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Abstract

乳酸菌属有益于预防或治疗溃疡性结肠炎（UC）。在这项研究中，招募了153名遵循纯素食、杂食性或高肉饮食的参与者。粪便中乳酸菌群落的成分分析表明，发酵乳杆菌菌株受饮食的显著影响。与杂食动物和高肉消费者相比，来自素食者的混合发酵乳杆菌菌株的给药显著改善了炎症，结肠组织损伤显著减少，炎性细胞因子改善，ZO-1、occludin和claudin-3的表达增强，以及短链脂肪酸浓度的显著增加。单一菌株的发酵乳杆菌的效果与混合菌株的发酵乳杆菌组的效果相似。基因组分析表明，来自素食者肠道的发酵乳杆菌菌株比来自杂食动物和高肉食者肠道的基因具有更高的参与碳水化合物分解代谢的基因的流行率。特别是，ME2基因参与乙酸盐的生物合成，乙酸盐是一种被认为具有抗炎特性的化合物。总之，这项研究表明，受习惯性饮食的影响，发酵乳杆菌菌株缓解小鼠UC的能力存在菌株特异性差异。

Introduction

溃疡性结肠炎（UC）是一种普遍的破坏性肠道炎症性疾病，其特征是慢性和复发。UC会引起腹痛、腹泻和直肠出血等症状，这些症状通常会让患者感到痛苦。目前用于治疗UC的常见药物包括萨拉磺草胺吡啶、氨基水杨酸和糖皮质激素。然而，它们的持续给药可能会对人类造成各种不利影响。因此，确定新的和更安全的UC治疗方案一直是最近研究的目标。

UC的确切病因和机制尚不清楚；然而，饮食已被广泛研究为一个重要的影响因素。流行病学证据表明，食用高脂肪和高蛋白饮食与UC风险增加有关，而富含水果和蔬菜的植物性饮食被认为是防止UC复发的保护因素。此外，肠道微生物在UC的发生和发展中也起着关键作用。大量研究表明，可以通过适量摄入益生菌和调节肠道微生物群来治疗UC。乳酸菌是最常用的益生菌，被认为具有预防和辅助治疗UC的巨大潜力。据报道，一株干酪乳杆菌及其代谢物可以缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）通过NLRP3-(Caspase-1)/白细胞介素-1β（IL-1β）通路诱导的小鼠UC症状。此外，另一项研究报告称，从人类粪便样本中分离的发酵乳杆菌菌株可以通过调节免疫反应和改变肠道微生物群的组成来有效缓解小鼠的UC症状。

饮食是影响肠道微生物的最重要因素之一，习惯性饮食不仅塑造肠道微生物群，还影响肠道微生物群内执行潜在不同功能的基因组变异。高膳食纤维的给药可促进普普雷沃氏菌属中有益代谢物（例如短链脂肪酸（SCFAs））的产生，从而改善葡萄糖代谢和抗炎作用，并被认为与宿主健康呈正相关。相比之下，在高脂肪饮食的人群中，普雷沃氏菌属与某些炎症性疾病、葡萄糖耐量差和胰岛素抵抗有关。这些研究表明，饮食可以驱动肠道菌株的功能多样性。然而，饮食干预如何调节乳酸菌并进一步影响宿主健康仍不清楚。

在这里，通过确定具有不同习惯饮食的个体肠道中的乳酸菌种类和菌株是否转化为UC的调节功能来解决这个问题。在这项研究中，首先分析了纯素食、杂食和高肉饮食人群粪便样本中的微生物群，并观察到发酵乳杆菌物种对饮食变化有明显的反应。对发酵乳杆菌菌株进行了大规模分离筛选，以确定其在调节DSS诱导的小鼠结肠炎中的作用。最后，进行基因组分析以鉴定可能导致发酵乳杆菌菌株抗炎作用差异的特定基因。

