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Introduction
螺旋藻是一种分布广泛的光合作用自养原核生物。目前关于螺旋藻食用化的研究大多是将螺旋藻全藻加入食物中，而螺旋藻的细胞壁比较坚硬，藻类中的营养物质很难溶解。其丰富优质的类胡萝卜素具有巨大的食品价值和保健功能，以及很高的研究价值。类胡萝卜素多种多样，不同种类的类胡萝卜素的生理活性也多种多样。在保持视力健康方面，类胡萝卜素是至关重要的VA维生素原，不容忽视。类胡萝卜素的健康优势，除了具有很强的抗氧化能力外，也不容忽视。类胡萝卜素通过形成含有磷脂和胆汁盐的胶束被小肠上皮细胞吸收和利用，然后类胡萝卜素通过淋巴系统和体液循环转运到全身的速度决定了它们的活跃功能。
类胡萝卜素的低稳定性限制了它们的适用性。脂质体主要用于食品工业，以封装不稳定的活性物质和脂溶性化合物，以扩大其在食品中的可用性。它们无毒、无害、易消化且可生物降解。在橙汁中添加脂质体以封装VC和生育酚已被证明即使在巴氏杀菌过程之后也能保持其活性。同时，脂质体封装增强了生物活性化学物质的溶解度，同时保持其结构不被破坏，从而提高了食品的生物利用度和保质期。在食品加工中采用脂质体水凝胶的工作具有科学性和创造性，基于脂质体水凝胶对嵌入化学品的稳定影响以及释放的多重控制和管理，在功能性食品的设计和开发中具有潜在的应用。脂溶性营养物质在人体胃肠液的水系中难以消化吸收，无法最大限度地发挥螺旋藻特定营养素的营养价值。此外，类胡萝卜素的应用多为单一β-胡萝卜素或叶黄素等的加工应用，关于螺旋藻全类胡萝卜素在食品中的应用报道较少。
海藻酸钠是一种在组织修复和药物递送等方面具有较高应用价值的生物材料。它是一种天然多糖，具有多阴离子、无毒、热稳定、可生物降解、缓释特性，主要从褐藻中提取。由于其与药物的相容性而不影响药理作用，已被证明在药物的缓释和控释方面具有更天然的优势。海藻酸盐可以在温和的条件下通过离子交换与二价阳离子螯合，这些分子反应迅速并快速交联，形成具有一定机械强度的水凝胶。携带药物或携带活性成分的脂质体目前存在的状态通常是流动性较大的悬浮液，药物或功能成分容易泄漏，将脂质体制备成海藻酸盐水凝胶可以有效解决此类问题，增加脂质体的稳定性。水凝胶的固态还可以进一步保护药物或功能性成分分子，起到缓释作用。
本研究希望通过开发类胡萝卜素脂质体水凝胶（Car-Lip-hy）缓释系统来克服由于脂溶性类胡萝卜素分子和海藻酸钠分子之间相互作用而导致的水凝胶生成困难。利用X射线衍射（XRD）、X射线光子能谱（XPS）和量子化学计算研究了类胡萝卜素脂质体（Car-Lip）的分子结构和稳定性，并详细介绍了Car-Lip的脂质体嵌入如何影响其氧化还原能力。这项研究对于将脂溶性营养素纳入凝胶粉具有重要意义。
Results
Car-Lip的微观结构
对空白脂质体及包埋类胡萝卜素的脂质体进行了形态学分析，结果如图1所示：两种脂质体均呈现出表面光滑的球形结构，且粒径分布不均。其中，包埋类胡萝卜素的脂质体粒径显著大于空白脂质体，这一现象可归因于以下原因：在螺旋藻类胡萝卜素中占比最高的β-胡萝卜素，其分子链长度远大于脂质体双分子层疏水区域的厚度；因此，β-胡萝卜素在脂质体中的排列必然会呈现倾斜状态，与膜结构形成一定夹角，这一排列方式导致脂质体双分子层的疏水区域发生延展，包埋作用使脂质体双分子层疏水区域扩大，最终造成包埋后脂质体的粒径增大。
图1 空白脂质体和Car-Lip在100和600 nm处的TEM
Car-Lip的氧化还原能力
ABTS实验结果如图2A所示。与游离类胡萝卜素相比，脂质体包埋后类胡萝卜素的ABTS自由基清除率有所提高，DPPH自由基清除率实验（图2B）也显示出相同的结果。类胡萝卜素被脂质体包封，以提高其在水溶液中的溶解度和分散性，使脂质体包埋后的类胡萝卜素表现出比游离类胡萝卜素更高的抗氧化能力。此外，包埋后类胡萝卜素的抗氧化能力还与其在（脂质体）膜中的结合位置相关。螺旋藻类胡萝卜素能够跨磷脂膜排列，这一特性也提高了其与膜平面上ABTS、DPPH自由基的反应能力。
