果聚糖是由多个D-呋喃果糖聚合而成的一种天然高分子多糖，广泛存在于草本及禾本科植物中。根据果糖基之间糖苷键类型的差异，果聚糖主要分为菊粉型、Levan型和混合型3 类。果聚糖具有优良的理化性质，作为一种天然可溶性膳食纤维，不同聚合度的果聚糖在功能上存在差异，高聚合度果聚糖（
n＞10）可以用来制作代脂产品，而低聚果糖（2＜
n≤10）热量低、甜度适中，是各种功能食品中常用的甜味剂。果聚糖具有优异的理化性质和突出的生理活性，作为一种天然、安全的食品添加剂和非淀粉多糖，已被广泛应用于食品、医药、农业和其他工业领域。
尽管添加果聚糖可以有效改善食品多方面的品质，但果聚糖食品也会给特定人群带来一些不良的影响。 虽然人体消化道中缺少降解果聚糖的糖苷水解酶，但这类酶在乳酸菌，尤其是乳杆菌中比较常见。结果表明，不同乳酸菌的果聚糖代谢能力存在明显不同的底物专一性和菌株特异性，并且这些差异与不同乳酸菌果聚糖酶和代谢机制直接相关。
黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心孙大庆、齐贺、李洪飞*等人以嗜果聚糖乳酸菌为研究对象，利用高通量测序和生物信息学技术，在全基因组水平解析乳酸菌果聚糖代谢途径和关键基因，探究乳酸菌果聚糖代谢机制，期望为阐明乳酸菌果聚糖代谢机制提供科学、有效的理论参考和实验依据，为今后低果聚糖功能食品的开发和应用提供优质的菌种资源。
1 嗜果聚糖乳酸菌的筛选和鉴定
由图1a可知，大多数乳酸菌分离株在菊粉作为唯一碳源的IMB培养基中不能生长，只有32 株乳酸菌能够在IMB培养基中正常生长。由图1b可知，32 株乳酸菌果聚糖利用率明显不同，6 株乳酸菌的果聚糖利用率超过60%，其中乳酸菌19M03的果聚糖利用率最高（（75.82±0.81）%）且显著高于其余31 株乳酸菌（
P＜0.05），因此选择菌株19M03作为嗜果聚糖乳酸菌进行全基因组测序和果聚糖代谢机制解析。
2 乳酸菌19M03基因组基本特征
乳酸菌19M03经二代和三代高通量测序和数据联合组装，获得1个完整闭合的染色体基因组（Accession number CP159363）和9个成环质粒基因组（Accession number CP159364～CP159372）。19M03全基因组图谱见图2。乳酸菌19M03基因组序列全长为3 246 316 bp，GC相对含量为44.53%，包含3 084个编码基因、66个tRNA和16个rRNA，编码基因占全基因组83.02%，编码基因平均长度为873.92 bp（表2）。与NCBI数据库中
Lactiplantibacillus plantarum参考菌株WCSF1基因组（3 308 273 bp，NC_004567.2）相比，菌株19M03基因组全长略小，GC相对含量一致，但编码基因数量略高于WCSF1（3 052个编码基因），这些结果初步证明19M03基因组测序结果的有效性和完整性。
3 乳酸菌19M03系统分类
为了揭示乳酸菌19M03与其他乳酸菌的系统发育关系，确定它的系统分类地位，基于16S rRNA和31个看家基因序列构建了乳酸菌19M03的16S rRNA基因发育树和核心基因组发育树（图3）。由图3a可知，根据16S rRNA基因发育树的进化关系，乳酸菌19M03同时与
L. plantarumGCF014131735.1和
L. pentosusGCF003641185.1的遗传距离和亲缘关系最近，聚类在同一分支上，表明16S rRNA基因发育树可以在物种水平将乳酸菌19M03分类为
L. plantarum
L. pentosus，但不能明确分类为单一物种。由图3b可知，基于核心基因组发育树的拓扑结构，乳酸菌19M03与
L. plantarumGCF014131735.1的遗传距离和亲缘关系最近，聚类在同一分支，而与
L. pentosusGCF003641185.1不再聚类，表明核心基因组发育树可以在物种水平明确将乳酸菌19M03分类为
L. plantarum物种。因此，上述结果证明乳酸菌19M03在分类上属于植物乳植杆菌
Lactiplantibacillus plantarum（原名植物乳杆菌
Lactobacillus plantarum） 。
