三阴乳腺癌（TNBC）侵袭性强、易复发转移，尽管化疗仍是主要手段，但耐药和复发问题始终困扰着患者。2024年1月，Int J Biol Sci杂志发表题为VEGFA-NRP1-GAPVD1 axis promotes progression and cancer stemness of triple-negative breast cancer by enhancing tumor cell-macrophage crosstalk的研究论文，揭示肿瘤相关巨噬细胞TAM（M2型）竟通过VEGFA分子维持肿瘤干性，抑制抗肿瘤免疫，让肿瘤更加难治！

在多种癌症中，血管内皮生长因子A（VEGFA）是肿瘤微环境中血管生成的主要驱动因素。研究发现，VEGFA主要来源于肿瘤相关巨噬细胞。除了促进血管生成作用外，该研究证明VEGFA还可通过与NRP-1（Neuropilin-1）蛋白互作，发挥非血管生成依赖性功能，促进恶性进展。NRP-1是一种跨膜糖蛋白受体，能与VEGF配体家族成员相互作用。

选表型。肿瘤相关巨噬细胞促进TNBC细胞的迁移、侵袭和肿瘤干性。TNBC细胞与M2型巨噬细胞的条件培养基孵育后，迁移和侵袭能力明显增加，并且经M2条件培养基处理之后表达CD44增加，CD24减少，CD44+/CD24-常用于识别乳腺癌干细胞。WB结果显示，在用M2的条件培养基处理后，肿瘤干细胞标志物CD44，OCT-4，Nanog，SOX-2表达显著增加，而CD24水平下降。

定基因。VEGFA在M2型TAMs和TNBC中高度表达。分析GEO数据发现M2型巨噬细胞和THP-1单核细胞之间1237个差异表达基因，与Gene Dard中分泌因子基因集取交集，其中就包含VEGFA。GEPIA数据分析表明，与其他类型的巨噬细胞相比，M2型中VEGFA表达显著升高。WB和ELISA证实，M2型巨噬细胞及其上清液中的VEGFA表达水平显著增加，这些结果表明VEGFA在M2型巨噬细胞中选择性高表达。当VEGFA敲除的M2型巨噬细胞与TNBC细胞共培养时，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力减弱，并显著减少了CSC标志物的水平，这时加入外源性的VEGFA，CSC标志物表达恢复。

数据分析显示非配对和配对样本中，VEGFA在肿瘤组织中高表达，并且相比于其他乳腺癌的细胞系，三阴乳腺癌的细胞系中VEGFA表达量最显著，并且与预后不良相关。微球形成实验表明，外源性VEGFA促进了微球的形成，将肿瘤细胞中VEGFA敲减之后，显著减少了微球的形成，CSC标志物表达减少。

分子机制。VEGFA通过NRP-1促进CSC表型。PCR和WB显示，在三阴乳腺癌中NRP-1在mRNA和蛋白水平高表达，而在其他非三阴乳腺癌细胞系中几乎不表达，在公共数据库中也发现其在三阴乳腺癌中表达更显著。将肿瘤细胞中NRP-1敲除之后，显著减少了微球的形成，CSC标志物的表达也减少，并且这种抑制作用不能通过外源性补充VEGFA逆转。

GAPVD1与NRP-1互作，并受到VEGFA/NRP-1轴调节。采用免疫共沉淀结合质谱分析，确定NRP-1下游靶点GAPVD1。TCGA和HPA数据分析发现，GAPVD1在乳腺癌高表达，GEPIA数据分析显示GAPVD1与肿瘤干细胞标志物强相关。作者用免疫共沉淀进行验证，NRP-1与GAPVD1在TNBC细胞中存在强烈的特异性互作。WB显示使用外源VEGFA后，GAPVD1表达显著增加，敲除VEGFA或者NRP-1后表达抑制，并且，GAPVD1的表达抑制不能被VEGFA恢复。

VEGFA/NRP-1轴通过GAPVD1促进TNBC细胞的进展和干性。GAPVD1敲除后，微球形成抑制，CSC标志物表达减少；但是过表达GAPVD1促进微球形成，CSC标志物表达升高。最重要的是，GAPVD1过表达挽救了NRP-1抑制所导致的CSC标志物减少和微球形成。

VEGFA/NRP-1/GAPVD1轴靶向下游Wnt/β-catenin信号通路。外源性VEGFA的使用显著增加β-catenin、c-Myc、CyclinD1和LEF1的表达。VEGFA/NRP-1敲除对β-catenin及其靶基因的影响相反。此外，在VEGFA/NRP-1敲除后，核β-catenin表达显著降低，表明信号转录活性降低。同样，GAPVD1表达降低对β-catenin、c-Myc、CyclinD1和LEF1的影响相同。GAPVD1过表达成功地恢复了β-catenin及其靶基因在NRP-1敲除时的表达。这些数据表明，VEGFA/NRP-1/GAPVD1轴通过靶向Wnt/β-catenin信号通路来调节TNBC细胞CSC表型。

临床意义。抑制GAPVD1阻碍肿瘤生长和干性，高水平GAPVD1提示TNBC预后不良。GAPVD1敲减显著减少小鼠体内肿瘤生长。免疫组化发现，GAPVD1敲减后肿瘤干细胞的标志物CD44表达减少和CD24表达升高。在组织芯片中，与正常乳腺组织相比，GAPVD1在TNBC标本中高度表达并且NRP-1与GAPVD1表达呈正相关。此外，GAPVD1高水平的TNBC患者中的OS、DMFS、RFS和PPS较短。

TNBC细胞衍生的VEGFA促进TAM极化为M2型。流式细胞术和PCR发现，当M0与TNBC细胞来源的条件培养基共培养时，发生明显的M2极化，其特征是CD206和CD163的表达升高。当与VEGFA敲除TNBC细胞的条件培养基共培养时，这种极化明显减弱。

M2型巨噬细胞可以分泌VEGFA作用于肿瘤细胞上NRP-1受体，其下游蛋白是GAPVD1，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进三阴乳腺癌的迁移，侵袭和干性维持；同时肿瘤细胞也可以分泌VEGFA作用于巨噬细胞，诱导其极化为M2型巨噬细胞，从而形成一个闭环。该研究提示靶向VEGFA（如贝伐珠单抗）联合免疫检查点抑制剂可能打破免疫抑制微环境。GAPVD1高表达与TNBC患者不良预后显著相关，可作为潜在生物标志物。但是，美中不足的是，没有排除VEGFR2等其他受体在通路中的潜在作用。