白酒是中国最具代表性的蒸馏酒，根据不同的发酵曲和发酵工艺可分为酱香型、浓香型和清香型等众多香型。其中酱香型白酒的酿造工艺最为复杂，高温环境条件下分为制曲、堆积、发酵、馏酒。高温大曲是酱香型白酒酿造所需的发酵剂和生香剂。高温大曲生产中，常将曲胚按一定排列规则堆积为4～6 层进行共发酵，由于曲房空间的异质性，分布于不同层大曲所受环境因子胁迫不同，至发酵结束可在同一曲房不同层可形成黄曲、白曲、黑曲。后续的酒醅发酵中使用的生产用曲需将3种大曲按照一定比例混合而成，但是不同曲种形成过程的不可控会导致不同批次间白酒质量出现较大波动。作为酿酒大曲关键组分之一的黑曲，其产量虽然远远低于白曲和黄曲，但其成分和配比对于最后成品酱香型白酒的风味仍有着不可忽视的影响。
贵州大学酿酒与食品工程学院的邓阿玲、唐杰、黄永光*结合实际生产工艺的关键控制点，对入房、第一次翻曲、第二次翻曲、出房节点的黑曲进行取样。跟踪化验各节点样本的理化性质，并通过高通量测序技术对黑曲发酵过程中微生物的演替规律及驱动机制进行探索。此外，应用质谱法对各节点黑曲样品的挥发性风味物质特性进行研究，并将其和微生物群落结构演替规律进行耦合分析，构筑环境对细菌群落组成的影响机制及黑曲的微生物群落的组成和结构与风味物质之间的构效关系。本研究将为理解高温大曲黑曲发酵过程中的微生物群落特征演变及风味物质变化规律提供理论基础，同时为强化大曲发酵人工调控技术、提升成品酱香型白酒风味与质量提供新的思路。
1
制曲过程中黑曲理化指标变化规律
黑曲的酯化力在第一次翻曲时达到最高（11.5 mg/（g·7d）），第二次翻曲时酯化力（8.6 mg/（g·7d））有所降低，最终稳定在约8.01 mg/（g·7 d）。黑曲液化力在入房时最高（0.555 g/（g·h）），随发酵时间延长不断下降（图2a）。发酵过程黑曲水分含量呈下降趋势，出房时水分质量分数降至约13.9%。发酵温度则从入房开始迅速上升，在第一次翻曲时达到峰值67 ℃，第二次翻曲时约为58 ℃，至出房时温度维持在40 ℃左右（图2b）。结果表明黑曲的发酵温度整体上略高于黄曲（峰值温度为62～64 ℃）。入房时黑曲酸度最低（0.13 mmol/10 g），随发酵时间的延长，酸度开始急剧上升并于第二次翻曲时期达到峰值（2.519 7 mmol/10 g），在第二次翻曲后开始下降，最终稳定在1.330 2 mmol/10 g左右（图2c）。黑曲发酵力呈先升高后降低趋势，到第一次翻曲时上升到2.87 g/（g·72 h），第二次翻曲时有所下降（2.07 g/（g·72 h）），最终稳定在2.5 g/（g·72 h）。发酵过程中黑曲的糖化力呈先降后升趋势（图2d），第二次翻曲时黑曲的糖化力降低到29 mg/（g·h），出房阶段回升至35 mg/（g·h）。相较于普通黄曲，黑曲表现出高酸度、低糖化力、低液化力的特点，这与Yang Liang和Du Yake等的研究相符。以上结果表明可以通过适当的调控不同节点的时长占比调控相对应的参数如延长第二次翻曲阶段以增加酸度、缩短第二次翻曲时间以增加糖化力等。
2
制曲过程中黑曲风味物质的合成规律
从黑曲曲胚发酵过程中共检出193种主要挥发性化合物，其中酯类（57种）、醛酮类（45种）、芳烃类（15种）、醇类（15种）、吡嗪类（14种）、酚类（14种）、杂环类（14种）、呋喃类（13种）和酸类（6种）。在黑曲曲胚发酵过程中检测出来的主要挥发性化合物的种类和已报道的黑曲发酵过程中的化合物种类是相似的，但是风味物质变化规律、含量水平存在显著不同，如本研究发现黑曲曲胚入房到一翻阶段风味化合物的种类和含量会出现明显上升，而在第二次翻曲到出房阶段各类化合物的种类变化差异较小（图3a）。相较于其他节点，第一次翻曲时的风味化合物的种类明显更为复杂，含量也更高（图3b、c），在此推测第一次翻曲到第二次翻曲的高温发酵阶段是黑曲风味物质合成并形成相对稳定的关键阶段。吡嗪类化合物是黑曲在发酵过程中合成最多的风味化合物，主要包括2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基-3-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-甲基丙基吡嗪、2-乙氧基-3-甲基吡嗪等，尤其是2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙酰基-3-甲基吡嗪的相对含量较高。吡嗪类化合物在多种香型白酒中均有检出，其主要功能是提升白酒的风味质量和健康属性。先前研究表明，吡嗪类化合物的香味阈值普遍较低，对酱香型白酒的风味有重要贡献，可贡献酒体的甜香、坚果香以及花香味，并且对其他香味物质的呈香呈味有明显的烘托叠加作用。