本期推荐的是由华北理工大学药学院、河北省慢性疾病重点实验室、河北工业大学健康科学与生物医学工程学院等研究团队合作近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示淫羊藿苷通过cGAS - STING通路减轻神经炎症从而缓解认知功能障碍。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Icariin alleviates cognitive dysfunction by reducing neuroinflammation via the cGAS-STING pathway

民族药理学相关性
淫羊藿是一种中草药，以其补肾功效而闻名。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有多种药理特性，但其对阿尔茨海默病的影响尚需进一步探索。

研究目的
本研究旨在探讨淫羊藿苷通过环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子通路对阿尔茨海默病神经炎症的抑制作用。

材料与方法
采用SPF级雄性ICR小鼠，通过侧脑室注射Aβ1-42建立AD模型。通过行为学测试、病理学评估、免疫荧光染色、分子对接和蛋白质印迹分析，评估ICA治疗对小鼠记忆功能、神经元损伤、神经炎症以及cGAS-STING通路的影响。

结果
ICA能显著改善AD小鼠的记忆障碍，减轻神经元损伤和细胞凋亡，并抑制神经炎症。此外，ICA抑制了小胶质细胞的过度活化，促进了其从M1表型向M2表型的转化。它特异性抑制了cGAS-STING通路的激活，并下调了cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3和p-NF-κB/NF-κB的表达。此外，分子对接显示，ICA与cGAS的结合能为-7.07 kcal/mol，表明两者存在稳定的相互作用。使用cGAS选择性小分子抑制剂RU.521进行的进一步验证，证实了ICA通过cGAS-STING信号通路对小胶质细胞表型转化和神经炎症的保护作用。

结论
ICA通过cGAS-STING通路抑制小胶质细胞表型转化和神经炎症，在AD中展现出治疗潜力，使其成为靶向该通路的AD候选治疗药物。

图文摘要

【前言】

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经系统疾病，主要损害语言、记忆、认知和行为能力。AD的主要病理特征包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化产生的神经原纤维缠结。淀粉样蛋白级联假说认为，Aβ寡聚体在神经元突触处的过度产生和聚集会诱导氧化应激、神经炎症、细胞凋亡以及随后的神经退行性变。目前可用的AD治疗方法主要针对症状管理，无法改变疾病的根本进程。因此，迫切需要关注能够预防或治疗AD的药物研发。

随着对AD研究的不断深入，越来越多的证据表明，神经炎症是该疾病病理生理学的关键因素。作为中枢神经系统（CNS）主要的免疫细胞群，小胶质细胞深度参与神经炎症过程，并负责清除神经元周围的细胞碎片和废物。尤其重要的是，小胶质细胞具有生物物理独立性，它们参与CNS活动需要进行大量的结构重塑。在神经炎症过程中，小胶质细胞能够感知环境变化并发生形态转化，这对于其CNS功能至关重要。在健康的大脑中，小胶质细胞呈现分枝状形态，其特征是胞体小，具有众多突起，包括适量的初级分支和广泛分支的次级及三级突起，每个突起末端呈微小的锥形尖端。这些分枝状的小胶质细胞被认为是"静息状态"，在此期间，它们的分枝突起通过直接接触或分泌介质，持续不断地与神经元和其他胶质细胞相互作用。当CNS受损时，小胶质细胞被激活，伴随着形态从静息的分枝状态向阿米巴状态的转变。根据激活表型，小胶质细胞可分为M1和M2表型。前者表现出细胞毒性，而后者则具有神经保护特性。当M1型小胶质细胞被激活时，会产生促炎细胞因子，如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和活性氧（ROS）。在AD的病理过程中，Aβ和tau蛋白的特异性及过度磷酸化会触发小胶质细胞的M1型促炎反应，导致神经元细胞死亡并产生关键炎性细胞因子。相反，M2样反应性小胶质细胞可以通过吞噬作用减轻Aβ和tau的积累。近期研究表明，通过调节小胶质细胞的激活状态和神经炎症信号通路，可以改善包括AD在内的神经系统疾病的预后。

