撰文 | 风

免疫治疗如细胞过继疗法（adoptive cell therapy，ACT）和免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）给肿瘤治愈带来新的希望。CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答促进肿瘤细胞的清除。IFNγ可以通过促进抗原提呈和诱导细胞因子以及趋化因子的产生增强免疫细胞浸润并重塑肿瘤微环境（tumour microenvironment，TME）。因此，IFNγ信号通路对于ACT和ICB的免疫治疗成功至关重要。在大部分实体瘤中，免疫治疗并不能取得长期的效果，这部分与IFNγ通路相关基因的功能缺失突变有关【1,2】。目前仍不清楚大部分肿瘤细胞如何逃避免疫监视，靶向干预肿瘤细胞对IFNγ和CD8+ T细胞的细胞毒作用的耐受机制是诱导有效抗肿瘤效应和最大化肿瘤免疫治疗效果的关键。研究表明肿瘤细胞和免疫细胞之间的营养竞争和代谢交流诱导免疫逃逸【3-6】。靶向肿瘤代谢相关通路如氧化磷酸化和自噬可以促进抗肿瘤免疫【7,8】。然而，目前对肿瘤细胞介导免疫逃逸的分子或通路，尤其是代谢相关的分子和通路仍缺乏系统性理解。

近日，圣裘德儿童研究医院免疫系迟洪波团队在Nature上发表了文章VDAC2 loss elicits tumour destruction and inflammation for cancer therapy。该文章通过CRISPR筛选新的肿瘤免疫逃逸分子-VDAC2，靶向敲除VDAC2促进BAK激活诱导的细胞死亡和I型IFN反应介导的免疫活化，进而实现良好的抗肿瘤效果。

为了鉴定与肿瘤细胞免疫逃逸相关的重要代谢因子，作者基于B16-OVA和OT-I系统使用CRISPR-Cas9技术在体内和体外筛选3017个代谢相关的基因，分析发现在体内外免疫压力中均发现Vdac2是B16-OVA细胞免疫逃逸相关的重要基因。作者选取不同序列的靶向Vdac2的sgRNA序列以及选用M38-OVA细胞模型在体内外（肿瘤细胞与）进一步证实肿瘤细胞敲除Vdac2对OT-I T细胞杀伤更为敏感。敲除Vdac2也能改善肿瘤细胞的ICB治疗（anti-PD-1或anti-PD-L1）效果。此外，敲除Vdac2缓解转移瘤并显著延长生存期。考虑到TNFα不响应是ICB治疗的障碍，作者同时删除Vdac2和Tnfrsf1a发现Vdac2敲除也能改善TNFα不响应肿瘤细胞对ICB的治疗效果。总之，这些数据表明靶向VDAC2是克服肿瘤细胞免疫逃逸和增强抗肿瘤免疫应答的有效方法。

为了进一步阐释VDAC2缺失改善CD8+T细胞杀伤的机制，作者将Vdac2缺陷B16-OVA与perforin-、IFNγ-或TNF-缺失的OT-I T细胞共培养发现只有IFNγ缺失减弱VDAC2缺失引起的CD8+T细胞杀伤敏感性。与此同时，封闭抗体和Ifngr1联合敲除也进一步证实IFNγ而非TNFα诱导Vdac2缺失肿瘤细胞的死亡。机制上，Vdac2缺失并没有增强经典的IFNγ-STAT1信号通路，而是增加IFNγ诱导的caspase-3、caspase-7和GSDME的激活。同时，caspase-3、caspase-7或GSDME敲除均可以减弱Vdac2缺失引起的IFNγ杀伤作用。类似的，凋亡抑制剂而非铁死亡、坏死和焦亡抑制剂降低Vdac2缺失引起的IFNγ杀伤作用，提示VDAC2缺失促进IFNγ诱导的细胞凋亡和继发性坏死介导的细胞死亡。既往研究指出靶向PTPN通过增强IFNγ通路改善免疫治疗。相比于任何单一基因缺失，同时敲除PTPN和VDAC2进一步增强IFNγ诱导的细胞死亡，提示PTPN和VDAC2是联合治疗的有效分子靶点。

