单克隆抗体（mAb）生产工艺中的收获澄清方法在过去十年中取得了显著进展。虽然其中一些改进是逐步的，但另一些则是真正具有颠覆性的。推动这些进步的三大因素可以大致归类为：单克隆抗体生产工艺的根本变化、生物反应器生产力的提高以及法规要求的变化。生物制药行业向一次性技术的采用趋势也影响了封装式深层过滤技术的发展，这些技术能够降低清洁成本、减少硬件需求并加快设备周转时间。高滴度细胞培养工艺的改进提供了显著更高的细胞密度和杂质谱，这可能导致澄清过程中出现瓶颈。为了克服这些挑战，开发了新型离心机转鼓设计、预处理技术和改进的深层过滤介质。

这些进步还可以根据核心澄清技术（如离心和深层过滤）进行分类。传统澄清技术（如微滤）的改进也被用于更好地实现灌注工艺。体外给料技术也正在研究中。或许对收获澄清工艺影响最大的是深层过滤技术的进步。深层过滤器已发展成为几乎所有澄清工艺的主流。在设备形式和过滤介质方面都取得了重大进展。传统的透镜形过滤器现在可以被封装式形式取代，改进的深层过滤介质等级也适用于各种应用，包括絮凝料流、二次抛光和可溶性杂质清除。合成深层过滤介质的有机可提取物减少，也已上市。这些选择减少了与工艺相关杂质的担忧，并可能使深层过滤器在更下游的应用中得到使用。

除了上述核心澄清技术外，在颗粒物质表征、细胞培养絮凝过程监测以及滤液浊度在线测量的分析方法方面也取得了显著进展。这些能力有助于进一步理解澄清工艺，并可能实现实时工艺监测和控制。

机械分离方法的进步

机械分离方法已用于初级澄清应用，目标是去除大颗粒，包括完整细胞和细胞碎片。所使用的技术包括离心、水力旋流器和增强沉降。在这些机械分离技术中，离心最为普遍。碟片式离心机在20世纪90年代首次被评估用于初级澄清应用。这主要是由于细胞培养工艺的细胞密度更高、颗粒负荷增加，限制了切向流微滤用于收获的能力。最初的原型测试证明了机械分离方法的可行性，并帮助识别了需要解决的差距，以便将这些技术成熟为稳健的单元操作。在机械设计和工艺理解方面的进一步显著进步，保持了这些技术在收获澄清中的实用性。

生物处理中使用了多种离心机，包括管式转鼓、室式转鼓、碟片式和卧螺离心机。对于哺乳动物细胞培养应用，碟片式离心机和管式转鼓离心机是最广泛采用的设计。碟片式离心机具有高通量和高固体处理能力，但由于高密度细胞培养的脱水能力较差，可能会导致更高的收率损失。清洁对于碟片式离心机来说也是一个挑战。相比之下，管式转鼓离心机具有更简单、易于清洁的设计和良好的脱水能力，但这种设计仅提供有限的通量。

1995年，一种用于哺乳动物细胞培养收获澄清的碟片式离心机原型被评估，并实现了高效的细胞去除和良好的收率。结果令人鼓舞，但在测试过程中识别出了一些限制。这些包括在高细胞密度下固体排放效率低下、对压力波动敏感以及在延长停留时间下温度升高。此外，较小的颗粒和细粉没有被高效去除，建议采用二次澄清步骤来处理细粉。用于哺乳动物细胞培养收获的现代离心机在设计上发生了显著变化，以解决这些问题。全密封和水密封进料区设计减少了气 - 液界面，并提供了更受控的进料加速，减少了由于进料和池液体的切向速度不匹配而产生的剪切。通过加入冷却夹套来控制温度。可以通过实验确定最佳背压，以确保水密封离心机保持淹没，并且在密封离心机背压的情况下，有助于减少出口处的空气卷入，提高在线浊度测量的准确性。