图2 （A）ABTS自由基和（B）DPPH自由基清除游离类胡萝卜素和Car-Lip，（C）还原Car-Lip和VC对三价铁离子的能力，（D）空白脂质体和（E）中TBARS的变化率
类胡萝卜素和VC的还原性的实验结果如图2C所示。Car-Lip的还原性随浓度升高呈线性增强；当浓度达到10 μg/mL后，其对铁离子的还原能力显著高于VC。这是由于Car-Lip的粒径小、表面积大，增加了与铁离子的接触面积。
本研究选择蛋黄卵磷脂制备脂质体。蛋黄卵磷脂由于饱和脂肪酸含量较高，比大豆卵磷脂具有更好的抗氧化能力，但其分子中存在不饱和双键，使其仍然容易被氧化。脂质酰基链被破坏，脂质双层的稳定性受到影响。在脂质体制备过程中，环境中温度、光照、金属离子等因素的存在也促进了蛋黄卵磷脂的过氧化过程。从图2D-E可看出，Car-Lip的抗过氧化能力随浓度变化而变化：类胡萝卜素含量的增加，会增强脂质体对TBARS的抑制能力；但当类胡萝卜素含量超过0.4 mg/mL时，脂质体对TBARS的抑制作用却显著下降。这一现象可能是因为过量添加的蛋黄卵磷脂，其氧化速度超过了类胡萝卜素对过氧化反应的抑制速度。结合Car-Lip的包封速率，类胡萝卜素的存在阻断了脂质过氧化反应，减缓了蛋黄卵磷脂的氧化过程，保持了脂质体膜的结构完整性，导致包封的类胡萝卜素具有良好的保留性，类胡萝卜素与卵磷脂膜之间存在显著的协同保护作用。
Car-Lip-hy的物理性质
通过测定WHC，可检测Car-Lip-hy在离心力作用下阻止水分从凝胶网络中流失或释放的能力，这一指标在一定程度上也能反映凝胶结构的强度与稳定性。如图3A所示：脂质体浓度对凝胶WHC的影响并不显著；当海藻酸钠-钙离子浓度处于1%～2%时，水凝胶的持水力低于55%；而当海藻酸钠-钙离子浓度提升至2%～5%时，脂质体水凝胶的持水力可维持在63%～68%之间。该持水力水平用于果冻、软糖等休闲食品中时，属于理想状态。
图3 （A）不同Car-Lip用量、海藻酸钠和钙离子用量比对WHC的影响，（B）不同脂质体和Car-Lip添加对水凝胶溶胀率的影响，（C）不同Car-Lip添加对水凝胶质地的影响
研究了B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的溶胀稳定性。不同量的空白脂质体和Car-Lip对水凝胶溶胀率的影响如图3B所示。随着脂质体添加量的增加，水凝胶的溶胀率显著降低。这是因为脂质体的存在填补了海藻酸钠和钙离子交联结构的空白，从而阻碍了水分子的进入。同时，蛋黄卵磷脂疏水尾部长烃链的存在也在一定程度上降低了凝胶网络对水分子的保留能力。此外，添加嵌入类胡萝卜素的脂质体进一步降低了水凝胶的溶胀率，这归因于脂溶性类胡萝卜素的疏水性，降低了水凝胶网络对水分子的亲和力。
TPA分析
如图3C所示，随着脂质体添加量的增加，由于脂质体分子与凝胶结构的相互作用，水凝胶珠的硬度和弹性呈现增加趋势。脂质体的加入使与钙离子交联的海藻酸钠分子由于Ca和P的相互吸引而与卵磷脂分子形成紧密结合，从而增加了凝胶结构的硬度。卵磷脂分子疏水区存在2条长烃链和脂溶性类胡萝卜素导致弹性增加。同时，脂质体对类胡萝卜素的包埋体系具有良好的水溶性，有效避免了游离类胡萝卜素油滴对凝胶硬度的减弱作用。
Car-Lip-hy的微观结构
通过SEM观察B-hy、Lip-hy及Car-Lip-hy的微观结构，结果如下：图4A为B-hy的SEM图像，可见其呈现球形结构，且球体尺寸不均、排列密集；图4B为Lip-hy的图像，加入脂质体后，水凝胶体系中分散着均匀致密的交联结构，同时穿插有平行排列且规则有序的条纹，尺寸不均的球形颗粒结构则聚集在同一区域；图4C显示，加入类胡萝卜素后，水凝胶原本笔直有序的排列状态被破坏，原本聚集的尺寸不均球形颗粒发生分散，呈现出局部致密、局部疏松的状态。这一结果表明，类胡萝卜素与脂质体的加入，对水凝胶的致密网络结构产生了填充与破坏作用。
图4 B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的SEM
