石榴属于千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica granatum L.），果实主要包括石榴皮和薄膜分隔的6 个子室。果实可食用部分除了富含糖类、维生素、多酚以及人体必需的微量元素外，还包含羟基苯甲酸、苯丙素及共轭脂肪酸等多种抗癌成分。
果酒加工是延伸水果产业链、提高附加值的有效途径。然而，利用纯石榴汁发酵而成的低度果酒虽然酒体透亮、风味独特，但香气较为寡淡且同质化严重。加之由于石榴果实的特殊结构，采用清汁发酵工艺酿造石榴酒时，会产生约占果实总质量70%左右的皮渣，资源化利用率偏低、加工成本高，不利于形成产业规模化效应。
近年来的研究显示，采用非酿酒酵母（NS）与S. cerevisiae混菌发酵能够提高果酒香气复杂性和浓郁度，日益受到酿酒师的青睐。
甘肃农业大学食品科学与工程学院的柳秉红、魏玲玲、祝霞*等以‘突尼斯’石榴为原料，基于单因素和正交试验设计进行浸渍工艺参数优化，再以优化制备的石榴汁为试材，接种实验室前期分离鉴定的高产风味酶NS菌株和商业S. cerevisiae进行混菌发酵，分析其酿酒学参数和挥发性化合物差异，旨在为综合利用石榴资源以及酿造高品质石榴酒提供理论依据和技术支持。
01
皮渣浸渍工艺优化
1.1 单因素试验结果
如图1所示，随着浸渍温度、时间和皮渣添加量持续增加，发酵酒样的TP含量显著升高（P＜0.05），但感官评分整体呈先升高后下降的趋势。由图1A可知，浸渍温度会显著影响酒样的TP含量和感官品质。当浸渍温度为4 ℃时，石榴酒的TP含量较低，浸渍温度在4～6 ℃时，石榴酒的TP含量相对较低，但有助于提升酒样感官品质；当浸渍温度高于6 ℃，在TP含量升高的同时也会使部分产生苦味的物质进入酒体，致使酒样口感酸涩。当浸渍12 h时，发酵酒样感官评分最高；浸渍时间短于12 h时，由于浸渍时间较短，浸渍效果不明显，致使酒样的TP含量相对较低；较长的浸渍时间（长于24 h）会使TP含量显著升高的同时，酒样的苦涩味也逐渐增强（图1B）。由图1C可知，不同皮渣与石榴汁料液比所酿酒样感官评分相比于其余2 个因素变化趋势存在差异。其中皮渣添加量为100 g/L的发酵酒样感官评分最高，当皮渣添加量高于200 g/L时，发酵酒样苦味和涩感加重，色泽发暗。综合分析，选择浸渍温度6 ℃、浸渍时间12 h、皮渣与石榴汁料液比100 g/L为各自因素的较佳水平，进行后续正交试验。
1.2 正交试验结果
以感官评分为评定指标，采用正交试验对皮渣浸渍工艺参数进行优化，结果如表3所示。9组实验组的感官评分为6.55～7.57 分，其中A1B1C1组由于浸渍温度低、浸渍时间短且皮渣与石榴汁料液比较低导致浸渍效果不足，酒体颜色略浅，口感较为单薄，感官评分最低（6.55 分）；而A3B3C2组相比于A1B1C1组，其浸渍条件更加充分，致使酒样色泽鲜亮、口感层次丰富、感官评分达到最高（7.57 分）。
实验极差值（R）结果表明，皮渣添加量对石榴酒的感官品质影响最大。分析k值可得出，最佳浸渍工艺参数为A2B3C2，但在正交试验中没有涉及，需要进行验证实验。
在浸渍温度6 ℃、浸渍时间24 h和皮渣与石榴汁料液比200 g/L的处理工艺条件下，酿造的石榴酒还原糖质量浓度为3.41 g/L，乙醇体积分数为7.55%，挥发酸质量浓度为0.38 g/L，总酸质量浓度为6.14 g/L，pH 3.71，均符合GB/T 15038—2006的要求，TP质量浓度为1 214.38 mg/L且感官评分达到7.65 分，高于正交试验各处理组的感官评分。