历史上，离心过程的放大是基于Ambler在1959年提出的沉降型离心机的西格玛理论。西格玛，即离心机大小的指数，被定义为理论上能够在单位重力场中提供相同澄清量的沉降槽的等效沉降面积。该理论推荐的放大方法是在放大时保持进料流量与西格玛的比值不变。尽管该理论为离心过程的放大提供了有效的数学基础，但存在三个主要限制。首先，方程中包含一个分离效率项，需要针对每台离心机进行实验确定。其次，理论的一个限制是它没有考虑细胞和细胞碎片的剪切敏感性。缩小规模的批量离心机无法重现工业离心机中细胞培养的剪切暴露。这导致即使考虑了分离效率，从台式批量离心机和工业离心机获得的澄清液质量也存在显著差异。第三，该理论最初是基于无障碍沉降开发的，随着细胞密度的增加，颗粒之间的距离减小，颗粒间相互作用可能会降低沉降速度。固体浓度的增加也可能导致粘度增加。

这些限制使得在工艺开发过程中使用台式吊篮离心机生成具有代表性的澄清液以用于后续深度过滤的尺寸选择变得困难。近年来，人们在创建缩小规模和超缩小规模模型方面做出了巨大努力，以克服这些放大挑战。最小的碟片式离心机需要超过10升的细胞培养液，这限制了其在工艺开发应用中的实用性。为了进一步缩小系统规模，Maybury等人研究了一种方法，用空白圆盘替换一定数量的活动圆盘，以减少分离面积。可以实现十倍的活动面积减少，但由于转鼓的固体保持能力保持不变，对进料材料需求没有影响。在后续工作中，通过加入不锈钢圆锥形插入物减少了转鼓的持液量。采用这种方法实现了大约四倍的缩小规模，并且具有相当的澄清性能。

这些方法将进料需求从几十升减少到几升，但这一进料体积需求仍被认为是瓶颈。需要一种合适的超缩小规模（USD）方法，以便能够使用毫升量级的进料材料预测工业离心机的澄清效率。Maybury等人研究了使用实验室离心机来预测工业离心机对剪切敏感和剪切不敏感材料的性能。西格玛理论被调整以适应实验室离心机的加速和减速时间。对于剪切不敏感的材料，实现了准确的澄清性能预测，而对于实验室规模的剪切敏感料液，效率仍然被显著高估。这可能是由于无法模拟碟片式离心机的剪切。Boychyn等人也观察到连续流离心机和实验室缩小规模离心机之间的澄清性能存在类似差异，这是由于在更高剪切应力下沉淀物破裂。

Levy等人开发了一种旋转剪切装置（RSD），用于研究剪切对质粒DNA的影响。Boychyn等人研究了在使用实验室离心机进行澄清之前，在类似的RSD中对进料料液进行预剪切。使用计算流体动力学（CFD）对离心机进料区的高流速应力进行建模，并在与Levy等人描述的类似设计的旋转剪切装置中重现。预剪切的进料料液在实验室离心机中以相当于中试规模的Q/S进行离心，并校正了加速和减速时间。采用这种方法，估计了碟片式离心机和CARR Powerfuge的生产离心机澄清效率。Tunisian等人通过引入对阻碍沉降的校正，将超缩小规模方法改编用于预测高细胞密度培养的离心。Westoby等人选择了一种基于毛细管的剪切系统来生成预剪切进料。该剪切系统的简单设计使其易于构建，且几乎不需要定制部件。1000毫升注射泵提供了在低体积和生成足够材料以进行深度过滤尺寸选择方面工作的灵活性。Joseph等人比较了旋转剪切装置和制备毛细管系统的性能。进行了深度和无菌过滤研究，以比较使用制备毛细管剪切系统生成的澄清液与中试规模离心机的澄清液。相似的浊度和压力曲线表明该平台适用于生成具有代表性的澄清液，以用于台式过滤尺寸选择研究。在后续工作中，使用快速蛋白液相色谱系统代替了之前工作中使用的注射泵，以实现平台的自动化。

除了开发缩小规模系统外，研究人员继续优化操作参数，并研究新设计以提高性能并跟上上游需求的变化。Zhao等人研究了进料流量调节和固体排放策略，以提高产品回收率和整体工艺收率。还评估了部分转鼓排放方法，其中只排放一部分固体。该方法可以快速重置并重新开始进料，但转鼓暂时部分为空。由于部分空转鼓中的气 - 液界面增加了细胞的剪切，因此影响了性能。进一步的工作发现，全量程加上缓冲液冲洗有助于解决气液界面问题，并与部分排放方法相比提供了更好的澄清效率。对于处理高细胞密度培养，间歇排放碟片式离心机可能会因固体排放频率高而无法管理澄清性能和收率。评估了一种新型管式转鼓离心机设计，其采用活塞式排放，可以提供更好的脱水能力，以减少收率损失。Ardarion等人评估了一种连续排放离心机用于高细胞密度哺乳动物细胞培养收获。还在连续排放离心机上实施了基于浊度的排放控制策略。实施连续排放代替间歇排放以及基于浊度的排放控制的累积影响是收率增加了10%以上，浊度降低，二次深度过滤器堵塞减少。

