黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.，LRM）是一种茄科多年生刺灌木，广泛地分布在中国西北部，果实被称为黑枸杞。黑枸杞是我国传统的药食同源滋补食物，具有多种生物活性。多糖的生物活性取决于其主要结构和链构象，据已有报道，黑果枸杞多糖（LRMP）为高度分支的α(1→3)键连接的β-半乳糖基，具有不同的分支链取代基，在β(1→6)-半乳糖的侧链中，末端阿拉伯糖残基数量增加的同时半乳糖残基减少，表明阿拉伯糖残基附着在半乳糖的O-3位置，但是LRMP溶解液的高分子链构象尚未明晰。

近年来，胃黏膜损伤导致的胃部疾病频发，这与不恰当的生活方式有关。胃黏膜上皮细胞（GES-1）顶端与相邻细胞侧膜紧密连接形成抵挡胃酸的黏膜屏障，组成维持消化道健康的重要一环。

南京工业大学食品与轻工学院的钱荣、安佳鑫、续晓琪*等采用从市售的黑枸杞中分离纯化了一种水溶性多糖LRMP，分析其单糖组成、糖苷键的连接方式、分子质量和链构象等结构参数，在此基础上，利用GES-1细胞模型评估该多糖对乙醇诱导的细胞损伤的影响，并通过氧化损伤和线粒体染色的结果探究其作用机理，旨在为LRMP作为功能性多糖在健康食品中开发提供理论基础。

1 LRMP的一级结构

通过热水提取和色谱柱纯化，LRMP的产率相对于干质量果实为（5.16±0.82）%，LRMP样品纯度较高，其中总糖相对含量为（88.60±1.97）%，蛋白质相对含量为（2.31±0.36）%；如表1所示，LRMP主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、岩藻糖和半乳糖醛酸6 种单糖组成。

LRMP的傅里叶变换红外光谱（FTIR）如图1所示，3 450 cm-1和2 935 cm-1处的吸收峰分别是由O—H和C—H拉伸振动引起。1 620 cm-1和1 418 cm-1处的吸收峰分别由COO—基团的不对称和对称拉伸振动引起。1 330 cm-1处的吸收峰由O—H变形振动引起。在1 090 cm-1和995 cm-1处的吸收峰表明LRMP结构中的糖环存在吡喃糖。根据单糖组成的结果，半乳糖是LRMP的主要单糖组分，其次是阿拉伯糖和葡萄糖。

甲基化反应后进行GC-MS分析是解析多糖结构的有效方法，结合图1，获得多种糖残基的物质的量占比（表2），结果表明LRMP是具有许多单糖分支点的多糖，残基的连接方式共有12 种。阿拉伯糖残基类型包括末端阿拉伯呋喃糖和(1→5)-阿拉伯呋喃糖；葡萄糖残基包括末端葡萄糖和(1→4)-葡萄糖；木糖残基类型包括末端木糖和(1→4)-木糖；半乳糖残基包括末端半乳糖、(1→3)-半乳糖、(1→4)-半乳糖、(1→6)-半乳糖和(1→3,6)-半乳糖。其中，最主要的糖苷键末端单元为阿拉伯呋喃糖-(1→，物质的量占比为19.82%；其他糖苷键末端单元为半乳糖-(1→、葡萄糖-(1→和木糖-(1→，物质的量占比分别为4.44%、3.51%和2.69%；最主要的糖苷键分支单元为在3号位取代的→3,6)-半乳糖-(1→和→3)-半乳糖-(1→糖苷键，物质的量占比分别为14.1%和7.51%；其余未取代的残基为→4)-葡萄糖-(1→、→4)-木糖-(1→、→5)-阿拉伯呋喃糖-(1→、→3)-半乳糖-(1→和→6)-半乳糖-(1→，物质的量占比分别为14.48%、11.41%、8.04%、7.51%和5.63%。这表明LRMP的主链可能由(1→3)-半乳糖或(1→6)-半乳糖构成，与Lv Xiaopeng等分离纯化得到的LRP4-A结果大致相似。

2 LRMP分子质量及链构象分析

从图2A可知，LRMP的HPSEC图峰形单一且分布对称，多分散性指数（ mw/mn ）为1.30，接近1，说明LRMP的平均分子质量分布较均一。LRMP的m w 为（1 589.0±21.9）kDa，R g 为（80.4±1.0）nm，[η]和R h 分别为（1 437.34±2.73）mL/g和（83.49±0.50）nm（表3）。