此外，苯乙醛和苯甲醛是黑曲发酵期内合成的主要醛类物质，其不仅是黑曲重要的香气活性成分之一，也是酒体中辣味的主要来源。同时在样本中还检测出了少量的5-甲基糠醛，糠醛主要由原辅料中的戊糖在高温制曲发酵下产生，具有明显的焦苦和涩味。其味觉阈值低，极少的量就能使人感受到苦涩味，但与其他香味配合能够起到协调“喷香”的作用。酯类化合物中乙酸乙酯、γ-戊基丁内酯的含量较高，乙酸乙酯带有香蕉香或苹果香，是酱香型白酒复合香气的重要构成之一。2-苯乙醇是主要的醇类物质，具有花香味，是酱香白酒的特征风味化合物之一。酸类化合物中含量较高的化合物为己酸，己酸是己酸乙酯的前体物质，酸味柔和但伴有强烈的脂肪臭。
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制曲过程中黑曲曲胚在不同发酵节点时微生物群落结构演替规律探究
黑曲发酵过程中共检测出细菌属605种（图4a）、真菌属110种（图4b），其中入房阶段独有细菌属110种、真菌属20种，一翻阶段独有细菌属51种、真菌属7种，二翻阶段独有细菌属38种，出房阶段独有细菌属92种、真菌属40种。黑曲的整个发酵过程中共有细菌属89种、真菌属12种。黑曲细菌的Chao1指数从入房时到二翻阶段一直下降（图4c），说明在高温发酵阶段黑曲的细菌物种数在下降，真菌群落表现出与细菌相似的趋势（图4e）。在发酵过程中入房和出房阶段的Chao1指数均高于其他两个发酵时期，说明在高温发酵阶段大量的不耐热微生物生长受到抑制。从Shannon指数可以看出，黑曲的细菌群落丰度和均匀度均高于真菌群落（图4d、f），黑曲微生物的丰度和均匀度均在入房时期最高，可能是发酵过程中环境对微生物的选择作用以及微生物间相互作用造成的。主成分分析（PCA）结果（图4g）表明，黑曲发酵过程中细菌群落入房和出房阶段的结构组成更相近，高温发酵期内的细菌结构组成更相近。而真菌群落在二翻阶段和出房阶段的结构组成更相似（图4h）。
4
制曲过程中黑曲曲胚在不同发酵节点时优势微生物及生物标志物分析
不同发酵阶段黑曲曲胚的优势微生物结构如图5a、b所示，结果表明，黑曲的优势细菌属从入房阶段的芽孢杆菌属（
Bacillus，相对丰度18.36%）、
Massilia（13.79%）、
Virgibacillus（13.59%）、
Pantoea（12.43%）演替为一翻阶段的芽孢杆菌属（
Bacillus，65.78%）、
Pantoea（12.33%）。然后演替为二翻阶段的芽孢杆菌属（
Bacillus，25.31%）、青枯菌属（
Ralstonia，14.02%）、
Scopulibacillus（13.31%）。最后演替为出房阶段的芽孢杆菌属（
Bacillus，16.33%）、
Virgibacillus（29.30%）、
Kroppenstedtia（18.14%）、
Oceanobacillus（17.42%），而黄曲在发酵后期
Kroppenstedtia的相对丰度可高达90%成为绝对优势属。该结果表明，黑曲曲胚优势微生物菌群结构演替的尺度较大，几个阶段菌群结构差异性较大，优势菌群结构多样性得到显著提升。其主要原因在于曲胚发酵环境对微生物的生长的干预和选择作用，例如高温发酵环境非常适合芽孢杆菌属（
Bacillus）的生长，故其在一翻阶段大量富集，
Bacillus是酱香白酒酿造中最丰富的菌群之一，也是酱香型白酒酱香味的主要贡献者，在本研究中
Bacillus的结构占比在4个发酵阶段先增加后降低，且低于同一发酵时期的黄曲，这也是黑曲曲胚曲香不浓郁的原因。黑曲的优势真菌属则从入房阶段的
Alternaria（30.68%）、
Thermoascus（8.63%）演替为一翻阶段的
Saccharomyces（49.59%）、
Monascus（10.33%）、
Talaromyces（7.56%）。然后演替为二翻阶段的
Thermoascus（65.75%）、
Millerozyma（13.99%），最后演替为出房阶段的
Thermoascus（51.57%）、
Zygosaccharomyces（29.03%），这些优势微生物在高温大曲中普遍被检出。
不同发酵阶段黑曲曲胚的生物标志物如图5c、d所示，在入房阶段的细菌标志物种为
Mucilaginibacter
Hylemonella
Acidovorax
Verticiella
Bifidobacterium等。一翻阶段则演替为Rickettsiaceae。二翻阶段则演替为乳杆菌属（
Lactiplantibacillus）、大曲岩石芽孢杆菌（
Scopulibacillus）等；出房时则演替为