生物制药行业向一次性制造的进展限制了传统不锈钢离心机在初级澄清中的使用。A Shukla等人审查了两种用于澄清操作的一次性离心机选项。这些是一次性流化床离心机KSep™系统和来自Pneumatic Scale Angelus的CARR UniFuge™的旋转管式转鼓设计。到目前为止，关于一次性离心机在哺乳动物细胞培养批次过程澄清中的应用报告有限，其性能已在灌注和细胞收获应用中得到评估。表6.1提供了商业可用离心机的总结。

除了离心外，其他机械分离技术也已评估用于哺乳动物细胞培养的澄清操作。这些包括水力旋流器和沉降器。由于大多数技术无法匹配离心机的固体流脱水能力，因此产品收率有限，或者可能需要缓冲液洗涤固体以增加产品回收率。

封装式深层过滤器

在20世纪70年代中期至晚期，用于大规模过滤含有浓缩胶体颗粒的生物制药工艺流体的改性电荷深层过滤器开始在静脉注射血液分馏制造中使用。由纤维素和硅藻土（DE）制成的深层过滤介质已在板框配置中使用，使得能够以低成本部署大面积过滤器。板框过滤在血浆分馏中仍然使用，其中需要回收含有血浆衍生产品的滤饼。在透镜形圆盘格式中使用相同类型的深层过滤介质，使得工艺能够在大型不锈钢外壳内实现封闭，这种安排适合早期在生物制药制造工艺中的采用。为了避免大型基础设施需求（例如，用于处理钟形外壳的起重机）和设备清洁需求，一次性、模块化、自包含的深层过滤器得以开发，并已在生物制药行业中广泛采用。透镜形圆盘过滤器通常在组装到支架后进行原位蒸汽灭菌（SIP）。使用含有产品的进料流湿润的透镜形过滤器的后使用移除不是一项理想的任务，并且从人体工程学和事故风险角度带来多重风险。在过滤器移除后，需要进行原位清洁（CIP），以为下一个周期准备设备硬件。如图6.1所示，传统的堆叠式透镜形过滤器通常比封装式深层过滤器具有更大的设备填充体积。增加的填充体积可能会导致更长的处理时间、产品稀释和产品回收率降低。封装式深层过滤器解决了许多这些操作挑战。

根据应用需求，使用前或使用后的灭菌选项取决于规模。完全自包含的胶囊，如Supracap™100胶囊，可用于双层深层过滤器设备，过滤面积可达0.15平方米，或单层设备可达0.30平方米。这些设备也可以通过高压灭菌器进行灭菌。对于需要在过滤器支架内组装多个设备的较大安装，使用高压灭菌器可能更具挑战性，但也可以考虑使用苛性碱和热水消毒工艺。

吸附性深层过滤器通过多种吸附机制（例如，阴离子交换、疏水相互作用）实现比正常流过滤中基于尺寸的保留更高的胶体颗粒容量。深层过滤介质通常含有基于硅藻土的过滤助剂，这对于这些相互作用尤为重要。硅藻土提供了深层过滤器的大部分内表面积。深层过滤介质还可能含有带正电荷的粘合树脂，用于增加过滤层的湿强度。带电粘合树脂也可能有助于从工艺流中结合可溶性杂质（如宿主细胞蛋白或DNA）。大多数深层过滤介质制造商提供含有多种过滤介质的过滤设备，这些介质按顺序分层，以在广泛的粒径分布中最大化容量和保留。活性炭是另一种与纤维素载体混合的过滤助剂，利用其微孔和中孔结构吸附从小分子到大分子的实体，如宿主细胞蛋白，或有助于气味和颜色的成分。

