酯酶是一类催化酯水解和合成反应的酶，包括脂肪酶、磷脂酶和酯合成酶，广泛应用于工业生产。它们在生物膜信号传导、脂质降解和酯类化合物合成中起关键作用，能够在不同发酵食品中合成多样化的风味酯化产物。 酶法合成小分子脂肪酸酯具有高效、无污染等优点，为酯酶在白酒产业的应用提供了有利条件。

四川轻化工大学生物工程学院的陈聪、邹伟 *、汤秀娟等从浓香型白酒大曲中筛选出一株高产酯酶的菌株S5-4，利用形态学、生理生化和分子生物学对其进行鉴定，通过基因组测序与功能基因组注释对菌株S5-4的产酯酶信息和产酯化物代谢路径进行深入研究，为其进一步开发利用提供依据。

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大曲中产酯酶细菌的初筛

采用传统的稀释涂布法，富集液被涂布于三丁酸甘油酯筛选平板上，酯酶与三丁酸甘油酯反应形成的透明圈大小代表菌株的酯酶活力高低。初筛共计筛选出50 株产酯酶的菌株。结果如图1所示，产酯酶菌株的D/d值在1.05～2.27，其中最高的11 株产酯酶菌株的D/d为1.35～2.27，菌株S5-4的D/d值最高，为2.27±0.02。

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产酯酶细菌的复筛

对初筛结果中D/d值较大的菌株按照1.3.1.5节中的方法进行酯酶活力的测定。测定结果如表1所示，菌株产酯酶活力在10.75～15.74 U/mL，且与初筛时的D/d值较为对应。菌株S5-4的酯酶活力最高，为（15.74±0.03）U/mL。后续实验确定以菌株S5-4为研究对象，对其进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定。

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产酯酶细菌的鉴定

3.1 菌株S5-4的形态观察

在三丁酸甘油酯平板上培养1 d后，菌株S5-4的菌落呈乳白色，表面光滑，菌落规则，边缘整齐，中间低凸起，菌落周围与边缘颜色一致，半透明，质地湿润黏稠（图2a）。经过革兰氏染色，于100（物镜）×10（目镜）倍光学显微镜下观察，菌株S5-4呈革兰氏阳性（紫色），圆球状，无芽孢（图2b）。用扫描电子显微镜放大1 000 倍观察菌株S5-4，菌体形态显示为球状或球杆状，排列方式为散落、成对或成短链，两端钝圆，部分两端稍尖，无夹膜和芽孢（图2c）。

3.2 菌株S5-4的生理生化鉴定

对菌株S5-4进行伯杰氏手册标准的生理生化实验，结果如表2所示，发现菌株S5-4的甲基红试验、D-葡萄糖试验、V-P试验均为阳性；吲哚试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验均为阴性。依据菌株形态观察、显微镜观察和生理生化鉴定，确认菌株S5-4为Lactococcus属。

3.3 菌株S5-4的分子生物学鉴定

为研究菌株S5-4系统进化关系，使用MEGA X计算机软件的ML法构建系统进化树。结果如图3所示，菌株S5-4与格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）的系统发育分支最相近；结合形态学鉴定、生理生化实验和扫描电子显微镜观察的菌株形态，最终确定菌株S5-4为格氏乳球菌，将其命名为L.garvieae S5-4。本实验中筛选出的L.garvieae S5-4已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:63054。

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格氏乳球菌S5-4基因组测序与功能注释

通过Illumina NovaSeq测序平台对目的菌株进行了全基因组测序，利用FastQC对数据进行质量控制，结果表明每个reads的单碱基质量都在36以下，4 种碱基的分布线平行且接近，高质量reads占总reads 98.05%，含有1 235 034 660 bp。对所有高质量reads进行基因组组装，得到45 个Contig，共2 191 113 bp序列信息，用于衡量基因组拼接效果的N50大小是148 761 bp。目的菌株基因组通过RAST和CGView基因组注释显示GC平均相对含量37.99%，包括1 486 个基因，其中包含4 个rRNA、69 个tRNA和34 个非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）基因（图4、表3）。同时，通过RAST注释基因组中酯酶的信息，并对酯酶进行亚细胞定位，发现其中酯酶主要包括磷酸酯酶（胞内酶5 个和细胞膜酶2 个）、酰基辅酶A脱酰酶（胞内酶）、丙酸三酯酶（胞外酶）、羧酸酯酶（胞外酶）和木聚糖酯酶（胞内酶）。通过酯酶蛋白序列比较，发现格氏乳球菌丙酸三酯酶序列明显不同于酵母和霉菌（图5），与霉菌酯酶的系统发育树分支相距较远，但它在亲缘分布关系上与酵母酯酶更为接近（图6）。