环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路构成了一种关键的胞质DNA感知机制，能够触发炎性细胞因子的产生，同时也参与诱导细胞凋亡。cGAS作为主要的胞质DNA传感器，能够识别外源性和内源性的异常双链DNA（dsDNA）。识别后，cGAS发生结构重排，催化鸟苷三磷酸（GTP）和腺苷三磷酸（ATP）反应，生成2‘3’-环状GMP-AMP（cGAMP）。cGAMP作为第二信使，与位于内质网（ER）上的衔接蛋白STING结合。当cGAMP与STING结合后，会引起构象变化，使得STING更容易从内质网转运到高尔基体进行激活。随后，STING招募TANK结合激酶1（TBK1），从而启动核因子κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3）的转录通路。这一级联反应最终导致炎性细胞因子和I型干扰素的释放，从而加剧炎症反应、免疫失调和神经元损失。值得注意的是，已有研究证实cGAS-STING通路在神经退行性疾病的发生中起作用。先前研究已证明，cGAS-STING通路通过刺激小胶质细胞并促进促炎细胞因子的释放，导致神经炎症和认知障碍。因此，抑制cGAS以缓解神经炎症，成为AD一种潜在有效的治疗策略。

淫羊藿是淫羊藿属的一种被子植物。作为一种中草药，其药用价值在《神农本草经》中已有记载，并被广泛认为具有补肾壮阳、强筋健骨以及祛风湿的功效。根据中医理论，AD与肾虚、脾虚、气血不足、痰湿阻络、血瘀等因素有关，这与淫羊藿的传统功效相吻合。淫羊藿苷（ICA）是从淫羊藿中提取的一种关键黄酮类化合物，具有穿过血脑屏障（BBB）的能力，并展现出多种药理作用，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫调节活性。研究表明，ICA对AD表现出显著的神经保护作用，具体体现在减少β-淀粉样蛋白沉积、改善氧化应激状态、促进突触可塑性、抑制神经元凋亡以及缓解认知障碍。此外，ICA已被证明能有效减少脂多糖（LPS）在BV2细胞系中诱导的神经炎症。然而，尽管ICA具有巨大的治疗潜力，但仍需进一步的深入研究和验证，以阐明其是否可能通过调节cGAS-STING信号通路来抑制神经炎症的具体机制。

在本研究中，我们初步评估了ICA对由Aβ1-42诱导的AD小鼠模型的学习记忆能力和神经炎症的潜在益处。此外，我们研究了ICA对cGAS-STING通路的影响，并利用cGAS选择性小分子抑制剂RU.521进一步验证了ICA对cGAS-STING诱导的小胶质细胞活化所引发神经炎症的保护作用。这项研究表明ICA在治疗AD方面可能具有潜力，从而为该领域未来的研究和开发奠定了坚实的基础。

【结果部分】

1. ICA改善AD小鼠的学习记忆障碍

图1. ICA对AD小鼠学习记忆能力的影响。数据以均值±标准差表示（n=12）。(A) 动物实验设计时间线。该图使用Biorender.com平台创建，协议编号：QU27CAW222。(B) 各组小鼠的游泳轨迹。(C) 小鼠在Morris水迷宫中连续5天寻找隐藏平台的平均潜伏期。(D) 空间探索试验中穿越平台的次数。(E) 空间探索试验中小鼠在目标象限的探索时间。(F) 新物体识别实验中的相对识别指数。(G) Y迷宫实验中小鼠的自发交替率。

2.ICA减轻AD小鼠的神经元损伤。

图2. ICA对AD小鼠神经元损伤的影响。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A，C）H&E染色的典型显微照片，包括CA1、CA3、DG和皮层区域（A，H&E染色，400倍）；全海马图像完整显示右侧海马组织，其中三个矩形框分别标示CA1、CA3和DG区域（C，H&E染色，100倍）。（B，D）尼氏染色的代表性图像，包括CA1、CA3、DG和皮层区域（B，尼氏染色，400倍）；全海马图（D，尼氏染色，100倍）。（E）CA1、CA3、DG和皮层区域尼氏小体的定量分析结果。

3.ICA减少AD小鼠的细胞凋亡。

图3. ICA对AD小鼠细胞凋亡的影响。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A）TUNEL染色代表性图片（TUNEL染色，200倍）。（B）海马CA1、CA3和DG区TUNEL阳性细胞数量（C）Bcl-2和Bax的代表性蛋白条带。（D）Bcl-2的标准化表达量。（E）Bax的标准化表达量。（F）Bcl-2/Bax比值。

4.ICA减轻AD小鼠神经炎症反应并调节小胶质细胞活化。

图4. ICA对AD小鼠神经炎症及小胶质细胞活化的抑制作用。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A、B）促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）表达结果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表达结果。（E）Iba1免疫荧光染色代表性图像（Iba1免疫荧光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性条带。（G）Iba1标准化表达量。（H）CD16标准化表达量。（I）Arg1标准化表达量。

