酸肉是以猪肉为原料，利用微生物自然发酵而成的传统发酵肉制品，因具有独特的风味、质地和良好的贮藏性能备受人们喜爱，其中苗族、侗族、布依族的酸肉最为著名。酸肉中蕴藏着丰富的微生物，因其生产的工艺、环境条件和地区差异可以富集不同类型和代谢特征的微生物群。乳酸菌（LAB）和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）是发酵酸肉中的优势菌群。

合肥工业大学食品与生物工程学院的李雪菲、潘琼、李沛军*等从贵州苗族、侗族和布依族传统发酵酸肉中分离获得LAB和CNS菌株，通过体外实验评价菌株的消化道环境耐受能力、黏附能力和安全性，筛选具有益生潜力的肉源性菌株，不仅可为中国本土肉源益生菌发掘奠定基础，还可为功能性肉制品开发提供支持。

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菌株分离纯化结果

从苗族酸肉、侗族酸肉和布依族酸肉中共分离纯化得到62 株菌（表2）。其中，通过MRS琼脂培养基分离得到31 株菌，为圆形透明或乳白色菌落，菌体为革兰氏阳性、成对或呈链状分布的杆菌；通过MSA琼脂培养基分离得到31 株菌，为圆形黄色或白色菌落，菌体为革兰氏阳性、呈葡萄状分布的球菌。经过16S rDNA测序发现，从苗族酸肉中分离出20 株LAB和16 株CNS，从侗族酸肉中分离出LAB 11 株，未分离出CNS，从布依族酸肉中分离出15 株CNS，未得到LAB。由于传统酸肉多为自然发酵，其微生物群落组成受生产环境条件和气候差异影响较大。因此，从不同地区、不同加工工艺的酸肉中收集和发掘有益微生物资源极为必要。

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分离株筛选与鉴定结果

益生菌要在人体胃肠道内存活并增殖，必须具备一定的耐酸能力。经模拟胃液孵后菌数降低量小于2（lg（CFU/mL））的菌株被称为胃环境耐受能力较强的菌株，因此，对62 株分离株进行模拟胃液耐受能力初筛，挑选经模拟胃液孵育3 h后菌数降低量小于2（lg（CFU/mL））的分离株进行后续实验。62 株分离株中共得到胃液耐受能力较强的LAB 6株、CNS 6 株，其菌落、菌体形态见图1和图2。菌株KLMM196、KLMM198、KLMM199、KLMM225、KLMM228和KLMM237可以在MRS固体培养基上生长，菌落为圆形、较小、呈白色或乳白色、边缘光滑，为革兰氏染色阳性菌，菌体为直杆或短杆状，呈链状排列。菌株KLMM253、KLMM301、KLMM304、KLMM307、KLMM313、KLMM356在MSA培养基上生长，菌落为圆形，呈黄色或淡黄色，边缘光滑，菌落周围培养基呈黄色，为革兰氏阳性菌，菌体为球状，呈葡萄状排列。

根据16S rDNA系统发育树（图3）和种特异性PCR鉴定（图4）的结果，菌株KLMM196被鉴定为香肠伴生乳杆菌（Companilactobacillus farciminis），菌株KLMM198、KLMM199、KLMM225、KLMM228和KLMM237被鉴定为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），菌株KLMM 253、KLMM 304、KLMM356被鉴定为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），菌株KLMM307、KLMM313、KLMM301被鉴定为干酪葡萄球菌（S.casei）（表3）。

03

微生物益生潜力评价结果

3.1 消化道环境耐受能力

宿主胃液中的低pH值和肠液中的胆汁盐是影响益生菌通过消化道后活性的重要屏障，而菌株的存活情况是决定其益生特性的基础。由图5可知，所有菌株在模拟胃液中孵育3 h后仍具有较强活性。除KLMM237外，其他LAB菌株的数目均未显著下降，说明分离获得的LAB具有极强的胃环境耐受能力。虽然CNS菌株经过模拟胃液孵育后活菌数有所下降，但菌数降低量在2（lg（CFU/mL））以内，说明其对胃环境具有一定的耐受能力。经过模拟肠液孵育4 h后，除干酪葡萄球菌KLMM301外，其他菌株仍具有较强活性，其中活菌数最高的LAB和CNS分别是植物乳植杆菌KLMM198（7.74（lg（CFU/mL）））和腐生葡萄球菌KLMM253（6.12（lg（CFU/mL）））。