4乳酸菌19M03基因功能注释
对预测得到的3 084个编码基因通过NR、Swiss-Prot、Pfam、COGs、GO和KEGG数据库进行功能注释和分类（表3和图4）。由表3可知，有3 077个编码基因在NR数据库被注释，Swiss-Prot数据库中注释的编码基因数量为2 214个，在Pfam、COGs、GO、CAZy、KEGG数据库被注释的编码基因数量分别为2 545、2 466、1 996、103个和2 190个。
4.1 COGs功能注释和分类
菌株19M03的COGs数据库注释信息见图4a，19M03基因在COGs数据库共注释到23个功能分类中，其中基因数量前3的功能分类分别是转录259个、碳水化合物转运和代谢258个、氨基酸转运和代谢225个，分别占注释基因总数的10.50%、10.46%和9.12%。由于注释到碳水化合物转运和代谢功能分类的258个基因很可能参与19M03的果聚糖代谢，因此选择这些基因进行后续分析。
4.2CAZy功能注释和分类
菌株19M03在CAZy数据库的注释结果见图4b。菌株19M03共注释到103个碳水化合物活性酶，其中糖苷水解酶基因42个，在4个分类中数量最多。由于这些糖苷水解酶基因很可能直接参与19M03果聚糖水解代谢，因此选择这42个基因进行后续分析。
4.3GO功能注释和分类
菌株19M03在GO数据库的注释信息见图4c。GO数据库一级功能分类分子功能、细胞组成和生物过程中分别有1 639、973、971个基因被注释。在二级功能分类中，磷酸烯醇式丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统、碳水化合物代谢过程、跨膜运输、碳水化合物的运输和碳水化合物衍生物的代谢分别注释到41、38、36、12个和6个基因。由于以上5个二级功能分类很可能参与19M03的果聚糖代谢，因此选择这些基因进行下一步分析。
4.4 KEGG功能注释和分类
菌株19M03在KEGG数据库的注释结果如图4d所示。在KEGG数据库一级功能分类代谢、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、细胞过程和生物系统中分别注释到1 654、245、182、126、102个和44个基因。在二级功能分类中，与碳水化合物代谢的相关基因241个，与多糖合成与代谢的相关基因有86个，与跨膜运输相关的基因有164个。由于以上327个和164个与碳水化合物代谢的相关基因很可能参与19M03的果聚糖代谢，因此选择这些基因和代谢通路进行19M03果聚糖代谢模型分析。
5 乳酸菌19M03果聚糖代谢模型预测
通过基因功能注释和分类分析，在COGs、GO、KEGG、CAZy数据库中共发现538个和490个基因分别与碳水化合物代谢和转运相关，去除冗余后剩余357个和351个基因，其中与果聚糖代谢和转运相关的基因均有12个，根据这些基因在KEGG数据库中的代谢和转运关系提出菌株19M03果聚糖代谢模型（图5）。
由图5可知，菌株19M03编码2个果聚糖-
-果糖苷酶FruA（gene0605、gene2230）。蛋白质结构分析发现， FruA 2230 含有信号肽和跨膜结构域，而 FruA 0605 同时缺失这两个结构，表明菌株19M03的果聚糖水解过程可以在细胞内外同时发生：在细胞外，果聚糖由 FruA 2230 催化水解反应生成低聚果糖和 D -果糖；在细胞内，低聚果糖由 FruA 0605 催化水解反应生成D-果糖。与此同时，在菌株19M03细胞膜的磷酸转移酶系统中发现存在1个低聚果糖特异转运蛋白复合体 IIABC FOS 和2个果糖特异转运蛋白复合体IIABCDfru 和 IIABC fru ，低聚果糖特异转运蛋白的存在进一步支持上述观点，即果聚糖水解过程可以在19M03细胞内外同时进行。