综上，石榴酒酿造的最佳浸渍工艺参数为浸渍温度6 ℃、浸渍时间24 h和皮渣添加量200 g/L；以此浸渍条件处理石榴汁后进行发酵的酒样澄清透亮、色泽鲜艳、酒体醇厚且无悬浮沉淀。因此，在后续实验中选择此浸渍参数进行发酵前的石榴汁预处理。
02
混菌发酵对石榴酒理化指标和香气质量的影响
2.1 石榴酒理化指标
各接种组乙醇发酵完成后，测定的酒样理化指标结果见图2。除MP处理组酒样还原糖质量浓度高于4 g/L外，其余处理组酒样还原糖质量浓度均低于4 g/L，表明M. pulcherrima NX-2发酵性能相对较弱。与ES组相比，MP、TD、MP-ES与TD-ES处理组酒样的乙醇体积分数显著降低（P＜0.05），表明S. cerevisiae ES488纯种发酵产乙醇能力较强；与ES组相比，MP和TD组的总酸质量浓度显著降低（P＜0.05），与pH值变化趋势相反。各处理酒样的挥发酸质量浓度虽有差异，但均小于0.8 g/L。色度、色调值是评价果酒色泽品质的关键指标，其与TA含量呈显著正相关。ES组的色度、色调值均显著高于其他处理组酒样（P＜0.05），且与TA质量浓度变化趋势一致。另外，与ES组相比，MP-ES组的TF和TP质量浓度无显著变化（P＞0.05），而MP、TD和TD-ES组均显著增加（P＜0.05）。
2.2 石榴酒香气化合物
采用HS-SPME-GC-MS测定了5 种发酵酒样的挥发性化合物种类及含量，5 种酒样中共检测到62 种挥发性化合物，包括酯类22 种、高级醇12 种、脂肪酸6 种、苯衍生物7 种、萜烯类9 种、C6化合物2 种以及其他类化合物4 种。选定的酵母菌株及发酵方式对石榴酒中香气化合物的种类和含量均有显著影响，尤其是TD-ES处理组酒样中香气物质种类数量（图3A）和含量相对较高（图3B）。
高级醇是酵母菌株代谢的次级产物之一。5 种酒样共检测出12 种高级醇类物质，总质量浓度由低到高依次为MP（1 723.63 μg/L）、TD（2 497.86 μg/L）、MP-ES（2 713.59 μg/L）、TD-ES（3 198.95 μg/L）、ES（3 553.16 μg/L），均低于300 000 μg/L。其中异戊醇在高级醇中占比最大，且在ES组酒样中质量浓度最高（2 308.60 μg/L），另外，MP、TD、MP-ES和TD-ES处理组酒样中异戊醇含量相较ES处理组酒样分别降低了49.89%、22.50%、15.74%和6.09%。
酯类是果酒中的主要呈香物质，可以赋予果酒愉悦的花果香，对果酒复杂香气轮廓的形成具有关键作用。5 种酒样共检测出酯类22 种（乙酸酯6 种、乙基酯14 种和其他酯类物质2 种），酯类质量浓度最高的是MP-ES（11 306.71 μg/L）和TD-ES组酒样（11 977.77 μg/L），相较于ES组酒样分别显著增加了36.70%和44.81%（P＜0.05）。在乙酸酯中占比最大的是乙酸异戊酯，其质量浓度范围在153.89（MP）～3 322.62 μg/L（TDES），其次是乙酸乙酯。MP-ES与TD-ES组酒样的乙基酯质量浓度是ES组的1.43 倍和1.54 倍，且ES、MP-ES和TD-ES组酒样中辛酸乙酯在乙基酯类物质中占比最高，MP-ES与TD-ES组酒样中辛酸乙酯质量浓度相较于ES组分别显著提高了24.83%和42.08%（P＜0.05），其次为癸酸乙酯和己酸乙酯等物质。其他酯类物质含量在酯类化合物总量中占比较低，对石榴酒香气贡献相对较小。