3.2 疏水性

疏水性是指菌体脱离水相黏附于其他有机相的能力，细菌的疏水性与其非特异性黏附能力密切相关，疏水性越强的菌体越容易黏附于人体胃肠道表面，进而发挥益生作用。

不同的菌株之间疏水性有较大差异，由图6可知，香肠伴生乳杆菌KLMM196和植物乳植杆菌KLMM198对二甲苯的疏水性高于50%，其疏水性显著高于其他LAB菌株。CNS菌株的疏水性均高于60%，其中腐生葡萄球菌KLMM253，干酪葡萄球菌KLMM301、KLMM307和KLMM313高于80%，为高度疏水菌株。说明LAB中的KLMM196、KLMM198和CNS中的KLMM253、KLMM301、KLMM307、KLMM313具有良好的疏水性。

3.3 自聚集能力

自聚集是菌体自行聚集成团的现象，用于衡量菌株的黏附性能。通常情况下，自聚集能力高的菌株在竞争细胞-宿主结合位点时处于优势地位，不仅有利于其在肠道中定植，还能有效阻止病原体与宿主结合，从而阻止致病菌黏附。图7显示，筛选LAB菌株的自聚集能力随静置时间的延长而提升，其中香肠伴生乳杆菌KLMM196和植物乳植杆菌KLMM198在静置4 h时的自聚集率超过60%，在8 h时达到80%，属于高自聚集能力菌株。CNS菌株的自聚集能力在整个静置过程中整体上高于LAB，在前2 h内迅速凝聚，在4 h时均超过80%，且在8 h时自聚集率基本保持不变或略有增加，说明CNS可能具有较高的黏附肠上皮细胞的能力。

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安全性评价结果

安全性评价是细菌能否作为益生菌的先决条件，菌株溶血活性检测是益生菌安全性评价的重要指标。12 株菌在哥伦比亚血平板上培养48 h后，菌落周围均未出现溶血圈（图8），说明从贵州传统酸肉中分离筛选出的12 株具有益生潜力的菌株及其代谢产物对血红细胞均无损伤。

05

益生菌经摄食进入人体后，可以通过改善肠道菌群、刺激人体免疫应答，促进有害物质代谢及产生抑菌物质发挥益生作用，因此针对功能性益生菌的研究受到了越来越多的关注。特别是从自然发酵食品中分离、筛选安全性高的功能益生菌已成为一个研究热点。酸肉是一种南方少数民族传统发酵肉制品，依赖于环境中微生物长期发酵，其中的微生物通过竞争和群落演替形成丰富多样的微生物菌群，在发酵贮藏过程中，酸肉的pH值较低，因此更有可能从中发现耐酸菌株。

LAB和CNS是发酵酸肉中的优势菌群，在酸肉的发酵中起重要作用。研究证明，LAB和CNS的部分菌株具有强大的益生特性或益生潜力。因此，酸肉样品中有益微生物的分离和筛选主要针对LAB和CNS。因此，本研究将形态学观察、16S rDNA序列鉴定和种特异性PCR鉴定相结合，达到在种水平上快速、准确鉴定待测菌种的目的。应用上述方法，本研究从贵州传统发酵酸肉中分离出31 株LAB和31 株CNS，并对筛选得到的12 株模拟胃液耐受能力较强的菌株进行了种水平的分类鉴定，这为发掘和快速鉴定发酵食品中的有益微生物提供了参考。

菌株的消化道耐受能力是益生菌筛选的必要环节。酸肉在发酵过程中pH值逐渐降低，能够为耐酸微生物提供较好的生长环境，是益生菌的天然潜在来源。本研究从贵州传统发酵酸肉中分离筛选的12 株菌先后经过模拟胃液和模拟肠液孵育后，除干酪葡萄球菌KLMM301外，其他菌株仍具有较强活性，说明酸肉中存在能够耐受消化道环境的有益菌，可能在肠道中存活并发挥益生作用。