XRD的FTIR和相位分析
图5A展示了在500～4000 cm−1波长范围内，Car、B-hy、25% Lip-hy、75% Lip-hy、25% Car-Lip-hy和75% Car-Lip-hy的FTIR光谱。脂质体和水凝胶的FTIR光谱在3347 cm−1处出现明显峰值，这是由O−H在3100～3500 cm−1处的拉伸振动引起的。与游离类胡萝卜素相比，脂质体和水凝胶的样品发生了峰位移，峰分别为3352、3343、3345、3346和3350 cm−1。这一结果可归因于类胡萝卜素、蛋黄卵磷脂和海藻酸钠分子之间的相互作用。此外，B-hy和Lip-hy在1598 cm−1处的峰，与海藻酸钠和钙离子之间形成的离子键有关。在类胡萝卜素谱中，2975 cm−1 处的峰值代表CH2中C−H的伸缩振动，1656 cm−1处的特征峰与C=C的拉伸有关。类胡萝卜素的特征峰（1656 cm−1）在脂质体和水凝胶的红外光谱中几乎消失，表明类胡萝卜素被包埋在脂质体中。此外，脂质体和水凝胶光谱中1428和1010 cm−1处的峰发生了偏移，这主要是由于疏水性C−H键的变化，这进一步表明类胡萝卜素保留在脂质体中。
图5 B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的FTIR和XRD
XRD是一种确定材料的相组成、晶体结构和结晶度的表征方法。通过Jade软件对B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的XRD数据进行处理，得到相应的衍射峰信息。B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的XRD图谱如图5B所示。可以看出，海藻酸钠与钙离子交联形成的水凝胶在2θ=20.88°处衍射峰较宽，峰分散，强度低。主要是由于海藻酸钠的分子内和分子间极性相互作用，表明海藻酸钠与钙离子交联形成的水凝胶具有一定的晶体结构，但结晶度较低。与B-hy衍射峰相比，Lip-hy的衍射峰向左移动，在2θ=20.0°处存在较强的衍射峰。峰值强度的增加可能与蛋黄卵磷脂液晶-晶体结构对海藻酸钠交联钙离子水凝胶过程的促进有关。此外，在加入空白脂质体后，SEM结果显示视场显示出更有序的条状排列微观结构也证实了这一点。当脂质体进一步嵌入类胡萝卜素时，Lip-hy的衍射峰向右移动，在2θ=21.1°处出现明显的衍射峰，但峰强度低于Lip-hy。当与钙离子交联形成水凝胶时，脂溶性类胡萝卜素的加入可能起到修饰剂的作用，体系中的无定形物质增加，导致结晶度较弱。SEM视野中类胡萝卜素的加入，使得排列整齐的条带区域变得凌乱，这也印证了这一点。
热重分析
热重分析结果表明，所有样品的失重大致可分为2个阶段（图6A）。第一阶段在40～80°C时的失重是由样品中吸附水和结合水的损失引起的。第二阶段在190～500 °C时的失重是由聚合物的热降解引起的。与B-hy和Lip-hy相比，Car-Lip-hy在205 °C时出现新的吸热峰，这可能是由类胡萝卜素分解引起的（图6B）。与B-hy相比，Lip-hy的吸热峰向高温侧移动，表明加入卵黄卵磷脂的长烃链散布在凝胶结构中，增加了凝胶结构的稳定性。然而，类胡萝卜素的添加使吸热峰向左移动。结合扫描电镜分析，是因为类胡萝卜素的添加破坏了原来排列整齐的凝胶结构，降低了热稳定性。
图6 B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的TGA和DSC
XPS