低含量脂肪酸对果酒香气复杂性和平衡性具有积极意义，当其质量浓度高于20 000 μg/L时会产生刺激性气味和酸腐味。5 种酒样中共检测到6 种脂肪酸，总质量浓度范围为254.85（MP）～821.83 μg/L（ES），显著低于20 000 μg/L，其中辛酸占比最高，TD-ES与ES组酒样相比无显著差异（P＞0.05）；MP、TD和MP-ES组酒样相较于ES处理组酒样均显著降低（P＜0.05）。
苯衍生物对酒体果香复杂性具有积极贡献。各酒样中共检测到7 种苯衍生物，其中苯乙醇含量占比最高且变化趋势较为明显，MP-ES和TD-ES组酒样的苯乙醇质量浓度分别是ES组的1.29 倍和1.34 倍，而MP与TD组酒样相比于ES组酒样分别显著降低了23.91%和15.39%（P＜0.05）。其次占比较高的是乙酸苯乙酯和苯甲酸乙酯等物质，对石榴酒发酵香气轮廓形成具有一定的积极贡献。
萜烯类、C6化合物与C13-降异戊二烯等品种香气化合物的阈值较低，决定了果酒的品种香气特征。酒样中主要检测到包括芳樟醇、香茅醇、香叶醇、橙花醇和α-松油醇等10 种萜烯类化合物。与ES组酒样相比，MP、TD、MP-ES与TD-ES组的萜烯总质量浓度分别提升了23.35%、27.19%、50.72%和73.55%，而C6化合物总质量浓度显著下降（P＜0.05）。此外，还检测到大马士酮和香叶基丙酮等香气物质，尽管这些香气物质含量较低，但对石榴酒香气复杂性有一定的调节作用。
2.3 特征性香气化合物聚类分析
挥发性化合物对果酒香气质量的影响与其气味活性值（OAV）密切相关，而具有较高OAV的香气成分对调控果酒香气特征具有重要作用。OAV＞1的化合物已被确定对果酒的香气质量具有显著贡献，而0.1＜OAV＜1且属性相似的香气物质可通过叠加或协同作用对果酒整体香气特征产生积极效应。因此，本研究筛选OAV＞0.1的挥发性香气化合物作为石榴酒特征性香气物质。
5 种供试酒样中共检测到28 种特征性香气物质，包括萜烯5种、C13-降异戊二烯1种、高级醇3种、乙酸酯4种、乙基酯10种、其他酯1种、脂肪酸1 种和苯衍生物3种（图4）。MP与TD组酒样的特征性香气物质种类最少、含量最低；ES组酒样中异戊醇、正庚醇、正辛醇、乙酸辛酯、肉桂酸乙酯、辛酸异戊酯和辛酸含量较高（P＜0.05）；MP-ES和TD-ES处理组酒样中乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯和苯乙醇等化合物含量显著高于ES处理组酒样（P＜0.05）。
OAV＞1的化合物被认为是发酵型果酒的关键香气物质。供试酒样中芳樟醇、4-萜烯醇、大马士酮、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、辛酸、苯甲酸乙酯和乙酸苯乙酯11种香气物质的OAV均大于1，其中ES、MP、TD、MP-ES和TD-ES组酒样中分别含有8、7、8、8 种和11种，它们对石榴酒的整体风味具有显著贡献。TD-ES组酒样中4-萜烯醇（OAV＝4.33）、大马士酮（OAV＝570.82）、乙酸异戊酯（OAV＝110.75）、己酸乙酯（OAV＝149.67）、辛酸乙酯（OAV＝682.34）、癸酸乙酯（OAV＝10.88）、苯甲酸乙酯（OAV＝2.73）以及乙酸苯乙酯（OAV＝1.30）的OAV大于其他组酒样相对应化合物的OAV，具有呈现愉悦花香和果香的潜力。
2.4 特征性化合物PCA及香气属性分析
为了进一步揭示不同发酵酒样的特征性香气化合物与香气属性间的相关性，对5 种发酵酒样的28 种特征性香气物质进行PCA。如图5A所示，前2个PC分别解释了数据总体方差的62.0%和26.1%，各处理组的平行样本点之间离散型较小，表明组内均一性良好。MP-ES和TD-ES处理组位于PC1正半轴，与大马士酮、金合欢醇、香茅醇、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯以及乙酸异戊酯的相关性较强。
