棉花（Gossypium spp.）作为全球重要的经济作物之一，是天然纺织纤维的主要来源。在我国棉产区，黄萎病主要是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起，这种土传真菌会严重影响棉花产量和纤维品质。大丽轮枝菌通过分泌植物毒素破坏水分和养分运输，导致维管束功能障碍，最终引发叶片萎蔫、早期落叶和维管束坏死（Chen et al., 2016；Shaban et al., 2018；Billah et al., 2021）。该病原菌传播迅速且防治手段有限，加剧了全球棉花生产损失。为减少黄萎病造成的棉花产量损失，增强棉花抗病性，培育抗病的棉花品种已成为当务之急。因此，解析棉花抵抗黄萎病的分子机制对品种改良至关重要。
近日，河南大学苗雨晨教授团队在棉花黄萎病抗性机制研究上取得重要进展。The Plant Journal杂志在线发表了题为The R2R3-MYB transcription factor GhMYB315 associates with GhVQ28 to enhance Verticillium wilt resistance in upland cotton by regulating phenylpropanoid metabolism的研究论文。从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中鉴定出一个受大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）显著诱导的R2R3-MYB转录因子GhMYB315。通过CRISPR/Cas9技术敲除GhMYB315减弱了棉花对大丽轮枝菌的抗性，而过表达该基因能提高拟南芥和棉花对大丽轮枝菌的抗性。转录组分析表明，GhMYB315过表达棉花中苯丙烷生物合成基因显著上调表达。代谢组学分析显示，接种大丽轮枝菌后，GhMYB315过表达能促进黄酮类化合物和木质素的积累，并增加木质素愈创木基和紫丁香基单体的含量。酵母双杂交筛选发现含有VQ基序的蛋白GhVQ28与GhMYB315互作，在GhMYB315过表达株系中沉默GhVQ28降低了棉花对黄萎病的抗性。综上所述，本研究揭示了GhMYB315-GhVQ28模块通过正向调控苯丙烷代谢途径介导的黄萎病抗性，为解析棉花黄萎病抗性机制提供了新见解。
1. GhMYB315的筛选与功能鉴定
为鉴定参与棉花对大丽轮枝菌抗性反应的R2R3-MYB家族成员，我们通过PlantCARE数据库筛选出42个同时含有水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件的棉花R2R3-MYB基因。系统进化分析表明，筛选出的R2R3-MYB家族成员在植物进化过程中具有保守性。表达分析显示，接种大丽轮枝菌18天后，42个R2R3-MYB基因中有7个在感病和抗病棉花品种中均上调表达（图S3a），其中已知GhMYB108可正向调控棉花对大丽轮枝菌的抗性（Cheng et al., 2016）。其余6个基因（GhMYB4L、GhMYB41、GhMYB61、GhMYB78、GhMYB102和GhMYB315）通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术在ZZM2棉花植株中进行沉默，以研究其对黄萎病病程发展的影响（图S3b、c）。接种大丽轮枝菌14天后，与TRV:00对照植株相比，TRV:GhMYB315沉默植株表现出严重的病害症状，包括黄化、萎蔫、落叶、病情指数增加及维管组织严重褐变（图S3d-f）。因此我们选择GhMYB315进行后续功能研究。
图S3 转录因子GhMYB315的筛选与功能鉴定
2. GhMYB315在黄萎病抗性中的功能
