《食品科学》：浙江大学吕瑞玲助理研究员等：超声联合紫外处理对大肠杆菌O157:H7的杀菌作用及机制|动力学|吕瑞玲|大肠杆菌|浙江大学|空化|细胞|荧光|超声|食品科学

微生物污染是最主要的食品安全问题，其中大肠杆菌（

Escherichia coli

）是主要的致病微生物之一。

超声技术作为一种非热杀菌手段，能够在不破坏食品原有风味、营养成分和色泽的同时实现有效的微生物灭活。然而超声单独处理存在杀菌效率不足的局限性，且空化效应可能导致气溶胶扩散引发潜在的交叉污染风险。目前，已有研究将超声与其他非热技术（如紫外、电解水、脉冲电场等）结合使用，从而实现能源利用效率和成本效益的最优化。紫外是电磁波谱中波长介于10 nm至400 nm之间的一部分，根据波长不同，可分为紫外-A（315～400 nm）、紫外-B（280～315 nm）和紫外-C（100～280 nm）。其中，紫外-C波段对微生物具有最强的杀菌效果，其作用机制主要是通过破坏微生物DNA中的嘧啶和胞嘧啶基对，干扰遗传物质的正常复制与转录过程，从而达到杀菌目的。

浙江大学宁波国际科创中心的吴雨豪、陈怡、吕瑞玲*等当前研究主要集中于通过调控超声参数（频率和功率）、紫外参数（波长和辐照时间）以及操作条件（温度、压力和介质性质）优化超声与紫外的联合使用。尽管该联合技术的杀菌效果已被广泛证实，但其具体的杀菌机制及协同作用仍缺乏系统性阐释。本研究基于动力学模型拟合大肠杆菌O157:H7的杀菌曲线，并从多维度分析超声、紫外及其联合应用对大肠杆菌O157:H7的综合影响，包括细菌形态变化、细胞膜性质改变及氧化应激水平等方面，通过细胞层面的初步探讨揭示超声与紫外联合处理的杀菌机制，以期为其在食品安全领域的应用提供理论依据。

超声和紫外处理对大肠杆菌O157:H7的杀菌作用

如图2a所示，不同处理方式对大肠杆菌O157:H7的杀菌效果存在显著差异。短时间作用下，超声处理组的细菌计数（lg（CFU/mL））随时间几乎没有变化，单独超声杀菌效果并不显著。相比之下，紫外处理组菌落计数随处理时间持续下降，处理40 s杀灭约2（lg（CFU/mL））的菌株。联合处理组杀菌效果最为显著，处理10 s即导致菌落数迅速下降，40 s联合处理杀灭了8.3（lg（CFU/mL））的大肠杆菌O157:H7。因此，超声联合紫外处理可能存在协同效应，从而显著提升杀菌效率。肠杆菌O157:H7的活菌数都在减少。但先超声后紫外在40 s内减少了约4（lg（CFU/mL））的活菌，显著高于先紫外后超声组的1.5（lg（CFU/mL）），这表明超声可能通过破坏菌体结构，显著增强了后续紫外处理的杀菌效率。

图2b比较了超声紫外不同处理顺序对大肠杆菌O157:H7杀菌效果的影响。可以看出随着处理时间的延长，两种处理方式下大肠杆菌O157:H7的活菌数都在减少。但先超声后紫外在40 s内减少了约4（lg（CFU/mL））的活菌，显著高于先紫外后超声组的1.5（lg（CFU/mL）），这表明超声可能通过破坏菌体结构，显著增强了后续紫外处理的杀菌效率。

表1显示随处理时间延长，联合处理表现出显著的协同效应，且该效应的增长速度整体上呈现出上升趋势，40 s时达到（5.21±0.19）（lg（CFU/mL））。超声的机械效应促使溶液振动，可加强紫外对细菌表面的均匀杀菌能力。有研究指出，超声生成的空化泡在细菌附近区域破裂时，其崩溃产生的剧烈压力变化能对细胞造成机械伤害，如Lv Ruiling等研究发现超声处理后蜡样芽孢杆菌芽孢外壁脱落引起芽孢体积减小，表面光滑。此外，超声还可能触发细胞内机械敏感离子通道的活化，进一步促进紫外渗透，实现更高效的协同杀菌。