将5 个处理组中OAV＞0.1的香气化合物分为花香、草本味、甜香、核果类、热带水果类、柑橘味和脂肪味7个香气属性，通过累加属性相近化合物的OAV，得出石榴酒香气属性雷达图。由图5B可知，核果类、热带水果类和花香是石榴酒的主要香气特征，其中TD-ES组酒样的花香和热带水果类属性较突出，与金合欢醇、香茅醇、大马士酮、己酸乙酯、辛酸乙酯和苯乙酸乙酯的含量较高的分析结果相印证。
综合分析，与MP和TD处理组相比，ES、MP-ES和TD-ES处理组有利于促进特征性香气化合物的生成；同时，TD-ES处理组相较于ES和MP-TS处理组，对促进萜烯、乙基酯和苯衍生物的生成作用更加显著，有助于增强酒样的花香（蔷薇和玫瑰）、果香（梨、柠檬、柑橘和草莓）、甜香、醇香和蜂蜜味，提升石榴酒香气复杂性、典型性和愉悦程度。
2.5 感官评价
如图6所示，MP与TD处理组酒样的各感官属性得分均最低。ES处理组酒样色泽鲜艳且收敛性得分较高，可能与酒样TA含量较高有关。与MP、TD和ES组酒样相比，MP-ES组增强了花果香且酒体澄清度较好；TD-ES处理组酒样的花香、果香及典型性属性得分最高，与香气属性分析结果相印证。TD-ES处理组酒样口感清爽平衡，具有愉悦和谐的花香和果香，这与特征性香气化合物乙酸异戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯和大马士酮的OAV较高一致。由此进一步表明T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵对改善石榴酒感官特性具有明显积极贡献。
综上所述，T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵组的挥发性香气化合物含量最高，综合感官评分最佳；M. pulcherrima NX-2与S. cerevisiae ES488混菌发酵酒样次之；NS纯种发酵酒样最低。上述结果表明优选T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵可以显著提高石榴酒中挥发性香气化合物含量，并改善酒体感官品质。
03
石榴酒抗氧化能力分析
为了明确TD-ES混菌发酵对石榴酒抗氧化能力的影响，对石榴清汁（未添加皮渣）进行S. cerevisiae纯种发酵的酒样（WP）、优化皮渣浸渍工艺处理石榴汁分别接种S. cerevisiae的纯种发酵酒样（YP）和先接种T. delbrueckii，48 h后接种S. cerevisiae混菌发酵酒样（TD-ES）的DPPH自由基清除率、·OH清除率以及铁离子还原力进行测定，分析评估皮渣浸渍和混菌发酵对酒样抗氧化能力的影响。
DPPH自由基清除率与待测物的抗氧化能力呈正相关。如图7所示，YP和TD-ES处理组酒样DPPH自由基清除率最高，较WP组分别提高了24.19%和22.21%，而YP处理组与TD-ES处理组相比无显著差异（P＞0.05）。·OH是一种具有高度反应性的活性氧，能够显著调节细胞衰亡速率。由图7可知，YP处理组的·OH清除率较WP处理组提高了16.83%；与YP组相比，TD-ES组又极显著提高了5.22%（P＜0.01）。此外，铁离子是果酒中主要的金属离子之一，通过测定铁离子还原力能够进一步评估果酒的抗氧化能力。YP与TD-ES处理组酒样的铁离子还原力相较于WP处理组酒样均高度显著提高（P＜0.001），其中YP处理组相较于TD-ES处理组降低了6.48%，这与·OH清除率变化趋势一致。综上所述，TD-ES组酒样的综合抗氧化能力最高，YP组次之，WP组最低。上述结果表明添加皮渣进行石榴汁浸渍，并通过优选T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488进行混菌发酵能够显著提升石榴酒抗氧化能力。