由图5还可以看出，果糖进入19M03细胞后存在2个代谢流方向：1）果糖分解代谢，即果糖通过甘油醛-3-磷酸进入糖酵解途径和三羧酸循环；2）果糖合成代谢，即果糖转化为D-甘露糖后进入氨糖和核糖合成代谢。在代谢流①中，果糖可以通过4个分支途径进入糖酵解途径。首先果糖在果糖激酶ScrK（gene0157）催化下转化成果糖-6-磷酸，其次果糖-6-磷酸在6-磷酸果糖激酶PfkA（gene1470）催化下生成果糖-1,6-二磷酸，最后果糖-1,6-二磷酸可以在果糖-1,6-二磷酸醛缩酶FbaA（gene0289）催化下转化成甘油醛-3-磷酸。与此同时，果糖也可以在果糖-1-磷酸转移酶FruB（gene0470）催化下直接生成果糖-1-磷酸，果糖-1-磷酸再通过3个分支途径转化成甘油醛-3-磷酸。在代谢流②中，果糖首先在果糖激酶ScrK催化下转化成果糖-6-磷酸，其次果糖-6-磷酸在甘露糖-6-磷酸异构酶ManA（gene1892）催化下转化为甘露糖-6-磷酸，之后甘露糖-6-磷酸在甘露糖-6-磷酸转移酶ManXa（gene0469）催化下生成甘露糖，最后甘露糖进入氨糖与核糖代谢途径。整体而言，在19M03果聚糖代谢模型中，根据果聚糖代谢途径中功能不可替代性，基因
fruA
scrK
pfkA
fbaA
manA
manXa在果聚糖代谢过程中扮演着不可缺少的催化作用，因此推测这6个基因是菌株19M03果聚糖代谢的关键基因。为进一步分析这6个基因的功能作用，对
L. plantarum参考菌株WCFS1基因组的编码基因进行了检索和比对分析，结果发现参考菌株WCFS1只含有基因
pfkA
manA，而缺失其他4个关键基因。基因
fruA的缺失表明WCFS1不具有果聚糖水解能力，其他3个基因的缺失表明WCFS1不具有19M03类似的果糖代谢途径。这些结果表明19M03果聚糖代谢途径和能力不是所有
L. plantarum共有的功能，而是菌株特异的。
总之，19M03果聚糖代谢模型明确解析了果聚糖水解过程及其催化反应的细胞定位（既可胞内，又可胞外）、细胞膜中运输低聚果糖和果糖的特异转运蛋白（IIABCFOS、IIABCDfru、IIABCfru）、细胞内果糖分解代谢途径（
n＝4）和果糖合成代谢途径（
n＝1）及其所有相关酶的编码基因，表明19M03可以通过多种方式和途径对果聚糖进行水解、运输、分解代谢和合成利用，因此这些结果在全基因组水平上清晰的揭示了19M03复杂的果聚糖代谢过程、代谢途径和关键基因，解释了19M03嗜果聚糖表型的原因，阐明了19M03果聚糖代谢机制。
6乳酸菌19M03可移动原件
在细菌漫长的进化过程中，为能适应生存环境的变化以及增强自身的竞争力，它们通常会摄入一些外源的具有特定功能（例如耐药基因、毒力基因、碳水化合物代谢基因等）的DNA片段，从而抵抗环境胁迫或占据更有利的生态位。在此过程中不同细胞之间可传递遗传信息的DNA片段统称为可移动元件 。
6.1基因组岛
经预测分析，菌株19M03基因组中共发现10个基因岛结构 ，这些基因岛大小5.6～50.5 kb，共编码197个功能基因（表4），其中33个基因与碳水化合物的代谢相关，存在1个与果聚糖代谢的相关基因（gene2800）。这些结果表明，菌株19M03经历过比较复杂的演化过程，获得较多的基因岛和大量的外源基因，其中33个碳水化合物的代谢功能基因改变19M03的底物利用能力和表型。
6.2 前噬菌体
预测分析结果（表4）显示，菌株19M03只含有1个前噬菌体，长度为28 139 bp，GC相对含量44.98%，包含39个编码基因，其中1个基因（gene1916）与碳水化合物代谢的相关。
6.3 CRISPR-Cas系统
CRISPR和Cas蛋白可以组成一种原核生物的免疫系统，该系统能够识别外源DNA并沉默其基因表达，可以用于抵御外源DNA 。利用Minced进行Crispr-Cas的预测，由表4可知，
L. plantarum19M03中共计预测到4个CRISPR-Cas序列，序列长度在109～696 bp之间，共包含17个重复序列，重复序列长度在34～38 bp之间，间隔序列长度在30～83 bp之间。结果表明菌株19M03在进化过程中经受过外源DNA或质粒及噬菌体的入侵，已经进化出比较健全的先天免疫机制。
6.4 质粒
质粒是染色体外能够独立复制的遗传元件。由于质粒具有自我复制和不同细菌之间基因水平转移的能力，因此它们在细菌进化和基因工程改造中扮演着重要的载体作用。由表5可知，乳酸菌19M03共含有9个质粒，长度在1 769～71 895 bp之间，GC相对含量为35.97%～42.57%，共编码298个基因，这可能是目前报道的质粒数量最多的