由纤维素和DE或活性炭过滤助剂组成的深层过滤介质的封装式深层过滤器在生物制药行业有多个供应商提供。由于结合了吸附和颗粒筛选机制，这些过滤器可以在非常广泛的粒径范围内保留颗粒。过滤性能取决于进料特性、工艺参数和过滤器负荷。一些常见示例如下表所示（表6.2）。

非织造深层过滤器

许多制造商提供含有熔喷聚丙烯微纤维或玻璃纤维过滤介质的过滤滤芯。设备形式可能包括缠绕式、包裹式过滤器、折叠式或混合包裹式 - 折叠式过滤介质配置。过滤通过颗粒筛选和吸附的组合来实现。还提供分层、梯度密度预过滤器，这些预过滤器提供一个粗过滤区，用于去除大颗粒，随后是一个更紧密的层，用于减少胶体和生物负荷。

在上游处理应用中，这些预过滤器主要用于延长下游灭菌级膜过滤器在培养基过滤和细胞收获澄清应用中的使用寿命。在下游处理应用中，过滤器可用于在色谱步骤之前的生物负荷减少和颗粒去除。

聚丙烯深层过滤器在广泛的pH范围内表现出良好的化学兼容性。聚丙烯和含有玻璃微纤维的深层过滤器都可以使用高压灭菌器、热水消毒或原位蒸汽灭菌工艺进行灭菌。

包裹式聚丙烯深层过滤器也已用于低细胞密度、高活性进料流的低体积澄清应用。由于过滤介质中缺乏带正电荷的成分，聚丙烯预过滤器通常在工艺流中表现出对带负电荷的胶体颗粒的低保留率。这些过滤器还表现出低有效过滤面积。因此，聚丙烯深层过滤器在大体积细胞培养收获应用中的实用性有限。

下表提供了一些商业非织造预过滤器和深层过滤器选项的总结（表6.3）。

合成深层过滤器

传统深层过滤器通常由天然材料制成，包括纤维素和硅藻土过滤助剂。这些成分可能会向工艺流中贡献低水平的不想要的可溶性和颗粒性可提取物，并且存在一些担忧，这些可提取物可能会污染工艺流体。此外，由于在生物制药生产过程中一次性使用系统（SUS）的采用增加，最近已努力标准化可提取物测试，并为SUS系统和这些过程中使用的过滤器提供一组共同的期望。因此，已开发出新的深层过滤器，用全合成材料取代纤维素和硅藻土过滤成分。合成深层过滤器可以表现出降低的可提取物谱和减少的使用前冲洗需求。

已研究了基于聚丙烯的合成深层过滤器，用于聚合物絮凝的高密度哺乳动物细胞培养收获。新的合成吸附性混合过滤器已在Protein A后/低pH病毒灭活步骤中进行了研究，作为一种去除与工艺相关的杂质（包括HCP、DNA和产品聚集体）的手段，并已评估用于病毒清除应用。已研究了合成深层过滤器与传统DE基过滤器在清除可溶性下游工艺杂质方面的性能提升。几种类型的合成深层过滤器在各种应用模式下的性能已先前进行了综述。

合成深层过滤器与使用前碱性消毒和高压灭菌器灭菌工艺的兼容性取决于材料的构成。应在使用前评估消毒或灭菌工艺对过滤器性能和可提取物谱的影响。

体外给料

作为另一种用于高固体负荷细胞培养收获初级澄清的方法，体外给料过滤方法重新引起了人们的兴趣。在体外给料过滤过程中，进料流与一定量的吸附性过滤助剂（如硅藻土）接触。过滤助剂大大增加了所得滤饼的渗透性，所得的组合质量可以更容易地使用过滤隔膜进行分离。在生物制药加工应用中，过滤隔膜可以是膜过滤器、透镜形深层过滤器或封装式深层过滤器。这些过程通常需要额外的辅助设备和混合罐，以便在不污染受控生产环境的情况下将粉末状过滤助剂引入进料流。

类似于细胞培养絮凝方法，体外给料过滤过程需要确定最佳的DE量和等级，以实现良好的上清液澄清度并最小化封装式过滤面积需求。较高的DE过滤助剂负荷通常可以改善滤饼的渗透性和上清液澄清度，但也会增加滤饼深度和所需的过滤面积。