XPS可以反映物质的结合能、化学状态和含量，因此XPS用于观察B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy样品中元素的化学化合价变化。图7A是制备材料的全光谱。从图中可以发现，C、O和Ca是主要成分。图7B为XPS的O1s光谱，531.23和532.43 eV处的衍射峰分别归因于C−O和−OH。根据拟合结果，图7C中347.66和351.33 eV处的峰分别对应钙的2p轨道分裂峰（Ca 2p₃/₂和Ca 2p₁/₂），表明Ca在三组样品中以+2价的形式存在。添加类胡萝卜素包埋脂质体后，Ca结合能显著降低，表明类胡萝卜素的添加促进了Ca和P的接近，导致电子转移，从而降低了结合能。图7D为P 2p的窄扫描图。在B-hy样品中未观察到P。而Lip-hy和Car-Lip-hy因添加了蛋黄卵磷脂（含P），出现了P的衍射峰，其中133.36 eV和134.31 eV处的峰分别由磷的2p轨道分裂峰（P 2p₃/₂和 P 2p₁/₂）引起。包埋类胡萝卜素后脂质体的结合能降低，进一步证明了上述猜想，并解释了类胡萝卜素与卵磷脂之间可能存在很强的相互作用。
图7 B-hy、Lip-hy和Car-Lip-hy的XPS
量子化学计算
如图8A和B所示，研究对海藻酸钠与蛋黄卵磷脂的聚集结构，以及β-胡萝卜素与蛋黄卵磷脂的聚集结构进行了优化。从图中可观察到，2个海藻酸钠分子通过钙离子发生交联，且海藻酸钠-钙离子交联体系整体与蛋黄卵磷脂的聚集作用，发生在钙元素与磷元素所在的位置。图8C为β-胡萝卜素与卵磷脂最优结合位点的结合能图谱，而最优的聚集结构组合则如图8B所示。在分子对接结果中，β-胡萝卜素与卵磷脂形成的所有聚集结构，均以卵磷脂的疏水烃链为主导（即疏水烃链是二者实现稳定结合的核心区域）。
图8 （A）海藻酸钠与蛋黄卵磷脂的聚集结构示意图和（B）β-胡萝卜素与蛋黄卵磷脂的聚集结构
如图9A和B所示，红色部分代表分子间作用力，黑色部分代表分子内作用力（本研究仅聚焦分子间作用力）。红色部分集中在sign (λ₂)ρ＝0附近，这表明在二聚体中，单体分子间的相互作用以色散作用为主导。该色散作用的具体位置，在图9C和D的绿色区域中得到了直观体现。海藻酸钠的钙离子交联结构与蛋黄卵磷脂聚合体之间的相互作用，以及β-胡萝卜素与蛋黄卵磷脂之间的相互作用，主要以范德华力和部分氢键为主，这一结论与红外光谱分析结果一致。
图9 （A）海藻酸钠与蛋黄卵磷脂与（B）β-胡萝卜素与卵磷脂聚集的弱相互作用IGM散点图；（C）海藻酸钠与蛋黄卵磷脂的聚集结构示意图和（D）β-胡萝卜素与蛋黄卵磷脂的聚集结构
结合SEM图像可以分析，脂质体的加入破坏了均匀致密的交联结构，出现了平行有序的条纹。可能是由于蛋黄卵磷脂的两条长烃链破坏了海藻酸钠和钙离子交联的均匀结构，蛋黄卵磷脂的两条长烃链平行有序排列，填充了海藻酸钠和钙离子的交联结构。类胡萝卜素的添加破坏了原有的笔直有序排列，这是由于类胡萝卜素和蛋黄卵磷脂的长烃链分子聚集所致。体系中类胡萝卜素的结合位点主要集中在蛋黄卵磷脂的疏水尾部，而海藻酸钠的结合位点主要集中在蛋黄卵磷脂中P的头部位置。综上所述，蛋黄卵磷脂在系统中作为桥梁存在，排列有序，很好地连接了类胡萝卜素和海藻酸钠分子。
体外缓释
体外释放研究可用于评估脂质体和凝胶的释放特性以及螺旋藻类胡萝卜素对脂质体水凝胶包埋系统的亲和力。本研究研究并比较了Car-Lip和Car-Lip-hy在模拟胃和肠液环境中的体外释放特性。如图10A所示，游离类胡萝卜素溶液由于透析膜的屏障作用，也表现出明显的缓释现象。然而，与溶液中的游离类胡萝卜素相比，Car-Lip和Car-Lip-hy的释放效果较慢。此外，Car-Lip和Car-Lip-hy在前10 h内表现出相对较快的释放速度。在pH 1.2时，未包封的类胡萝卜素和吸附在脂质体表面的类胡萝卜素的快速释放率分别为47.0%和27.3%。在pH值7.2时，Car-Lip释放了43.4%。然而，与游离类胡萝卜素和Car-Lip相比，Ca-Lip-hy表现出更明显的缓释现象。这是因为类胡萝卜素的释放需要穿过脂质相才能到达水凝胶-脂质体界面，以便通过三重扩散屏障进行最终释放。此外，在肠液模拟环境（pH 7.2）中，水凝胶发生收缩强化，网络密度上升，类胡萝卜素的扩散阻力上升，坚硬的水凝胶结构延缓脂质的释放，进一步抑制脂质体中类胡萝卜素的释放。为了进一步研究Car-Lip和Car-Lip-hy游离类胡萝卜素的体外释放动力学，采用一阶动力学模型拟合释放数据。如图10B所示，pH 1.2时Car-Lip和Car-Lip-hy的一阶动力学模型相关系数（R2）与pH 7.2时游离类胡萝卜素和Car-Lip的相关系数（R2）在0.91～0.99之间。因此，Car-Lip和Car-Lip-hy释放类胡萝卜素符合一阶动力学模型。
