FSHW | 基于共价有机框架材料的凝乳酶检测新方法

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01

Introduction

奶酪是全球消费最多的乳制品之一，也是最为多样化的食品之一。奶酪富含蛋白质、钙、脂肪、磷和维生素，对人体健康有益。用凝乳酶（chymosin）作为凝固剂制作的奶酪称为凝乳酶奶酪。传统奶酪加工中使用的小牛凝乳酶来自小牛在出生的头几天在腹腔中分泌的特定凝固天冬酰蛋白酶。该酶专特异水解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106肽键，生成κ-酪蛋白大肽和对-酪蛋白。当足够的κ-酪蛋白水解时，对-酪蛋白聚集形成三维网状凝胶，促使酪蛋白胶束的聚集，导致酪蛋白胶束的不稳定和奶酪凝块的形成。因此，凝乳酶对κ-酪蛋白有不同的特异水解能力，对奶酪的成熟和最终质量有显著影响。另一方面，残留的凝乳酶被认为是奶酪软化的原因，因为它缓慢水解除了κ-酪蛋白以外的酪蛋白。因此，检测和定量凝乳酶对奶酪的制造和质量至关重要。已经发展出了其他一些技术，包括高效液相色谱、毛细管电泳、免疫层析法和质谱法等。然而，这些方法仍然存在一些缺点。虽然这些检测方法特异性强、灵敏度高，但检测过程繁琐、仪器设备要求高、需要专业人员操作，即时检测不便。因此，开发一种快速、简便、廉价的凝乳酶测定方法具有重要意义。

基于此, 云南大学化学科学与工程学院李灿鹏教授等针对凝乳酶检测方法中的不足，以凝乳酶为研究对象，利用超声处理合成了共价有机框架（COF），将其剥离成二维COF纳米片（COF NS）。然后，将金纳米颗粒（Au NPs）加载到COF NS上制备AuNPs/COF NS（Au@COF NS）。其次，罗丹明B（RhB）修饰的凝乳酶底物肽（Pep）与Au@COF NS连接，构建了Pep-Au@COF NS纳米复合物。在感测原理上，RhB的荧光被Au@COF NS猝灭，由于COF NS与Pep的RhB之间的荧光共振能量转移，荧光强度较弱。然而，在凝乳酶存在的情况下，由于凝乳酶对底物肽的特异性切割，导致RhB被释放，从而使荧光恢复。增加的荧光强度与凝乳酶浓度的增加成正比，因此构建了一种“turn-on”型的凝乳酶荧光传感器 (Fig.1)，实现对实际样品中凝乳酶的准确检测。

图1（A）COF-NS的合成和（B）凝乳酶荧光检测原理

02

Results and discussion

COF NS和Au@COF NS的形貌和结构表征

使用三(4-氨基苯基)胺（TAPA）和(4-甲酰苯基)胺（TFPB）的席夫碱反应合成并超声剥离后的COF NS，并将Au NPs加载到COF NS上制备Au@COF NS，通过电子显微镜（TEM、SEM）对COF NS和Au@COF NS进行了表征。COF NS主要呈现出柔性结构、片状层状形态（图2A）和纳米花状结构（图2B）。在将Au NPs加载到COF NS后，Au NPs的纳米颗粒（约16 nm）均匀分布在COF NS上，而且Au NPs并未影响COF NS的初始形态（图2C和D）。通过傅里叶红外光谱图（图3A）、X射线衍射（图3B）、以及X射线光电子能谱（图3C和D）的进一步研究，进一步证实了Au@COF NS的成功制备。

图2 COF NS和Au@COFNS

图3（A）TAPA（黑色）、TFPB（红色）和COF-NS（紫色）的FT-IR光谱。（B） XRD光谱Au@COFNS和COF NS。（C） XPS光谱Au@COFNS和COF NS。（D） 高分辨率Au 4f XPS光谱Au@COFNS。

制备凝乳酶传感器

使用罗丹明B作为荧光标记物，研究了COF NS的荧光淬灭能力。COF NS具有比大块COF更强的荧光淬灭能力，可用作荧光淬灭剂。COF NS出色的荧光淬灭能力可能归因于超声剥离后材料表面积的增加（图4A和B）。本研究中使用的Au@COF NS在约569 nm处展现了强烈的吸收峰（图5）。这个吸收带与Pep在580 nm处的发射重叠，暗示了Pep（给体）和Au@COF NS（受体）之间发生FRET。

图4（A）RhB、RhB+体COF和RhB+COF NS的荧光光谱和（B）淬灭率。插图：（I）RhB、（II）RhB+散装COF和（III）RhB+COF NS在日光和紫外线下的照片。（C） 不同浓度COF-NS的荧光淬灭率和（D）强度Pep-Au@COFNS和Pep-Au@COFNS+凝乳酶。

图5（A）RhB、Au NP和RhB+Au NP的荧光光谱。插图：（Ⅰ）RhB、（Ⅱ）Au NP和（Ⅲ）RhB+Au NP在日光和紫外光下的照片。（B） RhB、COF-NS的荧光光谱，Au@COFNS、RhB+COF NS和RhB+Au@COFNS。（C） RhB+Au NP、RhB+COF NS和RhB+的荧光淬灭率Au@COFNS。（D） Pep和Au@COFNS。紫外-可见吸收光谱Au@COFNS和Pep的荧光发射光谱。