细菌对肠上皮细胞的黏附能力是筛选益生菌最重要的选择依据之一，良好的黏附能力既可以阻止益生菌随肠道蠕动排出宿主体外，提高益生菌在胃肠道中的生存能力。表面疏水性和自聚集能力可作为筛选高黏附能力菌株的参考指标。本研究通过测定12 株菌的疏水率和自聚集率发现，KLMM196、KLMM198、KLMM253、KLMM301、KLMM304和KLMM307既具有较高的疏水性，也具有较强的自聚集能力，黏附在肠道表面进而发挥益生作用的可能性更大。经过胃肠液耐受、菌种疏水性和自聚集能力测试结果综合比较，发现香肠伴生乳杆菌KLMM196和植物乳植杆菌KLMM198的消化道环境耐受能力、疏水性和自聚集能力均显著高于其他LAB，腐生葡萄球菌KLMM253、干酪葡萄球菌KLMM307和KLMM313具有良好的消化道环境耐受能力、疏水性和自聚集能力。可见，香肠伴生乳杆菌KLMM196、植物乳植杆菌KLMM198、腐生葡萄球菌KLMM253、干酪葡萄球菌KLMM307和KLMM313能够在消化道环境存活，具有黏附于人体胃肠道表面并定植的潜力，具有较强的益生潜力。

溶血活性是体外测定益生菌安全性的重要指标，具有溶血活性的菌株会产生溶血素使红细胞破裂溶解，引发人体不良反应。本实验的12 株菌均无溶血活性，筛选出的具有益生潜力的2 株LAB和3 株CNS菌株及其代谢产物对血红细胞无损伤。

深入发掘并解析益生菌的功效和作用机制已成为全球研究的热点及益生菌产业发展的新方向。为发掘传统发酵肉制品中潜藏的具有益生功效的微生物，本研究已对12 株菌分别进行了消化道环境耐受能力，肠道黏附能力及安全性测定，筛选得到2 株益生潜力较强的LAB和3 株具有潜在益生特性的CNS，下一步将通过体外功效性评价模型进一步发掘上述菌株的益生功效，并利用动物模型揭示菌株在生物体内的作用效果及机制。

发酵肉制品被认为是一种传统的健康食品，深受国内外消费者的喜爱。相比于一般肉制品，发酵肉制品的健康益处主要归因于其中的有益微生物和发酵过程产生的生物活性化合物，这些微生物及其代谢产物可能具有抗菌、抗氧化、抗炎等益生特性。因此，发掘传统发酵肉制品中潜藏的具有益生功效的微生物，可以为开发适用于肉制品的益生菌发酵剂奠定基础，为提升发酵肉制品的健康价值、推动其高质量转型升级提供理论和技术支持。

06

结论

从3 种少数民族传统发酵酸肉中分离纯化得到31 株LAB和31 株CNS，对这62 株分离菌株进行胃环境耐受能力初筛，得到胃环境耐受能力较强的6 株LAB和6 株CNS。对筛选出的12 株菌进行益生潜力评价，筛选得到2 株益生潜力较强的LAB（香肠伴生乳杆菌KLMM196和植物乳植杆菌KLMM198）和3 株具有潜在益生特性的CNS（腐生葡萄球菌KLMM253、干酪葡萄球菌KLMM307和KLMM313），且5 株菌株均无溶血活性。可基于细胞、活体动物进一步发掘菌株的益生特性，并围绕其具体益生功能开展深入研究。本研究为发掘我国肉源有益微生物、开发本土肉源益生菌、丰富我国益生菌资源库提供了参考。

通信作者：

李沛军，教授、博士生导师，合肥工业大学肉品绿色制造与品质调控创新团队骨干成员，入选国家级青年人才奖励计划。担任中国轻工业肉品微生物控制及利用重点实验室副主任、中国食品科学技术学会青年工作委员会委员、中国畜产品加工研究会青年工作委员会委员、中国食品科学技术学会非热加工技术分会委员、《肉类研究》和《食品研究与开发》等期刊编委。从事微生物与肉品质量安全控制研究工作，主持“十三五”和“十四五”国家重点研发计划课题、国家自然科学基金（面上、青年）等项目10余项，以第一/通信作者发表学术论文50余篇，副主编和参编教材/著作7 部，申请和授权PCT和国家发明专利20余项。入选安徽省学术和技术带头人后备人选，获评安徽省教坛新秀，获得省部级科技进步一等奖3 项。

第一作者：

李雪菲，合肥工业大学食品与生物工程学院2021级生物与医药专业硕士全日制研究生，师从李沛军教授。硕士期间参与国家自然科学基金面上项目1 项，国家重点研发计划课题1项，已公开发表SCI论文1 篇、EI论文1 篇，获得中国食品科学技术学会-第二届“科拓生物杯”益生菌科普知识竞赛第三名，获评校“一等学业奖学金”、“三好学生”等荣誉。

本文《传统发酵酸肉中微生物的分离鉴定及其益生潜力评价》来源于《食品科学》2024年45卷14期75-84页。作者：李雪菲，潘琼，罗慧婷，徐宝才，李沛军。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231127-215。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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