图10 类胡萝卜素Lip-hy和Car-Lip-hy的（A）体外释放图和（B）一阶动力学拟合曲线
基于上述研究理论，试制了初步产品类胡萝卜素凝胶软糖。根据软糖感官评价结果，当Car-Lip添加量为30%，交联时间为5 min，糖添加量为10%时，软糖可以达到最佳的口感和口感，以及质地多汁感。经与市售软糖的对比分析，发现制备的软糖除了含有类胡萝卜素外，营养价值更高，pH值普遍趋于中性，含水量高，热稳定性高于所有市售商品，具有良好的市场潜力。
Conclusion
综上所述，本研究以卵磷脂分子为介质连接类胡萝卜素分子和海藻酸钠分子，通过海藻酸钠和钙离子的交联作用，制备Car-Lip成凝胶。结果表明，与类胡萝卜素相比，Car-Lip的自由基清除能力、还原能力和抗脂质过氧化力均显著提高。凝胶的WHC受脂质体添加量影响，可稳定维持在63%～68%之间；且随着脂质体添加量的增加，水凝胶珠的硬度和弹性呈上升趋势。此外，类胡萝卜素和脂质体的添加降低了水凝胶的溶胀率；Car-Lip的加入使蛋黄卵磷脂的长烃链分散了水凝胶均匀致密的网络结构，其中卵磷脂分子作为“桥梁”存在，使类胡萝卜素和海藻酸钠分子连接良好。与游离类胡萝卜素相比，Car-Lip和Car-Lip-hy的释放效果较慢，符合一级动力学模型。本研究基于脂质体模型制备类胡萝卜素水凝胶，成功构建了类胡萝卜素与海藻酸钠分子间的稳定连接，并尝试将其应用于类胡萝卜素凝胶软糖产品的制备，最终获得品质更优的产品。该研究为脂溶性营养素在食品中的应用提供了理论依据，同时丰富了脂溶性营养素的食品应用场景。
Construction and application of Spirulina carotenoid hydrogel sustained-release system
Weihong Sun1,2†, Luqian Yang1,2†, Lijuan Wang1,2, Kai Zhu1,2, Xinxing Xu1, Fangwei Li1,2*
1 State Key Laboratory of Marine Food Processing & Safety Control, College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao, 266400, China
2 Sanya Institute of Oceanography, Ocean University of China, Sanya, 572000, China
†Weihong Sun and Luqian Yang contributed equally to this work and should be considered co-first authors.
*Corresponding author.
Abstract
The fat solubility, sensitivity to light and heat, and special molecular structure of carotenoids limit their application in solid recreational foods. In this study, a carotenoid hydrogel slow-release system was constructed using
Spirulinaas raw material to regulate the effects of carotenoid fat solubility and heat sensitivity on its processed products, and liposomal encapsulation of