Enterococcaceae等，在前人的研究报道中也有相似结果。同样，黑曲曲胚发酵过程在入房阶段的真菌标志物种为
Tilletiopsis
Trichothecium
Sporisorium
Cochliobolus、Alternaria等。一翻阶段则演替为
Wallemia、酵母菌（
Saccharomyces）。二翻阶段则演替为
Trichomonascus
Asterotremella。出房阶段则演替为
Eurotium
Vermispora
Xeromyces
Paecilomyces
Zygosaccharomyces。可见，黑曲曲胚在发酵过程中，微生物群落演替激烈。
5
发酵环境因子对黑曲曲胚微生物群落演替的驱动力解析
运用Mantel test分析探索了环境因子对黑曲曲胚微生物演替的驱动作用，同时也分析了微生物群落对曲胚发酵特性的影响。由图6可知，环境因子对黑曲曲胚微生物群落的影响具有显著性（
P＜0.05）。曲胚入房时的细菌群落主要受到水分、温度等的影响和调节，对每个阶段节点的细菌群落和环境条件的相关性进行了计算和分析，如图6a、b所示，一翻阶段的细菌群落与黑曲水分显著相关，该现象表明发酵初期黑曲的水分对细菌群落存在较大影响。二翻阶段的细菌群落与黑曲的温度、发酵力和酯化力显著相关，这表明二翻阶段温度成为黑曲细菌群落的主要影响因素，较高的温度影响了细菌群落的演替并提升了黑曲的发酵力和酯化力。在出房阶段，黑曲中的细菌群落与大曲发酵力和酯化力显著相关，表明此时大曲中已经形成了具备以发酵和酯化功能为主的酿造细菌群。与之相对的是，黑曲内部的真菌群落在一翻阶段受温度、酸度、水分的影响较高，且与黑曲糖化力显著相关。二翻阶段的真菌群落同样受温度、水分和酸度的影响且与黑曲的糖化力、酯化力显著相关。出房阶段的黑曲主要受温度影响，且为黑曲的发酵力和酯化力作出贡献。环境因子对黑曲内部的微生物群落演替存在明显的驱动作用，相较于细菌群落，黑曲中的真菌群落结构更易受到外界环境因素的影响。Yang Liang等也认为中下层高温大曲真菌群落结构更易受到湿度、酸度调节的影响。高温等因素必然会产生或加速美拉德反应速率，从而增加吡嗪类化合物的产量，这可能是导致黑曲中吡嗪类化合物的相对含量较高的重要原因。
环境因子对黑曲曲胚微生物演替的驱动作用会随着发酵环境的变化而变化，如图6c所示，入房阶段水分与
Agrobacterium
Pedobacter
Hylemonella
Curtobacterium
Acidovorax
Mucilaginibacter
Verticiella
Massilia显著正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。曲胚糖化力与
Agrobacterium
Pedobacter
Hylemonella
Curtobacterium
Acidovorax
Mucilaginibacter
Verticiella
Massilia呈显著正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。液化力和
Pseudogracilibacillus
Hymenobacter
Verticiella
Thermoactinomyces
Pedobacter
Hylemonella
Curtobacterium
Acidovorax
Mucilaginibacter
Massilia呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。入房阶段黑曲的水分、糖化力、液化力均最高，黑曲在入房阶段的糖化力、液化力可能主要由
Agrobacterium
Pedobacter
Hylemonella
Curtobacterium
Acidovorax
Mucilaginibacter
Verticiella代谢提供且受到水分的调节。相比于前面两个阶段，二翻阶段的酸度最高，温度和酯化力比入房阶段高但是略低于一翻阶段，而在二翻阶段温度和
Methyloversatilis
Ligilactobacillus呈正相关（
r＞0.6、
P＜0.05）。酸度和
Methyloversatilis
Ligilactobacillus
Aquabacterium
Aerococcus
Saccharopolyspora呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。酯化力与
Methyloversatilis
Ligilactobacillus呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。表明在本阶段酯化力主要由
