通过3D悬浮微培养技术，将成年患者的皮肤成纤维细胞直接重编程为功能性神经元，并展示了这些神经元在体外和体内实验中的稳定性和功能性。这项技术为神经退行性疾病的细胞替代疗法和疾病建模提供了新的可能性。

试验步骤

细胞准备

从皮肤活检中获取成年皮肤成纤维细胞（hDFs），并进行培养。

- hDFs培养于T175培养瓶中，使用未涂覆的培养瓶以避免细胞贴壁。

- 细胞在37°C、5% CO₂下培养。

细胞传代

当细胞达到90%汇合时，使用0.05%胰蛋白酶在D-PBS中传代。

- 传代比例根据实验需求调整。

- 传代后的细胞可用于后续的重编程实验或冷冻保存。

细胞重编程准备

将hDFs重悬于含有慢病毒的培养基中，准备进行3D培养。

- 使用超低吸附表面的锥形微孔板（如Elplasia板或Costar U型底微孔板）。

- 根据所需细胞球大小选择合适的微孔板。

3D细胞球形成

将细胞与慢病毒混合后，接种到微孔板中，通过离心使细胞均匀分布于微孔中。

- 离心条件：24小时，100g。

- 细胞在24小时内自组装成球形结构。

细胞球培养

在特定的培养基中培养细胞球，促进成纤维细胞向神经元的转化。

- 培养基：NDiff227，补充以下成分：早期神经诱导培养基（第0-16天） CHIR99021：2 μM SB431542：10 μM Noggin：0.5 μg/ml LDN1931189：0.5 μM VPA：1 mM LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM 晚期神经诱导培养基（第16天后） LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM

- 细胞球在培养期间保持空间分离，避免融合。

细胞球收获与移植

在培养一定时间后，轻轻收获细胞球，用于移植或其他实验。

- 使用玻璃毛细管进行移植，确保细胞球的完整性。

- 移植时避免对细胞球进行酶解或机械分离。

功能验证

对重编程后的神经元进行功能验证，包括电生理记录、钙成像和多巴胺释放检测。

- 电生理记录：使用全细胞膜片钳技术，记录细胞的动作电位和离子电流。

- 电生理记录和钙成像实验在培养60天后进行。

体内移植实验

将3D培养的神经元移植到成年大鼠的大脑中，评估其存活、成熟和功能整合。

- 移植部位：大鼠背外侧纹状体。

- 移植的细胞球大小为2000细胞/球，使用150 μm内径的玻璃毛细管进行移植。

关键结论

  • 3D培养的优势：3D悬浮培养技术提供了一个有利于神经元转化和长期存活的环境，克服了2D培养中细胞附着和机械应激的问题。
  • 功能性神经元的生成：通过3D培养技术，研究者能够生成具有功能性突触和神经递质释放能力的神经元。
  • 体内移植的成功：3D培养的神经元在移植到成年大鼠大脑后能够存活、成熟并整合到宿主神经回路中，这为未来的细胞替代疗法提供了希望。
  • 疾病建模和再生医学的应用潜力：这种3D培养技术为研究神经退行性疾病和开发新的治疗方法提供了新的工具。

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