用于捕获体外给料过滤产生的滤饼的过滤器和设备的兼容性取决于所选择的外壳或封装式过滤器，与直接深层过滤相似。

体外给料过滤系统可以有效利用硅藻土过滤助剂的吸附特性。已先前评估了体外给料过滤方法与传统的细胞培养收获过程（包括离心）的性能。未报告对浊度降低、mAb产品回收率或电荷异质性的显著差异。DE过滤助剂负荷水平和pH对mAb产品回收率和可溶性杂质清除的影响如表6.4所示。在低应用pH值下可以减少过滤助剂的负荷需求。

多个供应商提供适用于生物制药收获中使用DE过滤助剂的体外给料的封装式过滤器和系统。可以提供合适的DE过滤助剂等级和接收隔膜过滤器。一些常见示例如下表所示（表6.5）。

预处理技术

高细胞密度培养物具有增加的杂质和细胞碎片，可能对收获澄清过程构成挑战。这一挑战可能包括深层过滤器的低过滤容量和切向流微滤装置的过早堵塞。收获预处理方法，如沉淀或絮凝，可以显著提高杂质清除率并增强澄清效率。沉淀依赖于改变收获中杂质的溶解度，而絮凝过程则产生易于通过过滤过程去除的较小颗粒的聚集体（絮体）。已提出了多种絮凝机制，包括电荷中和、聚合物桥接、静电补丁、疏水相互作用和在扫卷絮体内的缠结。已评估了多种预处理方法用于收获澄清，包括酸沉淀、与磷酸钙共沉淀和聚合物絮凝。酸沉淀涉及将细胞培养的pH值降低到4.5到5之间。这种方法可以是一种简单而有效的方法，用于诱导细胞培养中存在的细颗粒和其他杂质的沉淀。Westoby等人研究了酸沉淀对沉降和切向流微滤（MF）澄清的影响。经过沉降后的酸沉淀上清液与未处理的沉降收获相比，DNA和浊度显著降低。在处理酸沉淀收获时，也观察到微滤通量和通量提高，与原收获相比。与盐共沉淀是另一种可用于杂质去除和改善澄清步骤的预处理方法。这种方法涉及添加两种可溶性溶液，形成有助于杂质去除的沉淀物。或者，该溶液可以由与杂质相互作用形成不溶性沉淀物的阳离子组成。Chen等人研究了使用交替切向流（ATF）过滤方法收获高细胞密度细胞培养物的磷酸钙共沉淀。

有机聚合物絮凝是另一种已评估用于杂质清除和增强澄清的预处理技术。絮凝剂可以根据赋予聚合物离子特性的官能团进行分类，这些类别包括阴离子、阳离子和混合模式功能。聚合物絮凝过程也可以设计为沉淀目标分子或沉淀可溶性杂质（如DNA和宿主细胞蛋白）。阴离子絮凝剂主要用于沉淀目标分子，而大多数杂质保留在上清液中。沉淀物被回收并重新溶解，以便在后续单元操作中进行进一步纯化。McDonald等人研究了溶液pH值、溶液离子强度和絮凝剂分子量对使用三种阴离子聚电解质沉淀抗体的影响，聚乙烯磺酸（PVS）、聚丙烯酸（PAA）和聚苯乙烯磺酸（PSS）。阳离子和混合模式聚电解质通常用于絮凝细胞、细胞碎片和其他杂质，而可溶性目标分子保留在上清液中。去除絮体并丢弃，含有目标分子的上清液然后可以在后续单元操作中进一步纯化。阳离子聚合物如壳聚糖、聚二烯丙基二甲基氯化铵（pDADMAC）和聚胺已评估用于细胞培养液的预处理，以去除杂质并提高澄清效率。多模式絮凝剂可以提供比阴离子和阳离子絮凝剂更广泛的杂质清除范围。Kang等人评估了一种部分苄基化聚（烯丙胺）盐耐受性阳离子聚合物（Clarisolve™ mPAA，EMD Millipore）用于细胞培养的絮凝。其性能与两种阳离子聚合物聚乙烯亚胺和pDADMAC进行了比较。多模式絮凝剂实现了更高的HCP降低，并且增加了聚集体去除。在Clarisolve™深层过滤器上进行了过滤研究。在这项研究中，与通过传统的两阶段深层过滤串（包括Millistak™ D0HC和Millistak™ X0HC深层过滤器）过滤的未处理收获相比，过滤容量增加了三到五倍，而滤液浊度相当。聚合物絮凝剂可能具有细胞毒性，因此需要证明其在药物产品中的清除量低于可接受的暴露限度。需要根据给药方式建立可接受的暴露限度，这一过程可能涉及体外和体内毒性研究。还需要稳健的分析程序，用于定量絮凝剂浓度，并在生物制药生产过程中的后续纯化步骤中建立聚合物清除水平。