Results

肠道中乳酸菌的组成与习惯性饮食有关

分析了153名中国素食者（V，n＝51）、杂食性（O，n＝56）和高肉食者（HM，n＝46）的肠道乳酸菌groEL基因。参与者的平均年龄为（42.1±1.6）、（37.5±1.5）和（37.5±1.6）岁，体质量指数（BMI）分别为（20.01±0.43）、（20.48±0.41）和（21.98±0.27）kg/m2。在纯素食、杂食和高肉饮食组之间未观察到年龄、性别或BMI的显著差异。

为了测试乳酸菌的组成是否与习惯性饮食有关，使用groEL基因对乳酸菌进行了物种水平的分类鉴定。通过Shannon指数和Chao1指数估计的V和O中乳酸菌群落的α多样性指标显著高于HM，而在V和O中未观察到显著差异（图1A）。 这表明V和O中乳酸菌群落的丰富度高于HM。此外，还研究了地理区域和年龄对乳酸菌群落α多样性的影响，它们之间没有观察到显著的相关性（图1B和C），因此表明地理区域和年龄不是影响乳酸菌群落组成的主要因素。使用主坐标分析（PCoA）分析习惯性饮食对乳酸菌群落β多样性的影响。所有3个饮食组中微生物种群β多样性的测量彼此显著不同（P＜0.006），如PCoA图上的单独聚类所反映的那样（图1D）。

乳酸菌群落分析共产生736964个高质量序列，并通过用97%的序列相似性阈值划分每个OTU获得79044个作分类单元（OTU）。在所有样品中鉴定了65种乳酸菌属OTU，其中13种OTU的相对丰度（Ra）大于1%，占乳酸菌属（核心乳酸菌，图1E）总OTU的80%以上。随着过渡时发酵乳杆菌丰度的降低，规则和显著（P＜0.05）物种的变化模式观察到从植物性饮食（V）到动物性饮食（O）（V，Ra＝9.79%；O，Ra＝1.59%；HM，Ra＝0.60%；图1F）。考虑到微生物群的组成主要取决于饮食因素，推测从具有不同饮食习惯的个体中分离的发酵乳杆菌菌株可能表现出功能差异并依赖于饮食习惯。

联合发酵乳杆菌菌株改善DSS诱导的小鼠UC

为了检查来自V、O和HM的发酵乳杆菌菌株在结肠炎中的作用并排除个体菌株差异的干扰，用混合发酵乳杆菌系统处理DSS诱导小鼠（来自V、O和HM的10个随机选择的菌株筛选发酵乳杆菌）7 d。与未诱导的小鼠相比，用DSS诱导的小鼠发展为严重的结肠炎，这反映在体质量显著降低（图2A）、更高的DAI（图2B）和更短的结肠长度（图2C）上。然而，相对于DSS诱导的小鼠，在实验组补充混合发酵乳杆菌菌株后，这些生理指标开始在不同程度上正常化，其中VM组的改善最为显著（图2A-C）。组织病理学显示DSS诱导小鼠的结肠表现出结肠炎的多种特征，包括炎性细胞浸润、黏膜糜烂、炎症、杯状细胞减少和严重溃疡。在VM组小鼠中观察到肠道损伤显著减少和结肠上皮结构完整性改善（图2D）。此外，RT-PCR检测结果表明，与DSS诱导小鼠相比，VM组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-3）和MUC2的基因表达水平显著增加，而只有OM和HMM组小鼠对claudin-3表达发挥显著的促进作用（图2E）。通过ELISA定量结肠组织细胞因子水平。在DSS诱导的小鼠中，肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6和IL-1β水平升高，IL-10水平降低。与DSS诱导的小鼠相比，VM、OM和HMM组的TNF-α和IL-6水平显著降低，但IL-1β未观察到显著降低（图2F）。此外，与DSS诱导的小鼠相比，仅在VM组小鼠中显著诱导IL-10分泌（图2F）。这些结果表明，混合发酵乳杆菌菌株在DSS诱导的结肠炎中起姑息作用，VM组小鼠表现出更显著的效果。