Methyloversatilis
Ligilactobacillus提供并受到温度和酸度的调节，适当调节温度和酸度有利于二翻阶段黑曲酸和酯的积累。出房阶段细菌群落发酵力与
Enterococcus呈正相关。液化力与
Oceanobacillus
Kroppenstedtia呈正相关（
r＞0.7、
P＜0.05）。
真菌群落结构演替在入房阶段水分与
Cochliobolus
Sporisorium
Trichothecium呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。糖化力与
Cochliobolus
Sporisorium
Trichothecium呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。液化力与
Alternaria
Trichothecium
Cochliobolus
Sporisorium呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。入房阶段糖化力、液化力主要由
Alternaria
Trichothecium
Cochliobolus
Sporisorium代谢分泌提供，且在入房阶段水分含量最高，说明糖化力和液化力主要受到水分的调节，且曲胚中的分泌糖化酶类微生物、糖化液化功能富集主要发生在此阶段。一翻阶段温度与
Millerozyma
Asterotremella呈正相关（
r＞0.7、
P＜0.05），酸度与
Millerozyma
Asterotremella呈正相关（
r＞0.8、
P＜0.05）。水分与
Harzia
Wallemia
Pleospora
Tilletiopsis呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。糖化力与
Wallemia
Harzia
Saccharomyces
Pleospora
Tilletiopsis呈正相关（
r＞0.5、
P＜0.05）。第一次翻曲阶温度和酸度上升、水分下降，表明与糖化力的高低受到温度、酸度、水分等多方因素的影响。第二次翻曲液化力与
Thermomyces
Paecilomyces呈正相关（
r＞0.6、
P＜0.05）。出房阶段液化力与
Rhizopus
Cryptococcus呈正相关（
r＞0.6、
P＜0.05）。
Rhizopus可直接将原料中的淀粉降解为酵母可直接利用还原糖，从而刺激酵母的生长。环境对微生物的影响并不是单一的，微生物代谢活动也会反过来作用于环境，实际生产中应当综合考虑多方因素达到调节黑曲曲胚微生物结构以适应生产的目的。
6
影响黑曲曲胚风味形成的关键生物因子
图7结果表明，黑曲曲胚在发酵过程中共存在15个优势细菌属与曲胚中16种主要挥发性风味化合物具有强相关性（
r＞0.7、
P＜0.05），其中气球菌属（
Aerococcus）与3-乙基-2,5-二甲基吡嗪呈显著正相关，表明
Aerococcus的生长情况可能会影响到3-乙基-2,5-二甲基吡嗪风味物质的合成。
Sporosarcina、乳球菌属（
Lactococcus）与乙酸苯乙酯正相关。
Akkermansia与十六酸乙酯正相关。海洋杆菌属（
Oceanobacillus）与2-丙烯醛、苄基醇、苯甲醇正相关。
Virgibacillus与1-(1H-吡咯-2-基)-乙烷酮正相关。
Kroppenstedtia与顺-3-己烯-1-醇、苄基酯、2,5-乙基甲基吡嗪正相关。短杆菌属（
Brevibacterium）与乙酸、苯甲醛正相关。黑曲曲胚在发酵过程中共有5个优势真菌属与6种关键挥发性风味化合物具有强相关性（
r＞0.7、
P＜0.05），其中
Zygosaccharomyces与癸酸乙酯、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇正相关。酵母属（
Saccharomyces）与2-乙基-3-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪显著正相关，与2-异丁基吡嗪负相关。
Wallemia与2-乙基-3-甲基吡嗪正相关，与2-异丁基吡嗪负相关。
Trichomonascus与2-乙基-3-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪负相关，
Thermoascus与(