超声和紫外协同杀菌机制的动力学模型

采用Log-liner模型、Weibull模型以及Log-Logistic模型分析不同处理过程中大肠杆菌O157:H7的杀菌动态。利用R2、以及RMSE等参数评估模型拟合优度。图3显示大肠杆菌O157:H7的杀菌曲线并未展现出线性特征。非线性拟合的Weibull模型对单独超声和单独紫外处理组表现出最佳拟合效果（

b

接近1）（表2），表明杀菌速率保持恒定，这可能是由于处理时间相对较短。通常情况下，随着处理时间的延长，剩余的细胞可能会表现出更高的抗性。据已有研究显示，这种抗性的增强可能归因于被破坏的细胞或死细胞发生聚集现象。联合处理组的Weibull模型

b

值大于1，说明杀菌速率随时间递增。相比之下，非线性模型中的Log-Logistic模型难以准确描述超声联合紫外处理的动态过程（R2最小），其预设的“S”形曲线与实际杀菌过程中微生物死亡速率逐渐增快的模式不符。比较分析证实Weibull模型最适合表征超声和紫外协同杀菌过程（值最大，RMSE值最小）。与张雅琪等关于超声辅助的蒸汽杀菌的非线性动力学模型结果一致，表明Weibull模型在描绘协同杀菌动态过程上具有更强的适用性。

超声和紫外处理对细胞膜完整性的影响

PI是一种荧光染料，仅能通过受损的细胞膜进入细胞内部与DNA结合，当这些结合后的PI受到光的激发时，会发出红色荧光，因此可作为细胞膜完整性的有效指示剂。图4展示了大肠杆菌O157:H7经超声、紫外及联合处理后经PI染色的结果。在40 s短时间处理下，单独超声和联合处理组的荧光强度与对照组无显著差异，而单独紫外处理组荧光强度有所降低。这表明细胞膜作为超声作用的主要靶点，其受到的影响有限，作用机制可能主要通过在细胞膜上形成微孔，增加通透。但紫外照射可能损伤DNA，减少PI的结合位点，降低荧光。与平板计数法相比，联合处理后的PI标记率较低，这表明联合处理可能不仅损伤细胞膜，还破坏了DNA结构，从而影响PI的结合效率。

超声和紫外处理对胞内酯酶的影响

cFDA是一种亲脂、本身不发光的化合物，它能自由通过细胞膜进入细胞内部。在细胞内部，cFDA被非特异性的酯酶水解，生成一种具有荧光的极性探针cF，由于其极性的存在，cF无法穿越细胞膜返回至细胞外。因此，通过测定cF的荧光强度，能够定量分析细胞内的酯酶活性。图5展示了大肠杆菌O157:H7在不同处理条件下经cFDA染色后的荧光强度。超声处理组与对照组无显著差异，表明单独使用超声处理对细胞内酯酶活性影响有限，可能归因于革兰氏阴性菌特有外膜结构中脂多糖形成的分子屏障，有效抵御多种外源性分子的侵袭如表面活性剂、溶菌酶、疏水性染料及抗生素等，限制了cFDA的渗透能力，导致转化效率受到影响。而紫外处理组荧光强度显著低于对照组，说明紫外处理可能降低了细胞的酯酶活性，对细胞造成了损伤。超声与紫外联合处理组的荧光强度明显高于其他处理组，可能的机制是当低强度超声场在短时间内作用于大肠杆菌O157:H7时，能够有效破坏其细胞外膜结构，进而使得cFDA染料能够顺利进入细胞内被转化成cF。超声和紫外的协同效应中，超声可能促进紫外对细胞的影响，或者是两种处理方法导致细胞应激反应，从而增加了细胞对cFDA的转化效率。

超声和紫外处理对细胞超微结构的影响

透射电子显微镜（图6）揭示了大肠杆菌O157:H7经不同处理后的超微结构变化。未经处理的细菌细胞（图6A）呈现正常的短杆状，细胞形态规则，结构完整，无明显损伤，细胞壁清晰，胞内结构分布均匀。超声处理组（图6B）相较对照组显示出一定程度的形态改变，部分细胞的边缘出现不规则性改变，这表明短时间内超声处理对细胞壁和膜造成了一定的机械损伤。紫外处理组（图6C）表现出更显著的结构破坏，细胞壁模糊，细胞内部出现不规则的空洞，可能是紫外导致DNA损伤后细胞内容物流失的结果。图6D中，超声与紫外联合处理后大肠杆菌O157:H7显示出更为严重的损伤，细胞壁和膜结构破损明显，胞内结构严重受损，空洞更为显著，表明超声和紫外的协同效应对细胞结构的破坏作用最强。综合图像可以得出，超声和紫外处理对大肠杆菌O157:H7造成了从轻微到重度不等的损伤，且联合处理具有更强的破坏作用，从而影响细胞功能和存活。