为了揭示补充发酵乳杆菌菌株诱导的SCFA变化，检测了VM、OM和HMM组小鼠粪便样本的SCFA。与对照组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠粪便中的乙酸盐和丁酸盐含量显著降低（图2G）。与DSS诱导的UC小鼠相比，补充混合发酵乳杆菌菌株显著增加了VM、OM和HMM组小鼠的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的产生水平。

单一发酵乳杆菌菌株改善小鼠DSS诱导的结肠炎

观察到混合发酵乳杆菌菌株，特别是给予VM组小鼠的菌株，减轻了结肠炎症状，因此能够测试单个发酵乳杆菌菌株是否在缓解UC方面发挥类似的效果。为此，测试了从每种饮食的个体中随机选择的单个发酵乳杆菌菌株对小鼠结肠炎的影响（来自素食者的发酵乳杆菌C16M4，来自杂食动物的发酵乳杆菌Z28M1和来自高肉食者的发酵乳杆菌R2M2）。DSS诱导的结肠炎小鼠表现出更严重的结肠炎症状，体质量减轻、DAI评分和结肠长度缩短，而对照组保持健康，体质量稳定。相对于DSS诱导的小鼠，发酵乳杆菌菌株C16M4处理显著改善了这些生理指标，但在Z28M1和R2M2处理的组中没有改善（图3A-C）。有显著增加接受C16M4和Z28M1的小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-3的表达水平，与DSS诱导的小鼠相比，它们在接受R2M2的小鼠中没有显著升高（图3D）。DSS处理提高了TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，而C16M4和Z28M1处理显著降低了这些水平。此外，IL-10分泌显著增加与DSS诱导的小鼠相比，C16M4和Z28M1的响应没有观察到响应R2M2的显著降低（图3E）。还测量了VS、OS和HMS组小鼠粪便样本中的SCFAs。如图3F所示，与对照组相比，用DSS处理的小鼠粪便中的乙酸盐和丁酸盐含量显著降低。与DSS诱导的小鼠相比，接受发酵乳杆菌菌株的小鼠表现出乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的产生显著增加。

发酵乳杆菌菌株功能基因的差异分析

为了进一步研究习惯性饮食是否影响发酵乳杆菌菌株的功能基因，使用比较基因组方法在基因水平上分析了发酵乳杆菌菌株的核心和功能基因。如图4A所示，共鉴定出4371个基因家族，包括1228个独特基因（仅存在于特定菌株中的基因）、3143个辅助基因（至少2个菌株共享的基因）和1410个核心基因（每个菌株中至少存在一个拷贝数的基因）。在各菌株的基因组中，核心基因约占总基因的74%，可变基因约占1.5%。为了探究发酵乳杆菌菌株是否在功能基因方面适应不同的习惯性饮食，将直系同源基因分为KEGG功能类别。对KEGG功能基因进行主坐标分析。如图4B所示，发酵乳杆菌菌株的功能基因独立簇为由不同的饮食来源形成，这表明有是来自不同日粮个体的发酵乳杆菌菌株功能基因之间的显著差异。这些基因对应于KEGG的36个功能类别，其中2个最丰富的基因类别与碳水化合物和氨基酸代谢有关（图4C）。接下来，分析了3组发酵乳杆菌菌株的KEGG功能基因，差异显著。共鉴定出16个基因，在其他次生代谢产物的生物合成、碳水化合物代谢、多糖的生物合成和代谢、氨基酸代谢等主要基因类别中存在显著差异。其中，与碳水化合物代谢相关的基因在纯素食、杂食性和肉食性发酵乳杆菌菌株中表现出显著降低的特征，而与氨基酸代谢相关的基因则相反。为了进一步验证，使用了碳水化合物活性酶（CAZy）数据库来识别发酵李斯特菌泛基因。与O和HM相比，糖苷水解酶（GH）家族在V中显著富集，在糖基转移酶（GT）和碳水化合物酯酶（CE）家族中未观察到差异（图4D和E）。