使用KAAS注释基因组信息构建L.garvieae S5-4的代谢路径，主要包括碳水化合物代谢（140）、氨基酸代谢（48）、核苷酸代谢（47）和辅酶和维生素代谢（38），这些不同途径的聚类被展示在图7中。通过KEGG重建该菌利用半乳糖和淀粉作为碳源合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的途径（图8）。L.garvieae S5-4能够利用异淀粉酶（胞外酶）、α-淀粉酶（胞内酶）和糊精转糖基化酶（胞内酶）水解淀粉生产葡萄糖。葡萄糖通过糖酵解代谢途径，在糖酵解过程中被分解成丙酮酸。丙酮酸可以通过不同的途径转化为乳酸、乙酸以及乙醇，其中乳酸是在乳酸脱氢酶（EC：1.1.1.27）的作用下合成，乙酸则需要经过丙酮酸氧化酶（EC：1.1.3.3）和乙酸激酶（EC：2.7.2.1）合成，而乙醇则需要经过磷酸乙酰转移酶（EC：2.3.1.8）、乙醛脱氢酶（EC：1.2.1.10）和乙醇脱氢酶（EC：1.1.2.8）合成。乳酸、乙酸和乙醇分别通过乳酸转运蛋白（TC：1.A.14.2.2）、乙酸转运蛋白（TC：3.B.1.1.1）和乙醇转运蛋白（TC：3.A.1.103.5）转运蛋白运输到细胞外，在羧酸酯酶（胞外酶）的作用下生成乳酸乙酯和乙酸乙酯。格氏乳球菌乳酸乙酯和乙酸乙酯的代谢合成路径的解析对于进一步开发该菌在白酒中的应用提供了依据。

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菌株S5-4厌氧发酵产酯

将L.garvieae S5-4制备成种子液，厌氧发酵15 d后，对发酵液进行GC-MS分析，结果表明，乙酸乙酯产量为（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯产量为（0.298 3±0.230 0）g/L。程伟等从白酒酿造过程中筛选的酵母菌产乙酸乙酯量为0.248 9 g/L，与之相比较，L.garvieae S5-4通过厌氧发酵产酯量提高了38.6%。根据菌株纯培养结果也验证了对L.garvieae S5-4代谢路径酯合成产物的分析，它能够利用自身的合成乙酸、乙醇和乳酸生成乙酸乙酯和乳酸乙酯。

以往的研究多集中于产酯酶微生物的发酵条件和酶学性质，但很少从全基因组层面和代谢途径上解析它们的机理。本实验从基因组信息注释和代谢路径上分析了L.garvieae S5-4生产酯类化合物的机理，进一步了解酯酶的代谢特性。通过对该菌株代谢路径的重建及验证分析，发现它能够以半乳糖和淀粉为碳源在细胞内生产乙酸、乙醇和乳酸和在细胞外合成乙酸乙酯和乳酸乙酯。目前已有研究表明，在窖泥和大曲中初筛细菌酯酶活力最高分别能达到10.43 U/mL和12.52 U/mL，本实验初步筛选出的L.garvieae S5-4菌株，其酯酶活力可达15.74 U/mL。在后续的研究中，还可以利用正向突变技术，对发酵条件进行优化（如温度、pH值、接种量、培养时间等），提高酯酶活性，并对其代谢途径进行调节，从而提高酯类化合物的产量。

酯类化合物的含量是白酒风味物质评价的重要指标，主要包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯。前期研究中，霉菌、酵母菌和一些细菌被作为筛选酯酶的对象，通过增加产酯酶的效率来提升大曲的质量和白酒的香味。本实验将产酯酶L.garvieae S5-4菌株作为筛选对象，用于发酵过程中，以提高发酵液的酯含量。与霉菌、酵母菌相比，它的生产周期较短，与其他细菌相比，它的酯酶活力较高，在提高白酒中酯类物质含量方面有较大应用价值。此外，还可以将其接种于白酒发酵过程产生的副产物（酒糟和黄水）中进行二次发酵，生产酯类化合物，从而提升白酒的口感和质量。因此，筛选具有较高酯酶活性的细菌并利用这些副产物资源生产酯类化合物对白酒生产具有一定的科学研究意义和经济效益。

从浓香型白酒大曲中筛选出了1 株具有较强酯酶活性的菌株S5-4，产酯酶活力达到15.74 U/mL，经鉴定为格氏乳球菌（L.garvieae）。基因组注释显示，该菌株能够合成磷酸酯酶、酰基辅酶A脱酰酶、丙酸三酯酶、羧酸酯酶和木聚糖酯酶，根据酯酶编码基因设计和构建基因工程策略或调控酯酶活性相关的代谢通路中关键酶提高该菌株的酯酶活性。代谢途径构建显示，S5-4菌株具有利用淀粉和乳糖合成乳酸、乙酸和乙醇的能力，并能在酯酶作用下合成乳酸乙酯和乙酸乙酯。发酵实验证实该菌乙酸乙酯产量为（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯产量为（0.298 3±0.230 0）g/L。本研究为L.garvieae S5-4的生理特性研究和进一步开发应用提供了参考。

本文《产酯酶格氏乳球菌的筛选、鉴定与基因组注释》来源于《食品科学》2024年45卷第08期87-95，作者：陈 聪，邹 伟 *，汤秀娟，陈晓松，吴成泽。DOI :10.7506/spkx1002-6630-20230714-161。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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