细胞保留装置

生物制药行业连续处理的增长趋势受到多种因素的推动。关键因素包括生物仿制药的扩展、对高体积生产力的需求、操作灵活性、产品质量的提高和生产成本的降低。

由于哺乳动物细胞培养生产的进步，当前的补料批式生物反应器过程可以常规表达滴度超过5 g/L的mAbs。灌注细胞培养的连续处理可以进一步提高生物反应器操作的整体生产力。

连续过程的上游部分通常使用灌注生物反应器。灌注过程可以实现超过2000万细胞/mL的细胞密度。灌注生物反应器的操作可能涉及新鲜细胞培养基的连续或半连续添加，同时去除目标产品和代谢废物，而细胞保留在生物反应器中。这种操作是通过使用细胞保留技术实现的。

历史上，工业中已应用了多种技术和设备用于细胞保留。这些技术包括基于密度的保留，如重力沉降器、离心机和水力旋流器、声学分离器；使用膜的筛选基保留，如离心过滤器、动态过滤器和切向流过滤器，以及一些独特的细胞特性，如介电泳分离器，或通过采用修改的上游工艺，如细胞固定化。

无论细胞保留装置的类型如何，必须在整个灌注过程中保持高效的细胞保留和稳健的操作。对于稳健的操作，需要保持所需的体积流量、高细胞完整性和活性以及可接受的产品收率，而无需更换装置或进行维护，从而最小化生物反应器污染的风险。细胞保留装置还必须能够在实验室（约5升）、中试和最终生产规模（200升以上）之间进行放大。

最近，基于灌注的补料批式哺乳动物细胞生产的强化使得细胞密度显著提高（高达甚至超过1亿个细胞/mL）。这种强化是通过在生产生物反应器（N）之前的N-1种子或N-2种子生物反应器中增加细胞密度来实现的。这些过程是通过在种子生物反应器上使用细胞保留装置来完成的。这使得生产生物反应器可以在更高的细胞密度下接种。因此，由于通过消除几个小规模扩增阶段并加速达到稳态细胞密度的时间，显著缩短了运行时间，因此整体生产力得以提高。

由于一些类型的细胞保留装置（如重力沉降器）存在灌注速率限制、停留时间长和放大困难等问题，因此难以将其应用于强化应用。基于膜的细胞保留装置更适合此目的，因为它们的放大几乎呈线性，并且更容易集成到连续操作中。当前灌注操作中常用的两种技术是传统的切向流过滤（TFF）和交替切向流（ATF）系统。

TFF和ATF细胞保留系统都使用通常由改性聚醚砜（PES）或聚砜（PS）制成的微滤（MF）膜。传统的TFF装置也提供有亲水化聚偏二氟乙烯（PVDF）[19]和混合纤维素酯（ME）微滤膜。基于膜的装置提供预灭菌或SIP/高压灭菌器可灭菌的装置格式（表6.6）。

使用超滤（UF）膜的TFF装置也用于完成浓缩补料批式灌注过程。在这些应用中，产品分子被保留在生物反应器中并积累，而低分子量成分和有毒副产物在渗透液中被去除。UF灌注适用于稳定的生物分子，且在生物反应器中积累过程中无需担心降解。这些过程可以提供一种简单的改进设施空间/时间产量的方法，用于生产抗体。

ATF和TFF操作系统的区别在于细胞培养进料流的供应方式。在ATF操作中，进料流通过隔膜泵在两个方向（来回）移动。在TFF系统中，通常使用蠕动泵提供单向横流。这两个方向的流动和单向循环进料流都经过优化，以最小化膜极化并防止在长时间灌注过程中膜污染。选择低剪切泵用于灌注系统已被证明是保持细胞完整性和最小化细胞裂解的关键因素之一。