使用Kruskal-Wallis秩和检验进一步分析来自不同饮食来源的发酵乳杆菌菌株的所有KEGG功能基因，共观察到25个基因存在显著差异（图4F）。特别是，K00027（苹果酸脱氢酶）与碳水化合物代谢相关，并且在V中表现出更高的患病率（图4F和G）。此外，与V中的水平相比，与氨基酸代谢相关的基因，包括K01703、K00052、K01750和K01687（3-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸脱氢酶、鸟氨酸环脱氨酶和二羟基酸脱水酶）在O和HM中富集（图4F）。K00027（ME2，EC1.1.1.38）是一种苹果酸酶，可将苹果酸代谢为丙酮酸，产生乙酰磷酸酯，最后转化为乙酸盐（图4H）。基于上述结果，纯素饮食可能会选择富含基因ME2的发酵乳杆菌菌株，这可能会导致纯素食者的发酵乳杆菌菌株中乙酸盐合成更强。

验证发酵乳杆菌菌株中ME2对乙酸盐生产的体外影响

测量了来自V、O和HM的发酵乳杆菌菌株的体外SCFA产量（图5A），观察到来自V的发酵乳杆菌菌株的乙酸盐产量显著高于O和HM的产量（P＝0.002）（图5B）。结合基因型和表型研究结果表明，来自素食主义者的发酵乳杆菌菌株表现出更强的乙酸盐生产能力。

Conclusion

本研究表明受习惯性饮食影响，发酵乳杆菌缓解小鼠UC能力的菌株特异性差异，并且发酵乳杆菌菌株从素食者中分离出来是最有效的。因此，在研究某些微生物物种与疾病之间的关系时，不能忽视微生物菌株水平的个体差异。

Ameliorative effects of Lactobacillus fermentum isolated from individuals following vegan, omnivorous and high-meat diets on ulcerative colitis in mice

Qingsong Zhanga,b, Wei Xiaoa,b, Leilei Yua,b, Fengwei Tiana,b, Jianxin Zhaoa,b,*, Hao Zhanga,b,c,d, Wei Chena,b,c, Qixiao Zhaia,b,*

a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

c National Engineering Research Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

d Wuxi Translational Medicine Research Center and Jiangsu Translational Medicine Research Institute Wuxi Branch, Wuxi 214122, China

*Corresponding author.

Abstract

Lactobacillus spp. can be beneficial for the prevention or treatment of ulcerative colitis (UC). In this study, 153 participants who followed vegan, omnivorous, or high-meat diet were recruited. Compositional analysis of the Lactobacillus community in feces revealed that Lactobacillus fermentum strains were significantly affected by diet. Administration of mixed L. fermentum strains from vegans significantly improved inflammation compared to that from omnivores and high-meat consumers, as evidenced by a significant reduction in colonic tissue damage, improvement in inflammatory cytokines, enhanced expression of ZO-1, occludin, and claudin-3, and a significant increase in short chain fatty acids concentration. The effect of a single strain of L. fermentum was similar to that of a mixed strains of L. fermentum group. Genomic analysis suggested that L. fermentum strains from the guts of vegans possessed a higher prevalence of genes involved in carbohydrate catabolism than those from the guts of omnivores and high-meat eaters. In particular, the ME2 gene is involved in the biosynthesis of acetate, a compound considered to possess anti-inflammatory properties. In conclusion, this study indicates strain-specific differences in the ability of L. fermentum strains to alleviate UC in mice, influenced by habitual diets.

Reference:

ZHANG Q S, XIAO W, YU L L, et al. Ameliorative effects of Lactobacillus fermentum isolated from individuals following vegan, omnivorous and high-meat diets on ulcerative colitis in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3181-3192. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250005.

翻译：罗敬（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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