Spirulinacarotenoids was utilized to explore the mechanism of lecithin molecules-mediated formation of carotenoid/sodium alginate molecular gels and to study the molecular structure of the gels, so as to regulate the effects of carotenoid fat solubility and heat sensitivity on its processed products and apply them to solid leisure foods such as soft candies. The results showed that the optimal conditions for gel preparation were 2% sodium alginate dosage and 5% calcium ion concentration, and the gel water holding capacity was maintained between 63% and 68% depending on the amount of liposomes added, and the hardness and elasticity of the hydrogel beads showed a tendency to increase with the increase in the amount of liposomes added. Egg yolk lecithin existed in the system as a bridge with regular and orderly arrangement, and was well connected with carotenoids and sodium alginate molecules. The interaction between the three molecules was mainly hydrogen bond and van der Waals interaction. Compared with free carotenoids, the sustained-release effect of carotenoid liposome (Car-Lip) and carotenoid liposome hydrogel (Car-Lip-hy) was enhanced. However, the free radical scavenging rate of Car-Lip was 11.87% higher than that of free carotenoids. This study will have great reference significance for the food application of Spirulina carotenoid and other fat-soluble nutrients.
Reference:
Sun, W., Yang, L., Wang, L. et al. Construction and application of Spirulina carotenoid hydrogel sustained-release system. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 22 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00028-2
翻译：田雨欣（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
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