L. plantarum。利用BLAST-P在线软件进行Rep同源序列检索和保守结构域鉴定，发现6个质粒具有已知的Rep蛋白和复制机制，除p19M03I为RCR复制类型外，其余5个质粒均为Theta型复制，另外3个质粒分类和复制类型尚不清晰，推测可能含有新的复制元件和机制。这些结果表明，
L. plantarum19M03含有非常丰富的质粒及其外源基因，它们赋予19M03广泛且灵活的环境适应能力，其中小型质粒为今后19M03基因工程改造提供了天然的克隆和表达载体基础。
7 乳酸菌19M03安全性
7.1 抗生素耐药基因
为了从抗生素耐药基因传播风险评估菌株19M03的安全性，分别利用CARD和ResFinder数据库对19M03所有预测基因进行同源性比对分析。结果显示，菌株19M03在CARD和ResFinder数据库均没有注释到已知的抗生素耐药基因，这表明菌株19M03不含有高同源性的抗生素耐药基因，传播耐药基因的安全性风险很小。
7.2 毒力基因
为了从致病性评估菌株19M03的安全性，分别利用VFDB和PHI数据库对19M03所有预测基因进行同源性比对分析。结果显示，菌株19M03在VFDB数据库没有注释到已知的毒力基因，而在PHI数据库注释到2个相似的冷休克蛋白CspR（PHI ID：2971）编码基因gene0772和gene0903，它们可以引起飞蛾和啮齿动物感染性疾病，且基因突变会引起毒力减弱，表明这2个基因对人类具有潜在的致病性。总之，致病性分析结果表明，除了基因gene0772和gene0903之外，菌株19M03不含有已知的毒力基因，致病性风险较小，而基因gene0772和gene0903是否具有致病表型需要进一步体内研究验证。
结论
本研究首先通过对287 株乳酸菌果聚糖利用能力筛选，获得1 株嗜果聚糖乳酸菌19M03。其次，通过高通量测序技术获得菌株19M03完整的基因组遗传信息。16S rRNA基因和核心基因组系统发育树结果表明，菌株19M03在分类上属于植物乳植杆菌物种。根据果聚糖代谢和转运相关基因在KEGG数据库中的代谢关系，提出19M03果聚糖代谢模型。该模型在全基因组水平上揭示了19M03的果聚糖代谢过程、代谢途径和关键基因，解释了19M03嗜果聚糖表型的原因。最后，利用多种生物信息学软件和数据库分析了19M03的可移动元件和安全性。总之，本研究获得了1 株嗜果聚糖
L. plantarum19M03，在全基因组水平揭示了19M03果聚糖代谢机制，这些结果可为乳酸菌果聚糖代谢研究提供重要的理论基础，为今后低果聚糖功能食品的开发和应用提供优质的功能发酵剂菌种资源。
作者简介
第一作者：
孙大庆，博士，副研究员，硕士研究生导师，自2008年以来一直从事食品微生物与生物技术方向的科研工作。近年来，主持或参与完成国家重点研发计划2 项、国家星火计划2 项、国家青年科学基金1 项、黑龙江省青年科学基金1 项，横向课题4 项，其他各类课题16 项；发表学术论文 6 0余篇，其中SCI或EI收录13 篇；出版学术专著2 部；授权发明专利14 项；获得黑龙江省高校科技一等奖1 项，黑龙江省农垦总局科技进步二等奖1 项，大庆市科技进步和科技成果三等奖各1 项。黑龙江省高层次人才称号。黑龙江省、四川省、天津市、山东省、广西、河北省科技项目和奖励评审专家。《Probiotics and Antimicrobial Proteins》、《World Journal of Microbiology and Biotechnology》《食品科学》《微生物学报》《微生物学通报》《生物工程学报》《现代食品科技》等期刊审稿专家。
本文《嗜果聚糖 Lactiplantibacillus plantarum 19M03 的筛选及全基因组测序分析》来源于《食品科学》2024年45卷第23期113-122页，作者：孙大庆 ，齐贺 ，邸子清 ，葛相麟 ，洪青平 ，杜新蕊 ，姚禹西 ，李洪飞。DOI:10.7506 / spkx1002-6630-20240512-089。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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