04
4.1 皮渣浸渍对石榴酒TP含量和感官品质的影响
本实验结果表明，在石榴汁中添加皮渣浸渍后能够充分提高石榴酒的TP含量和感官品质。Wojdyło等研究发现适当的低温浸渍能够促进果皮中酚类等物质溶出，从而提升酒体层次感和色泽品质。4 ℃浸渍时，石榴酒的感官评分较高，TP含量较低。这是由于低温条件下石榴皮中大分子酚类物质的溶出受到了一定限制；而浸渍温度升高会促进细胞壁降解，能够快速浸渍出大量的小分子酚类物质，并促进微生物生长代谢，增加产酸速率，从而影响口感平衡，这与崔艳等的研究结果相似。在浸渍时间6～24 h条件下，酿造的石榴酒TP含量较低，但具有较高的感官评分。单宁是一类能够产生涩感的鞣性多元酚，而浸渍时间对单宁含量具有显著影响。李斌斌等的研究结果表明浸渍时间过长会导致单宁含量急剧增加，苦味和涩感加重。当皮渣与石榴汁料液比为100 g/L时，石榴酒的感官评分最高，这可能与石榴皮中富含多种酚类物质有关，高皮渣添加量会使石榴汁中单宁、黄烷-3-醇以及酚酸等物质含量急剧增加，降低酒样感官品质。
4.2 混菌发酵对石榴酒理化参数和香气质量的影响
不同酵母菌株发酵酒样理化指标分析结果表明，ES处理组酒样乙醇体积分数显著较高（P＜0.05），这与Liu Chunfeng等的研究结果一致。本实验中TD-ES处理组酒样的总酸含量相较于ES处理酒样显著降低（P＜0.05），表明T. delbrueckii NX-1菌株的产酸能力相对较弱。Zhang Pangzhen等研究表明TP含量与NS高产糖苷酶特性有关，β-葡萄糖苷酶能够分解植物组织的细胞壁，促进酚类等物质释放，使TP含量升高，与本研究结果类似。
与纯种发酵相比，混菌发酵均提高了石榴酒中挥发性香气成分含量，特别是T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵时，大多数挥发性化合物如乙酸酯、乙基酯、苯衍生物以及萜烯类物质含量显著增加（P＜0.05），显著提高了石榴酒的果香浓郁度和香气复杂性，这与本课题组任学梅等研究发现T. delbrueckii NX-1具有较高的酯酶活力，通过加强合成反应促进乙酸己酯、乙酸异戊酯和辛酸乙酯等积累的结果相类似。此外，酒样中乙酸酯含量增加也与混菌发酵过程中NS衰亡后的细胞裂解物，可为S. cerevisiae提供生长繁殖所需的氮源及其他营养物质，从而促进S. cerevisiae中ATF基因编码的醇乙酰转移酶催化形成乙酸酯有关。Deng Qiaoyun等研究证实酵母菌株之间的相互作用会提高S. cerevisiae对苯丙氨酸和其他底物的利用率，导致苯乙醇含量显著增加。本研究中混菌发酵组的苯乙醇含量显著上升，可归因于NS与S. cerevisiae正向相互作用促进苯丙氨酸代谢生成苯乙醇。异戊醇是乙醇发酵过程中主要生成的高级醇，在S. cerevisiae细胞中通过Ehrlich途径由亮氨酸降解产物合成。与ES组相比，混菌发酵中的异戊醇含量显著降低，这可能是由于T. delbrueckii中乙酰辅酶A的生产能力弱于S. cerevisiae，导致异戊醇的前体酸α-酮异己酸的含量较低，从而限制了异戊醇的生成。源自酿酒原料的萜烯类物质多以二糖苷键合态形式存在。与S. cerevisiae相比，T. delbrueckii能够分泌多种高活性糖苷酶，促进双糖苷键裂解释放单萜，从而提升酒体品种香气复杂性。混菌发酵同时也相对降低了C6化合物的含量，避免了石榴酒中生青味的产生，这与Benito等在葡萄酒中的研究结果一致。