随后，作者使用scRNA-seq分析VDAC2缺失对B16-OVA肿瘤的免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）细胞的影响。scRNA-seq和流式细胞术均发现VDAC2缺失显著促进免疫细胞中CD8+T细胞浸润，尤其增加CD8/Treg比例。与此同时，VDAC2缺失改善浸润CD8+T细胞的效应功能，表现为克隆扩增和效应分子（IFNγ、TNFα和GZMB）表达增加以及耗竭T细胞比例降低。另外，数据库分析表明人多种肿瘤VDAC2表达水平与炎症和T细胞相关基因特征有关。因此，肿瘤细胞VDAC2缺失重塑TME，尤其激活CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。IFNγ中和抗体处理显著抑制VDAC2缺失引起的免疫细胞浸润和CD8+T细胞效应功能，导致肿瘤控制效果减弱，说明IFNγ介导VDAC2缺失时TME的重塑。scRNA-seq分析表明免疫细胞中的CD8和NK细胞IFNγ表达最多，但CD8 T细胞数量最多。CD8 T细胞IFNγ敲除出现IFNγ中和抗体类似的表型，提示CD8+T细胞来源IFNγ介导VDAC2缺失的TME重塑。

scRNA-seq分析以及VDAC缺失B16-OVA经IFNγ处理的转录组测序均发现I型IFN反应增强。IPA分析也表明STING、IRF3和IRF7活性增加。WB也证实IFNγ显著上调VDAC缺失细胞STING及其磷酸化、TBK和IRF3的磷酸化水平，提示VDAC2限制IFNγ诱导的STING活化。值得注意的是，同时敲除VDAC2和STING相关基因（Cgas、Sting1或Irf3）虽然显著降低I型IFN反应但并不影响IFNγ引起的VDAC2缺失细胞死亡表型。考虑到VDAC2是线粒体蛋白，作者假设VDAC2缺失促进线粒体DNA释放诱导STING通路激活。实验证实IFNγ显著促进VDAC2缺失细胞中mtDNA的堆积。肿瘤细胞缺失mtDNA（ρ0）抑制IFNγ诱导的VDAC2敲除细胞STING活化。总之，异常胞质线粒体DNA介导IFNγ诱导的VDAC2敲除细胞cGAS-STING和I型IFN反应。

为了进一步鉴定VDAC2缺失对IFNγ诱导细胞死亡敏感性增强的机制，作者在VDAC缺失B16-OVA细胞中再次行CRISPR筛选，结果发现靶向Casp9和Bak1（编码BAK）敲除在缓解VDAC2缺失介导的肿瘤细胞死亡的效果最好。BAK和BAX通过促进线粒体外膜渗透和细胞色素c释放调节线粒体依赖的细胞死亡。敲除Bak1而非Bax抑制IFNγ在VDAC2缺失肿瘤细胞诱导的细胞死亡。此外，敲除Bak1抑制IFNγ在VDAC2缺失肿瘤细胞诱导的胞质mtDNA堆积和cGAS-STING活化。机制上，VDAC2可以直接结合并抑制BAK。VDAC2缺失促进BAK的异常激活，尤其是在IFNγ刺激时，引起下游线粒体外膜渗透增高以及细胞色素c的释放。突变对于与BAK结合的VDAC2重要位点可以模拟BAK联合敲除表型，提示VDAC2与BAK结合在抑制IFNγ刺激的重要性。在体内，Bak1和VDAC2联合敲除显著逆转VDAC2敲除引起的抗肿瘤表型。令人振奋得是，IFNγ并不能在VDAC2缺失的正常细胞诱导细胞死亡，这种不同可能与IFNγ在正常细胞和转化细胞引起的BIM、BID和BAK表达差异有关。总之，VDAC2敲除具有良好的抗肿瘤临床转化价值。

综上所述，这项研究通过CRISPR筛选技术鉴定VDAC2作为介导肿瘤细胞免疫逃逸的关键分子，靶向VDAC2诱导肿瘤细胞对CD8+ T细胞和IFNγ治疗的敏感性。机制上，VDAC2缺失促进BAK激活导致细胞色素c和mtDNA释放，分别诱导细胞死亡和cGAS-STING激活介导的免疫活化。该研究为肿瘤的免疫逃逸和免疫治疗提供新的理解和靶点。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08732-6

制版人： 十一

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