荧光检测凝乳酶

在最佳的反应时间（50 min）和温度最佳温度（37 °C）下进行测试（图6A和B）进行了凝乳酶的测定。首先，建立了已知凝乳酶与增加的荧光强度之间的标准曲线。如图6C和D所示，随着凝乳酶浓度的增加，荧光强度恢复。增加的荧光强度与凝乳酶之间的线性关系如下所示：(F – F0)/F0 = 6.26 lgC（μg/mL）– 3.19（R2= 0.9902），检测限为20 ng/mL，其中F0和F分别是在无凝乳酶和有凝乳酶时的荧光强度。表1所示，传感器的回收率为95.6%~105.1%，相对标准偏差2.6%~5.2%。这一结果表明所构建的测定方法可用于实际样品中的凝乳酶检测。因此，本研究的测定方法可能适用于不同水平凝乳酶浓度的测定。

图6（A）通过测量归一化荧光强度的最佳孵育时间和（B）测定温度。（C） 不同浓度凝乳酶存在下溶液的荧光光谱。（D） 凝乳酶与荧光强度的校准图。

表1通过拟议的测定法测定商业凝乳酶样品中的凝乳酶

03

Conclusion

本文报道了一种基于COF NS通过特定肽作为底物进行荧光共振能量转移（FRET）的超灵敏荧光传感器，用于凝乳酶的检测。该传感器表现出更宽的线性范围和更低的检测限。所提出的传感器成功应用于商业凝乳中凝乳酶的定量测定，显示出卓越的灵敏度和令人满意的选择性，表明其在乳制品工业中进行准确检测凝乳酶的潜在应用前景。此外，COF NS可作为一种新型荧光淬灭剂，在荧光生物传感领域具有广泛的应用潜力。

第一作者简介

鲁小康，现就读于云南大学化学科学与工程学院，博士三年级，主要研究方面为纳米酶的制备与应用研究，目前以一作发表SCI论文2 篇，参与发表1 篇SCI论文。

通信作者简介

李灿鹏，博士、教授，云南大学化学科学与工程学院博士生导师，主要从事分析化学、材料化学和食品及生物安全检测方面的研究工作。在国际刊物上发表60多篇SCI论文，总影响因子超过200。论文被引用2 000次，H-指数为28。同时，在国家级出版社出版了3 部教材，其中主编2 部，副主编1 部。获得7 项中国发明专利。主持3 项国家自然科学基金，1 项国家科技支撑计划项目子课题，1 项云南省自然科学基金重点项目,和多项省级项目和横向项目。现为云南省中青年学术与技术带头人、昆明市中青年学术带头人、云南大学东陆学者、云南大学第三批青年英才培育对象、云南大学青年骨干教师。成功开发了新冠病毒、诺如病毒等的超敏电化学传感器。

赵卉，博士，研究员，云南生物资源保护与利用国家重点实验室硕士生导师，主要从事疾病分子机制研究和疾病相关生物标志物的检测。以第一作者或通讯作者身份发表SCI论文43 篇，累计影响因子超过140；主持科研项目11 项，其中主持国家自然科学基金项目4 项；作为主要参与人参与了包括科技部“973”、国家自然科学基金委-云南省政府联合资助项目等重大项目。入选云南省中青年学术和技术带头人、昆明市中青年学术和技术带头人、云南大学“青年英才培育计划”等人才培养项目。2020年1月，研发迄今唯一利用电化学生物传感器开展新冠病毒的检测技术，已申报国家发明专利（受理号：202010108629.3）。

A novel fluorescence sensor for milk clotting enzyme chymosin using peptide as substrate and covalent organic framework nanosheet as fluorescence quencher

Xiaokang Lua, Tianle Qia, Linjiang Guoa, Lin Xiaoa, Hanbin Xua, Guobao Ninga, Hui Zhaob,*, Canpeng Lia,*

a School of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China

b Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resource, Yunnan University, Kunming 650091, China

*Corresponding authors.

Abstract

Chymosin is one of the critical enzymes in cheese making. Herein, we proposed a novel fluorometric assay for chymosin determination. Firstly, covalent organic frameworks (COF) were synthesized and exfoliated to 2-dimensional COF nanosheets (COF NS) by ultrasound treatment. Gold nanoparticles (Au NPs) were loaded with COF NS to prepare AuNPs/COF NS (Au@COF NS). Secondly, rhodamine B (RhB) modified substrate peptide (Pep) for chymosin was linked with Au@COF NS to construct a Pep-Au@COF NS nanocomposite. For the sensing principle, fluorescence of RhB was quenched by Au@COF NS and the fluorescence intensity was weak due to the fluorescence resonance energy transfer between COF NS and RhB of Pep. However, in the presence of chymosin, the RhB was released by specific cleavage of the substrate peptide by chymosin and resulted in the recovery of fluorescence. The increased fluorescence intensity was proportional to the increase of chymosin concentration and thus a "turn on" fluorescent sensor for chymosin was constructed. The sensor showed a linear range in the concentration of 0.05-60.00 μg/mL for the detection of chymosin with a detection limit of 20 ng/mL. The sensor was used to quantify chymosin in rennet product with good selectivity, which has the potential applications in cheese manufacturing.

Reference:

LU X K, QI T L, GUO L J, et al. A novel fluorescence sensor for milk clotting enzyme chymosin using peptide as substrate and covalent organic framework nanosheet as fluorescence quencher[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3606-3613. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250042

文章翻译由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：AI生成

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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