5.ICA对cGAS-STING通路的影响。

图5. ICA抑制AD小鼠cGAS-STING信号通路活化。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白条带。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的标准化表达量。（G）ICA与cGAS分子对接实验结果。

6.ICA高剂量通过抑制cGAS-STING通路减轻神经炎症。

图6. ICA高剂量通过抑制cGAS-STING信号通路改善AD小鼠认知障碍和神经元损伤。数据以均值±标准差表示（MWM实验n=12，H&E和尼氏染色n=3）。(A) 各组小鼠游泳轨迹典型示意图。(B) 小鼠在Morris水迷宫中连续5天寻找隐藏平台的潜伏期。(C) 空间探索试验中穿越平台的次数。(D) 空间探索试验中小鼠在目标象限的探索时间。(E) 海马CA1、CA3、DG及皮层区域尼氏小体定量分析。(F) H&E染色典型显微图像，显示CA1、CA3、DG和皮层区域（H&E染色，400倍）；全海马图像完整显示右侧海马组织，三个矩形框分别标示CA1、CA3和DG区域（H&E染色，100倍）。(G) 尼氏染色代表性图像，显示CA1、CA3、DG和皮层区域（尼氏染色，400倍）；全海马图像（尼氏染色，100倍）。

图7. ICA高剂量通过抑制cGAS-STING信号通路减轻AD小鼠神经炎症并抑制小胶质细胞活化。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A、B）促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）表达结果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表达结果。（E）Iba1免疫荧光染色典型图像（Iba1免疫荧光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性条带。（G）Iba1标准化表达量。（H）CD16标准化表达量。（I）Arg1标准化表达量。

图8. ICA高剂量抑制AD小鼠cGAS-STING信号通路活化。数据以均值±标准差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白条带。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的标准化表达量。（G,H）海马区和皮层区域cGAS（红色）与Iba1（绿色）双重免疫荧光染色代表性图像，细胞核经DAPI（蓝色）复染（cGAS与Iba1双重免疫荧光染色，200×）。

7.机制图。

【结论与讨论】

阿尔茨海默病是一种与年龄相关的常见神经退行性疾病，其中Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化是其病理生理学的关键指标。在中枢神经系统中，包括小胶质细胞和星形胶质细胞在内的神经胶质细胞是神经炎症的主要介导者，在神经退行性疾病中具有至关重要的作用。越来越多的实验证据表明，Aβ沉积会激活小胶质细胞，从而启动神经炎症，最终导致神经元凋亡和认知功能下降。cGAS-STING信号通路是一条经典的炎症通路。ICA是一类源自天然的异戊烯化黄酮类化合物，具有多种生物学效应，如抗炎、抗氧化和神经保护特性。值得注意的是，研究表明ICA能增加小鼠CA3区的尼氏体数量，并增强AD小鼠模型的学习记忆能力。然而，ICA治疗AD的潜在机制仍不明确。在本研究中，我们提供的证据表明，ICA能改善AD小鼠的病理变化并提高其认知功能。此外，我们观察到AD小鼠脑中cGAS显著升高，这与神经炎症有关。使用RU.521特异性抑制cGAS，通过抑制STING和NF-κB相关的炎性细胞因子，显著减轻了炎症反应。总之，我们的研究结果表明，ICA可通过调节cGAS-STING信号通路抑制神经炎症，从而改善认知功能障碍。

神经炎症在包括AD在内的多种神经退行性疾病中起着关键作用。在大脑中，cGAS-STING通路主要在小胶质细胞中表达，并触发干扰素反应。小胶质细胞激活后会产生神经毒性物质，最终导致脑损伤。实际上，小胶质细胞在几种神经退行性疾病中表现出不同的表型并被激活。先前的研究将活化的小胶质细胞分为M1和M2型以反映其功能多样性。稳态下的小胶质细胞呈现高度分枝的形态，但激活后会发生诸如胞体增大、突起缩短等变化，并极化为M1或M2表型，以特定标记物为特征。由于多奈哌齐已被证明能有效减轻神经炎症和细胞凋亡，因此在本研究中被用作阳性对照药物。我们的研究重点评估了小胶质细胞的激活状态、形态以及炎症因子表达。值得注意的是，在ICA治疗组中，Iba1和CD16的表达显著降低，而Arg1的表达则明显增加。此外，ICA给药导致小鼠脑组织中促炎细胞因子减少，而抗炎细胞因子增加。这些发现表明，ICA能够减轻Aβ1-42诱导的炎症反应和小胶质细胞活化，这与先前的文献报道一致。此外，ICA对神经炎症的抑制作用可能归因于其能够抑制小胶质细胞的过度活化，同时促进其从M1表型向M2表型转化。另外，ICA能有效减少Aβ1-42引起的神经元凋亡，这可能是由于其能够阻止活化的小胶质细胞产生炎性细胞因子。