OAV分析结果进一步表明，T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵显著促进了乙酸异戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯和苯乙醇等特征性香气化合物的生成，赋予酒样浓郁复杂的玫瑰、柠檬、菠萝、甜果和热带水果等香气属性。感官分析结果也表明TD-ES处理组酒样的综合感官评分最高，特别是香气、典型性以及平衡性等方面得分优异，这主要与T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵显著改善了石榴酒的香气物质种类和含量有关。
4.3 石榴酒抗氧化能力
抗氧化能力分析结果表明，YP与TD-ES处理组酒样的DPPH自由基清除率高度显著高于WP处理组（P＜0.001），主要与酒样中TP含量显著增加相关。Kwaw等的研究证实，酚类物质结构的酚羟基会提供氢原子与自由基结合，形成较为稳定的半醌式结构，降低自由基链式反应速度，表现出较强的抗氧化活性。有研究指出酚环结构的邻位羟基数量越多，DPPH自由基清除率越强；而间位结构的羟基对DPPH自由基清除率无显著影响。因此，TD-ES处理组酒样相较于YP处理组酒样TP含量升高，但DPPH自由基清除率无显著差异（P＞0.05），可能是由于含有间位羟基的酚类物质含量增加，而含邻位羟基的酚类物质含量无显著变化。黄酮类化合物C环上的C3位羟基是其清除·OH的关键基团，在其提供氢原子与·OH结合后，由于C环上羰基的吸电子作用，致使其结构更加稳定。因此，推测TD-ES处理组酒样相较于WP酒样·OH清除率显著升高可能与皮渣浸渍增加了黄酮类化合物含量相关。另外，与WP和YP处理组相比，TD-ES处理组酒样铁离子还原力高度显著提高（P＜0.001），这与混菌发酵酒样中多酚含量较高，能形成更多稳定的金属-多酚络合物，从而钝化金属离子对氧化反应的催化作用有关。铁离子还原力增强能够进一步提高石榴酒的抗氧化能力，使其在保藏过程具有更好的稳定性和更长的贮藏时间。
05
结 论
单因素试验和正交试验结果表明，采用优化的皮渣浸渍工艺既具有酿造高品质石榴酒的生产应用潜力，还可以促进石榴果皮的资源化利用。混菌发酵结果显示，NS菌株与S. cerevisiae顺序接种发酵能够显著增加石榴酒中TP含量，提高酯类、苯衍生物以及萜烯类等香气物质的含量，提升石榴酒香气复杂性和典型性。尤其是TD-ES处理组酒样抗氧化能力突出、花果香气浓郁、感官品质优异。综合分析，在浸渍温度6 ℃、浸渍时间24 h和皮渣添加量200 g/L条件下制取石榴汁，并接种T. delbrueckii NX-1与S. cerevisiae ES488混菌发酵能够改善石榴酒的香气品质并提高其抗氧化能力。
本文《 皮渣浸渍和混菌发酵对石榴酒香气品质及抗氧化能力的影响》来源于《食品科学》2025年46卷5期216-225页. 作者：柳秉红，魏玲玲，方艳，杨学山，祝霞. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240805-036. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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