为研究GhMYB315在棉花抵御大丽轮枝菌中的功能，利用CRISPR/Cas9技术创制两个敲除突变体系Ghmyb315-koGhmyb315-ko（图3a, b）。以及两个独立过表达转基因株系GhMYB315-OEGhMYB315-OE，GhMYB315转录水平较野生型（WT）提高10-20倍（图3f）。接种大丽轮枝菌14天后，表型观察显示Ghmyb315-koGhmyb315-ko，包括黄化、萎蔫和落叶，而过表达株系GhMYB315-OEGhMYB315-OE（图3c）。与野生型相比，敲除突变体的茎菌落恢复显著升高（图3d），维管组织褐变更严重（图3e），真菌生物量更高（图3i）。此外，敲除突变体的病情指数显著高于野生型（图3g）。相反，过表达株系在所有检测指标中均呈现与敲除突变体相反的趋势，其病害症状轻于野生型对照（图3d-e, 图3g-i）。根据黄萎病分级系统，植株病情严重程度从0级到4级递增。实验中，约40%野生型植株在14天时被划分为3-4级；敲除突变体中3-4级植株比例达70%；而过表达株系中仅10%植株处于3-4级（图3h）。这些结果表明GhMYB315能增强棉花对黄萎病的抗性。
图3 GhMYB315正调控棉花黄萎病抗性
3. GhMYB315调控苯丙烷途径响应大丽轮枝菌侵染
通过转录组学和代谢组学分析整合到苯丙烷途径的示意图中，突出显示接种大丽轮枝菌后上调的代谢物或相应基因（图5a）。此外，茎切片染色观察显示，大丽轮枝菌侵染后，GhMYB315-OEGhMYB315-OE（WT）显著增加。LC-MS分析表明，即使在未感染条件下，GhMYB315过表达株系的根皮素、(-) 表儿茶素和 (+)儿茶素含量均高于野生型，且过表达株系在接种大丽轮枝菌后这些物质含量进一步升高。木质素单体分为三种类型：对羟基苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）。GC-MS分析显示，在对照条件下野生型与过表达植株的木质素单体含量存在差异。大丽轮枝菌侵染会影响野生型植株的单体含量，并显著提升GhMYB315-OEGhMYB315-OE。此外，接种大丽轮枝菌后，GhMYB315-OEGhMYB315-OE/S比值较野生型呈现升高趋势。综上表明GhMYB315通过积累木质素和黄酮类化合物增强棉花对黄萎病的抗性。
图5 转录组与代谢物揭示GhMYB315调控类黄酮和木质素途径响应黄萎病
4. 下调GhVQ28削弱了棉花黄萎病抗性
为探究GhVQ28在棉花抗黄萎病中的作用，首先检测了接种大丽轮枝菌后TM-1和ZZM2棉花品种根部GhVQ28的表达水平。RT-qPCR分析显示，TM-1根部在接种后1小时即出现GhVQ28表达水平的显著上升，而ZZM2根部则在接种后3小时出现诱导表达（图7a）。进一步通过VIGS技术抑制ZZM2棉花中GhVQ28的表达后，植株对大丽轮枝菌的敏感性增强（图7b, c）。接种14天后，与TRV:00对照植株相比，TRV:GhVQ28沉默植株出现更严重的黄化、萎蔫和落叶等病害症状（图7b）。病情分级统计表明，TRV:GhVQ28植株中约40%达到3/4级病害程度，而对照组这一比例仅为20%（图7d）。此外，TRV:GhVQ28植株的病情指数显著升高，维管褐变更严重，茎秆真菌恢复和相对真菌生物量均显著高于TRV:00对照组（图7e-h）。这些结果表明沉默GhVQ28基因会增强棉花对大丽轮枝菌的感病性。
图7 下调GhVQ28削弱了棉花的黄萎病抗性
GhVQ28-GhMYB28模块介导棉花大黄萎病抗性的模式图
河南大学苗雨晨教授团队长期致力于植物环境适应与改良和次生代谢调控方面的研究。近年来，在国际著名学术刊物《The Plant Cell》、《PNAS》、《Science Bulletin》等发表文章20余篇。
河南大学生命科学学院、棉花生物育种与综合利用全国重点实验室、作物逆境适应与改良国家重点实验室、河南大学三亚研究院苗雨晨教授为文章通讯作者。博士研究生郭玉涛、博士后钱艳敏为论文的共同第一作者。河南大学贾昆鹏教授、李坤副教授为本研究提供了重要指导，王骁博士为转录组和代谢组分析提供帮助。澳大利亚昆士兰大学Jimmy Botella教授对论文的修改提供了重要建议。该研究得到了国家自然科学基金国际合作与交流项目的资助。
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https://doi.org/10.1111/tpj.70562
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