由图2B、C可知溶液中的链构象参数。构象参数αs为的指数值，αs＝0.33时，高分子链在溶液中为球状链；当αs＝0.5～0.6时，高分子链为柔性链；当αs＝1时，高分子链在溶液中呈刚性链。马克-霍温克方程的指数αη也可表征多糖构象，αη＝0.22时，高分子链在溶液中为球状链；当αη＝0.5～0.8时，高分子链为柔性链；当αη＝1～2时，高分子链在溶液中呈刚性链。高聚物的结构参数ρ（ρ＝Rg/Rh）是高聚物在溶液中的特性参数，当ρ＝0.78时，高分子链在溶液中为球状链；当ρ＝1时，高分子链在溶液中呈半刚性链；当ρ＝2时，高分子链在溶液中呈刚性链。图2B的αs（0.578）和图2C的αη（0.968 9）表明LRMP在0.15 mol/L NaCl溶液（pH 7.4）中以柔性链或半刚性链形式存在，ρ为0.96表明LRMP呈线性无规卷曲，和αs、αη的结果相符。周声怡的研究表明，碱提枸杞多糖在溶液中多呈现柔性链构象，而酸提或热水提枸杞多糖在溶液中会有刚性链构象，这可能是高温释放更多的阿拉伯糖与半乳糖，多糖链结构变短造成。

3 GES-1细胞模型

3.1 乙醇损伤GES-1模型条件

LRMP对GES-1细胞的毒性如图3A所示。当孵育12、24 h和48 h后，细胞活性均保持在100%左右，与猴头菇多糖和铁皮石斛叶多糖处理后的细胞活性相比，无明显细胞毒性。

如图3B所示，GES-1的细胞损伤率随着乙醇体积分数的增加而增大，当乙醇体积分数为5%时，细胞损伤率为（50.00±5.32）%。在显微镜下观察GES-1的细胞形态，相比正常GES-1（图3C），乙醇损伤后GES-1变圆（图3D）。因此，采用体积分数5%乙醇溶液为后续实验构建损伤模型。

如图4A所示，经5%乙醇损伤的GES-1细胞活性显著下降，但当使用200、400、600 μg/mL LRMP进行预孵育后再建模，细胞活性分别为（63.4±3.2）%、（78.2±3.9）%和（86.4±4.3）%，相较模型组分别提高了13.4%、28.2%和36.4%，表明用LRMP预处理可以保护乙醇诱导的细胞损伤，显著提高细胞存活率。

SOD具有抗氧化活性，能清除活性氧（ROS）。如图4B所示，与模型组相比，提前孵育LRMP后再进行乙醇损伤，GES-1中总SOD活力显著提高，样品质量浓度为600 μg/mL时，SOD活力与对照组无显著差异。这表明LRMP处理后的细胞在乙醇损伤时，具有更强的抗氧化能力，低水平的ROS更有利于细胞增殖。结果表明，LRMP可以抑制乙醇对细胞的氧化损伤，增强乙醇损伤后细胞清除自由基的能力，具有保护胃黏膜损伤的潜力。

3.2 AO/EB荧光染色结果

乙醇摄入可能影响细胞的许多功能，本研究中的细胞模型表明，乙醇可以破坏GES-1的细胞膜，导致细胞膜通透性异常，最终导致细胞凋亡。AO可以穿透活细胞完整的细胞膜并对细胞进行染色，产生绿色荧光；当细胞坏死时，AO和EB在细胞中结合，导致橙红色核染色质和椭圆形细胞，红色荧光比例的增加代表更多的细胞凋亡。如图5A所示，与对照组相比，模型组的红色荧光数量增加，红绿荧光比显著提高到1.13±0.05，远高于对照组（0.66±0.03）（图5B），这表明更多的GES-1在乙醇损伤后出现非自然凋亡。在预先用LRMP样品孵育的GES-1实验组中，红绿荧光比分别为0.65±0.03、0.73±0.03、0.59±0.03，红色荧光的分布和强度显著降低，基本恢复至对照组水平。这表明LRMP样品对GES-1的乙醇损伤具有更好的保护作用。多糖样品对细胞损伤修复或预防的功效已有报道，本研究证实了LRMP能够恢复细胞的SOD活力，提高抗氧化能力，减轻氧化损伤导致的细胞凋亡，对乙醇诱导损伤的GES-1有保护作用。

4 结论

本研究采用热水提取法从黑枸杞果实中提取多糖，并对LRMP的单糖组成、糖苷键连接方式、链构象等信息进行测定。结果表明，LRMP由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、岩藻糖和半乳糖醛酸组成，结构末端主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖残基组成，在溶液中呈典型的无规卷曲构象，Rg为（80.4±1.0）nm。在细胞实验中，LRMP（600 μg/mL）可以显著抑制乙醇对GES-1细胞造成的损伤，恢复细胞内SOD活性，通过抑制氧化损伤降低GES-1细胞凋亡率。综上，LRMP有提高免疫力、抗氧化、保护胃黏膜等生物活性，具有作为功能性多糖用于健康食品开发的潜力。

本文《黑果枸杞多糖结构表征及对乙醇诱导胃黏膜上皮细胞损伤的影响》来源于《食品科学》2023年45卷第9期109-115页，作者：钱荣，安佳鑫，续晓琪*，张涛，陈爱君，李莎，徐虹。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230619-146。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：普怡然；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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