在膜操作中，细胞裂解可能会加剧极化，最终导致膜污染，这在高细胞密度、低细胞活性和增加的渗透液流速下更为严重。极化和污染可能会降低产品分子进入渗透液的回收率，从而导致整体收率降低和生产力下降。

基于螺旋惯性聚焦微流体装置的无膜细胞保留装置利用流体动力学的组合。这些装置依赖于颗粒大小和密度，通过惯性对细胞进行排序，以便在具有梯形横截面的螺旋微通道内聚焦并侧向分离颗粒。控制颗粒运动只需要来自通道结构和颗粒的流体动力学，而无需主动力场，如电场或声波。微流体装置已被证明可用于悬浮哺乳动物细胞的连续灌注培养。微流体装置中的细胞保留效率取决于输入细胞浓度。增加的输入细胞浓度会导致细胞间相互作用增加，因为细胞沿着通道竞争相同的平衡位置。这导致聚焦带变宽，惯性聚焦效率降低。在15.4×10⁶细胞/mL和22.2×10⁶细胞/mL的CHO灌注培养中，微流体螺旋装置的保留效率分别为99.2%和92.2%。这些值在细胞浓度超过26.5×10⁶细胞/mL时降至83%以下，这是由于设备外出口处的细胞损失。在4.2×10⁶细胞/mL（120万细胞/mL）（平均值（范围），n=3）时，灌注生物反应器通过微流体细胞保留装置连续处理了145小时，对细胞活性没有影响，并且保留效率保持在98%。通过修改通道尺寸和流速，可以进一步提高用于更高细胞密度的保留效率。对于更大的体积，可以通过并行堆叠多个螺旋微通道来放大灌注微流体装置，600个连接通道能够支持接近1000升/天的灌注速率。

尽管惯性聚焦微流体技术在连续细胞培养操作中显示出巨大潜力，但目前行业尚无适用于大规模GMP生物治疗药物生产的商业装置。

无膜声学沉降保留装置利用声波增强悬浮细胞的沉降速度。BioSep™细胞保留系统的技术基于高频共振超声波。声学共振产生辐射和伯努利力，可以通过诱导松散聚集随后沉降来分离细胞，而不影响细胞活性。细胞与培养基的分离基于大小、密度和压缩性的差异，活细胞倾向于被更选择性、更高效地保留。BioSep™系统的分离效率通过调整声学功率输入到谐振器来控制。典型的分离效率范围为90%到99%，细胞密度为20e25×10⁶细胞/mL。

另一种商业可用的声学分离技术基于低频波的声泳分离。声学波分离器（AWS）利用声学力，在装置通道中产生细胞培养流的三维驻波。结果，细胞被声学力捕获，并迁移到驻波的节点。细胞开始聚集在一起，直到通过重力沉淀出来。该系统针对CHO细胞在20e50×10⁶细胞/mL的细胞密度下进行了优化。然而，该系统也可以应用于一系列生物制品，无论颗粒浓度或细胞培养密度的变异性如何。

声学系统的缺点与高功耗和不同尺寸装置之间的声学模式差异相关的放大问题有关。

在基于离心的装置中，固 - 液分离不是通过物理屏障实现的，而是通过细胞固体颗粒与培养液之间的密度差异来实现的。离心机已成功放大用于几种灌注过程，并且可以在相对较高的流速下运行。

用于灌注操作的离心装置必须在所需的时间内无菌且连续运行，且不会对细胞的完整性和活性产生不利影响。一次性kSep™系统是碗式离心机，在固体排放期间不会停止旋转。该系统可以浓缩高密度细胞（108个细胞/mL），实现完全的产品回收（>95%），且没有显著的活性损失或细胞裂解（表6.7）。

澄清的分析技术

收获澄清操作旨在去除不溶性颗粒和可溶性杂质，而不对产品质量和收率产生不利影响。需要分析方法来表征这些净化方面的内容，并评估产品滴度、产品质量，并支持生产和监测生产过程。在整个单克隆抗体纯化过程中，使用一系列标准分析工具和技术来表征杂质和产品质量。颗粒表征是收获澄清的一个相对独特的方面，这需要特定的分析方法用于工艺开发和监测。