E)-4-壬烯醛正相关。综上所述，微生物对黑曲曲胚风味形成起重要贡献作用，可以通过调控对应菌群的生长，进而增加/减少相对应的风味物质的合成，从而对黑曲风味进行精准调控。
结论
综上所述，
Bacillus
Thermoascus在黑曲的整个发酵过程中占主导地位，但不同阶段的生物标志物表现出阶段性演替规律。黑曲中的风味化合物（尤其是吡嗪类）主要累积于第一次翻曲和第二次翻曲阶段之间，而此时的微生物群落与温度和水分显著相关（
P＜0.05）。在酸度和温度的调节下，出房阶段的黑曲形成了以
Bacillus
Virgibacillus
Kroppenstedtia
Oceanobacillus
Thermoascus
Zygosaccharomyces为主的微生物群落，并最终表现出低糖化力、低液化力的发酵特征。相关性分析表明，细菌群落中
Oceanobacillus
Virgibacillus
Kroppenstedtia等对癸酸乙酯、2-丙烯醛、苯甲醇、苄基醇等多种风味化合物合成有积极贡献，而真菌群落中
Thermoascus与(
E)-4-壬烯醛正相关。这些微生物的富集为黑曲风味的形成做出了积极贡献。本研究聚焦了黑曲在发酵过程中的微生物群落和风味变化规律并深入揭示其深层驱动因素，为大曲质量的提升提供了重要参考，同时为强化酿造生产及产品质量提供了新的思路。
综上所述，温度、水分和酸度是黑曲在4个关键制曲节点微生物群落演替过程中的主要驱动因子。同时，发酵过程黑曲的细菌群落结构的多样性远高于真菌群落，且均在高温发酵期后明显降低。此外，黑曲在不同节点阶段的微生物群落结构存在较大差异，除
Bacillus
Thermoascus外，其余微生物属均出现极为剧烈的演替现象。出房阶段的黑曲微生物群落以
Bacillus
Virgibacillus
Kroppenstedtia
Oceanobacillus
Thermoascus
Zygosaccharomyces为优势微生物，而在第一次和第二次翻曲后优势生物就会发生改变，只有两种左右的优势菌群，表明不同菌群在不同阶段的生长条件的特异性。与此同时，相关性分析表明，温度、水分、酸度在不同阶段对黑曲微生物群落产生的驱动作用有所不同。具体体现为入房阶段的黑曲微生物群落主要受水分影响，一翻和二翻阶段微生物主要受温度、酸度、水分调节，出房阶段的细菌群落影响黑曲的发酵力，而真菌群落影响黑曲的液化力。
Oceanobacillus
Virgibacillus
Kroppenstedtia与癸酸乙酯、2-丙烯醛、苯甲醇、苄基醇等多种酚类、酮类和酯类化合物正相关。本研究聚焦了黑曲在发酵过程中的微生物群落和风味变化规律并深入揭示其深层驱动因素，为大曲质量的提升提供了重要参考，同时为强化酿造生产及产品质量提供了新的思路。
第一
作者
邓阿玲 硕士研究生
邓阿玲，贵州大学酿酒与食品工程学院2021级食品学与工程专业硕士研究生。主要研究方向为：高温大曲功能微生物及其代谢、白酒风味化学组学等。
通信
作者
黄永光 教授
博士生导师，贵州大学科学技术研究院副院长，贵州大学学术学科带头人，贵州省省管专家、优秀青年科技人才，贵州省酿酒工业协会秘书长、贵州省白酒产业促进会副秘书长，贵州省白酒专家委员会秘书长，国家白酒特邀评委、酿酒大师、国家标委会委员，全国食品工业科技杰出人才。主要从事发酵工程、传统白酒发酵微生物及其生态结构、功能微生物及其代谢、微生物代谢蛋白质组学、白酒风味化学组学、白酒机械化酿造、智能化酿造、酒体功能化合物结构及其饮酒的健康干预研究。承担《白酒工艺学》、《酒体设计与白酒品评》、《酒类风味化学》等课程教学。主持国家基金、省重大专项及产学研合作项目30余项，发表SCI、EI等收录论文150多篇，主编、参编专著7 部，制定发布标准12 件，获国家发明专利6 件，获国家级、省部级科学技术奖3 项，行业省部级科学技术奖10余项。理论结合实践，在全国首创清酱香型白酒酿造技术体系，酿造人民小酒得到全国消费者青睐，成为脱贫攻坚、乡村振兴典型案例。
本文《黑色型高温大曲在固态发酵过程中的微生物群落及风味化合物演替驱动机制 》来源于《食品科学》2024年45卷第23期102-112，作者：邓阿玲，唐杰，朱楚天，黄永光* 。 DOI :10.7506/spkx1002-6630-20240507-027 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办“第十二届食品科学国际年会”。本届年会将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。
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