒较小的粒径也有利于促进细胞的吸收和转运。ZCP-6S的细胞摄取量和跨膜转运能力均高于6S，这也解释了其对Caco-2细胞具有更强的抑制作用。
09
药代动力学分析
血药质量浓度-时间曲线如图9所示，主要的药代动力学参数见表2。二者的血药质量浓度均呈现先上升后下降的趋势，最终趋近于0 μg/mL。与6S相比，ZCP-6S的主要药代动力学参数得到显著改善。ZCP-6S的药峰质量浓度（ρmax）为（4.94±0.49）μg/mL，是6S ρmax的2 倍。与6S相比，ZCP-6S的AUC提高了2.28 倍，说明ZCP-6S的口服生物利用度显著提高。ZCP-6S的半衰期（T1/2）和平均驻留时间（MRT）分别是6S的1.71 倍和1.55 倍，表明纳米颗粒可以起到缓释作用，降低了6S在体内的消除速度。研究表明，玉米醇溶蛋白纳米颗粒可以改善二氢杨梅素在胃肠道中的黏附性，并使其在大鼠体内的口服生物利用度提高了1.95 倍。玉米醇溶蛋白纳米颗粒本身具有黏附性，其外层稳定剂如SC、壳聚糖可进一步增强其黏附性，使其能够更好地吸附在肠上皮细胞上。这种吸附作用可以延长6S在体内的停留时间，从而增加其在体内的积累量。综上，纳米颗粒可以有效地提高6S的口服生物利用度。
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结论
通过反溶剂法成功制备了ZCP-6S，颗粒为球形，分布均匀，在6S、玉米醇溶蛋白、SC质量比为1∶2.5∶5条件下其包埋率和固载率最高，为（83.08±5.81）%和（28.90±2.02）%。氢键、静电和疏水相互作用是形成纳米颗粒的主要驱动力。体外模拟消化结果表明，纳米颗粒提高了6S在模拟胃肠液中的溶解度，使其生物可及性从（36.31±5.82）%提高至（75.34±9.82）%。纳米颗粒包埋的6S与游离的6S相比，更容易被Caco-2细胞吸收，4 h内通过Caco-2细胞单层模型的质量浓度也由（1.20±0.09）μg/mL增加至（2.26±0.04）μg/mL。口服给药后，6S的AUC提高了2.28 倍，T 1/2 为原来的1.71 倍。综上，玉米醇溶蛋白基纳米颗粒可以作为6S有效的输送载体，提高其生物利用度，本实验可为更好地发挥6S功能活性提供新思路。
本文《6-姜烯酚玉米醇溶蛋白纳米颗粒的构建及其生物利用度分析》来源于《食品科学》2023年45卷第9期44-50页，作者：高 就，吴俊杰，焦文雅，陈宇洋，祝文轩，桑亚新，王向红*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230906-050。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：天津商业大学 梁雯菁，责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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