评估澄清效率的最常用方法是确定溶液浊度或光学密度。浊度是由于样品中悬浮颗粒的存在而导致的雾度或浑浊度的度量。它使用散射光浊度仪进行测量，其中散射光的强度与基于福尔马林校准曲线的样品浊度相关。在其最初设计中，散射光浊度仪将探测器放置在与入射光束成90度角的位置。然而，现代散射光浊度仪可以使用多个探测器。散射光浊度仪可用于离线和在线浊度测量。研究人员还使用光学密度来估计澄清效率。浊度和光学密度测量的主要限制是无法提供有关颗粒大小分布的任何信息。

确定颗粒大小分布和浓度对于评估澄清中使用的任何机械分离或过滤方法的有效性是必要的。颗粒分布表征方法的主要挑战是缺乏一种单一方法，能够准确且可靠地测量澄清相关的整个粒径范围内的颗粒大小和浓度。这个范围大约从100纳米到100毫米不等。

对于粒径在1毫米到1毫米之间的较大颗粒，聚焦光束反射测量（FBRM）已被许多研究人员用于跟踪絮凝过程中颗粒大小分布的变化。Senczuk等人评估了使用FBRM跟踪pDADMAC絮凝料液中颗粒大小随时间的变化。Burgstaller等人使用带有定制流动池的FBRM探头，监测两个不同粒径范围内的颗粒计数，用于在线絮凝。从FBRM获得的弦长分布（CLD）与颗粒大小分布（PSD）有关，但不能提供实际的PSD。为了获得颗粒大小分布，通常需要使用图像分析进行校准。Pandit等人提出了一种将CLD转换为PSD的算法，并且在通过图像分析确认时显示出良好的一致性。另一种方法是动态图像分析，其中通过微成像系统拍摄的图像直接提取亚可见颗粒的大小分布、计数和形状等信息。

对于较小颗粒大小的测量，通常使用三种方法：激光衍射、动态光散射（DLS）和库尔特计数器。激光衍射颗粒大小分析仪根据散射光强度的角变化估算颗粒大小。颗粒大小测量范围可以从10纳米到2000毫米，尽管准确确定光学参数可能具有挑战性。Hutchinson等人使用Mastersizer（Malvern Instruments）进行颗粒大小分析。动态光散射（DLS）是另一种用于生物材料颗粒大小测量的流行方法。在布朗运动下，颗粒显示出散射光强度的非常短时间尺度的波动。这些波动的速率取决于颗粒的大小。DLS根据这些光散射强度变化率估算悬浮颗粒的流体动力学半径。与激光衍射相比，其测量范围有限，具体范围取决于仪器，可能在0.3纳米到10毫米之间。另一方面，库尔特计数器根据非导电颗粒通过孔口时的阻抗变化来测量颗粒大小。该技术可以进行稳健的颗粒大小分布测量，但给定孔径管的测量范围有限。不同孔径管的颗粒测量可以组合在一起，以获得从0.4毫米到1600毫米的总体测量范围。Westoby等人使用配备30毫米孔径的Beckman Coulter Multisizer III，通过基于超缩小规模方法的毛细管剪切装置分析澄清液颗粒大小分布。

深层过滤器和无菌过滤器的过滤性也被用作比较澄清效率的一种方法。Joseph等人通过评估通过具有0.1-2微米标称孔径的Millistak™ X0HC深层过滤器的过滤性，比较了中试规模离心机和缩小规模系统获得的澄清液质量。

除了这些传统方法外，研究人员还研究了某些间接表征方法。这些包括监测乳酸脱氢酶（LDH）作为细胞裂解的指标。LDH是一种可溶性细胞质酶，当细胞破裂时会释放出来。Petersen等人使用LDH水平来量化细胞裂解的程度，研究杂交瘤细胞的剪切敏感性及其对生长方式、细胞培养年龄和代谢物浓度的依赖性。Joseph等人使用LDH水平将制备毛细管剪切装置校准到旋转剪切装置。

尽管LDH测量在跟踪细胞裂解方面是有效的，但由于其可溶性，它对于絮凝或沉淀过程的评估并不有用。Senczuk等人研究了胆固醇作为估计细胞培养澄清液中细颗粒浓度的替代物。这些颗粒主要由细胞碎片组成。胆固醇是动物细胞膜脂质双层的一个组成部分，相对容易分析，澄清液中的胆固醇水平与深层过滤器的通量相关性良好。

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