超声和紫外处理对胞内ATP含量的影响

ATP不仅是细胞内的主要能量载体，支撑着细胞各种生命活动，也是应对外界刺激的信号分子，在细胞受到压力时会从细胞内部释放到外部。图7显示，与对照组相比，超声处理细胞内ATP含量有所上升，表明超声处理可能对细胞代谢活动造成了影响。而紫外处理后，大肠杆菌O157:H7胞内ATP含量相比对照组无显著变化，这可能是因为紫外辐射对细胞的能量代谢有更强的抑制作用。经超声与紫外联合处理后，细菌胞内ATP含量有所上升，这与通常预期联合处理会有更强的抑制效果相反。这种现象可能表明短时间内联合处理后细胞通过某种机制维持或恢复了ATP生成，或者这些处理可能诱导了细胞的应激反应导致ATP含量暂时性增高，也可能源于超声产生的较弱的微流效应对ATP合成过程起到了某种促进作用。综合上述结果可以推断，无论是超声还是紫外处理，均会对大肠杆菌O157:H7的能量代谢产生影响。然而，当这两种处理方式联合应用时，可能引发了更为复杂的生物学响应，进一步扰乱了细菌的正常生理功能。这种联合效应最终导致细胞活力的显著降低，甚至引发细胞死亡。

超声和紫外处理对胞内活性氧水平的影响

如图8所示，各处理组活性氧水平较对照组显著升高，联合处理组荧光强度达到最高，为4.96±0.16。超声处理组荧光强度略高于对照组，表明超声处理可能诱导了轻微的氧化应激，导致活性氧水平升高。紫外处理组荧光强度进一步提升，暗示紫外照射较超声更能促进活性氧的产生，这可能与其引发的DNA和细胞结构损伤有关。而超声与紫外联合处理组展现出最高的荧光强度，显著高于其他所有处理组，这可能表明超声和紫外的组合作用极大地增加了活性氧的产生，这种增加的氧化应激可能对细胞功能产生重大影响。

超声和紫外处理对DNA的损伤

图9展示了大肠杆菌O157:H7在不同处理条件下经Hoechst染料染色后的荧光强度。超声处理组荧光强度高于对照组，表明超声处理导致细胞膜的渗透性增加，使Hoechst染料更易进入细胞内与DNA结合。低强度超声主要作用于DNA超螺旋结构，使其结构变得松散，暴露出更多的双螺旋小沟区域，为Hoechst染料提供了更多的结合位点。相反，紫外处理组荧光强度较低，这可能意味着紫外照射损伤了DNA，或减少了细胞内可结合染料的位点。超声与紫外联合处理时大肠杆菌O157:H7荧光强度最高，达到51.90±3.10，这可能是由于超声和紫外的联合效应增强了染料与DNA的结合，或者因为处理导致了DNA裸露或累积损伤，增加了染料结合位点，表明该处理可能对细胞DNA造成了显著的结构改变或损伤。研究表明，超声稳态空化产生的微声流以及瞬时空化所引发的剪切力共同作用于大肠杆菌O157:H7的二级和三级结构，从而显著改变了其DNA结构。但在超声与紫外联合作用后，对DNA具体的损伤机制尚不明确。因此，下一步应深入分析联合处理下大肠杆菌O157:H7的差异表达基因，从分子层面对杀菌机制作出探究。

结论

超声和紫外联合处理杀菌具有协同效应，40 s即可杀死8.3（lg（CFU/mL））的大肠杆菌O157:H7。本研究初步探讨了超声联合紫外处理杀灭大肠杆菌O157:H7的机制，联合处理对细胞DNA造成了显著的结构改变或损伤，影响PI的结合效率。同时超声可能促进了紫外对细胞的影响，导致细胞应激反应，从而增加了细胞对cFDA的转化效率。通过比较不同处理方式对细胞超微结构的影响，可以发现联合处理对细胞功能和存活具有最大的破坏作用。短时间内联合处理诱导了细胞的应激反应，导致ATP含量暂时性增高继而影响细菌的正常生理功能。同时，超声的机械效应促使自由基等氧化性物质渗透细胞膜，在与紫外联合处理下，进一步增加了细胞的氧化应激，引起细胞内活性氧水平上升。

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