外源性和异常定位的内源性DNA可引发先天免疫反应。先前研究已确定cGAS是一种主要识别胞质DNA的关键模式识别受体。cGAS与胞质DNA结合后被激活，并促进cGAMP的产生，随后触发STING及其下游效应蛋白TBK1。这种激活级联导致IRF3和NF-κB等转录因子发生核转位，进而引发干扰素和炎症基因的表达。越来越多的证据支持cGAS-STING通路在神经退行性疾病的小胶质细胞介导的神经炎症中发挥作用。cGAS-STING通路能够激活NF-κB依赖性信号转导，这对于调节促炎细胞因子的转录以及包括细胞凋亡在内的多种细胞生物学过程至关重要。细胞凋亡可通过外源性或内源性途径进行调节，其中内源性途径的激活与DNA损伤、缺血和氧化应激等多种刺激密切相关。Bcl-2家族蛋白是内源性凋亡的核心，其中Bcl-2维持细胞存活，而Bax则激活凋亡途径。最近研究表明，STING可以激活NF-κB信号级联，并且siRNA p65介导的NF-κB信号阻断能显著减少STING诱导的细胞凋亡和衰老，同时改善STING介导的细胞外基质代谢失衡。我们的结果表明，在Aβ1-42诱导的AD小鼠脑组织中，cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IRF3/IRF3的表达水平均升高，而ICA干预逆转了这种升高。分子对接研究还发现ICA与cGAS之间存在显著的结合亲和力。小胶质细胞在受到刺激后可以发生极化，采用促炎或抗炎表型。已发现cGAS-STING通路的异常激活与细胞凋亡有关。在我们的研究中，观察到ICA通过抑制cGAS-STING通路来减轻神经炎症。这种抑制导致小胶质细胞的促炎极化减少，随后炎性细胞因子的释放也减少。通过缓解促炎微环境，ICA有助于减轻神经系统内的炎症环境。此外，这种抑制作用还降低了炎性介质对神经元的毒性作用，从而降低了神经元凋亡的风险。值得注意的是，RU.521是一种有效的选择性cGAS抑制剂，它通过血脑屏障发挥神经保护作用，并对神经元凋亡、小胶质细胞活化和小胶质细胞形态变化产生有益影响。我们的结果显示，单独使用RU.521或RU.521联合ICA-H治疗的小鼠，上述蛋白的表达显著降低，并且这些治疗与单独使用ICA-H相比无显著差异。此外，cGAS和Iba1的共定位分析显示，cGAS主要在海马和皮层的小胶质细胞中表达。这些数据突显了ICA通过cGAS-STING通路减轻神经炎症，从而改善AD相关认知功能下降的潜力。

在本研究中，我们以神经炎症为重点考察了ICA的作用机制。研究发现，ICA能促进小胶质细胞从M1表型向M2表型转化，从而减轻由小胶质细胞过度活化引起的神经炎症反应。此外，ICA通过阻止cGAS-STING信号通路的激活来抑制炎性细胞因子的表达。值得注意的是，我们的研究还发现，随着cGAS-STING通路的激活，NF-κB的表达水平也同步增加。然而，我们的研究存在一些局限性。首先，经典的STING-IRF3-I型干扰素通路在AD中的作用尚未完全阐明。其次，尚未评估这些通路在其他细胞类型中的调节潜力，因此值得进一步研究。最后，本研究观察到ICA可能通过两种协同机制发挥调节作用：ICA通过直接与cGAS结合来抑制其功能活性，从而阻断cGAS-STING信号通路的激活；ICA可能通过促进cGAS蛋白降解或抑制其表达来降低细胞内cGAS蛋白水平，从而从源头上阻止通路激活。这两种机制可能协同作用，共同构成了ICA调节cGAS-STING通路的分子基础。未来的实验将进一步研究ICA降低cGAS蛋白水平的能力与其通过直接结合与cGAS蛋白相互作用的机制之间的关联。

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