免疫浸润是一整套知识体系，是一种逻辑思维的方式，一旦拥有这种崭新的角度，作为医生，我们将能从更深刻地维度去认识肿瘤，去诊治病人。我们有幸读到一篇免疫浸润的综述，内容系统，思路条理，逻辑层层递进，非常值得果友们学习；更幸运的是，果友们积极参与综述翻译，并顺利完成任务。感谢果友们的支持和参与。这篇论文是多位果友参与完成，愿果友们反复阅读，仔细推敲琢磨，留言讨论，或查阅参考文献。如果您觉得翻译得好，受益匪浅，也可以打赏（感谢果友支持），所有收益将分发至参与翻译的果友们！再次感谢果友们。
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根据综述主要内容，我们将综述分为上篇——免疫治疗和下篇——免疫浸润。对于从事肿瘤临床诊治和研究的医生来说，尽管这篇综述对于肿瘤免疫的基础知识涉及不多，但是高屋建瓴地提供认识肿瘤免疫的路径。肿瘤免疫基础知识我们会通过PPT（免费）和视频（收费）形式在公众号分享。请果友们多多关注。
综述论文 OPEN
肿瘤免疫治疗历史与进展：肿瘤浸润免疫细胞的特征其治疗意义
张媛媛和 张泽民
免疫治疗使肿瘤治疗发生革命性改变，并使肿瘤免疫焕发出新活力。多种免疫治疗方法，如过继细胞移植治疗（ACT）和免疫检查点抑制剂（ICIs）已经获得持久的临床反应，但其疗效迥异，且只有部分肿瘤患者获益。肿瘤微环境（TME）中的免疫浸润在肿瘤发生、发展中发挥关键作用，并影响肿瘤患者的临床预后。全面剖析肿瘤浸润免疫细胞有助于阐明肿瘤-免疫逃逸的机制，从而为开发新的治疗策略提供机遇。然而，肿瘤微环境的高度异质性和可变性阻碍了对肿瘤内免疫细胞的准确分离。随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）和质谱流式细胞技术等单细胞技术的最新进展，使得系统地分析肿瘤微环境成为可能，并为解析肿瘤浸润免疫细胞的功能多样性提供机会。本文综述了肿瘤免疫治疗的最新进展，重点介绍具有里程碑意义的研究和肿瘤相关免疫细胞的单细胞特性，并总结肿瘤内免疫细胞的表型多样性及其与肿瘤免疫治疗的关系。本文可以加深我们对肿瘤免疫治疗进展的了解，有助于阐明免疫细胞在肿瘤进展中的调控作用，并为肿瘤治疗开发新型免疫治疗方法提供指导。
关键词：免疫治疗；肿瘤微环境；单细胞技术；肿瘤浸润免疫细胞；表型多样性
Cellular & Molecular Immunology (2020) 17:807–821; https://doi.org/10.1038/s41423-020-0488-6
引言
肿瘤是一种基因组疾病，其特点是基因组不稳定，在肿瘤发展过程中会出现大量点突变积累和结构改变 1,2 。基因组学变化引起肿瘤抗原产生，而这些抗原会被免疫系统识别为非自身来源，并触发细胞免疫反应 3,4 。免疫系统之所以在免疫监视中发挥重要的作用 4,5，是因为适应性和先天性免疫系统的免疫细胞浸润到肿瘤微环境（TME）以调控肿瘤进展 6,7 。固有免疫细胞由自然杀伤细胞（NK cell）、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和吞噬细胞（包括肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞 （DC））组成，通过直接杀伤肿瘤细胞或触发适应性免疫反应参与肿瘤抑制 8–10。适应性免疫系统的功能依赖于淋巴细胞（B细胞和T细胞），其中B细胞在体液免疫反应中起主要作用，而T细胞则参与细胞免疫反应 5,11,12。
有效的免疫应答既可以消灭肿瘤细胞，也可以损害肿瘤细胞的表型和功能 3。然而，肿瘤细胞已经进化出多种机制以逃脱免疫监视，如抗原提呈机制缺陷、上调负调控通路、招募抑制性免疫细胞亚群 13–17，从而导致免疫细胞效应功能受阻，抗肿瘤免疫应答丧失。
免疫治疗旨在增强固有防御以消除肿瘤细胞，是肿瘤治疗的重大突破，并已革新肿瘤学领域。虽然释放宿主免疫系统来根除肿瘤的想法可追溯到一个世纪前 18,19，但直到近期才在基础和临床研究上取得重大进展。多种肿瘤对免疫治疗有持久临床反应 20–25，尽管应答率有限，且其潜在机制不明 26。免疫细胞是免疫治疗的基础；因此，了解肿瘤微环境中的免疫浸润是肿瘤治疗中提高反应率和开发新型免疫治疗策略的关键。虽然肿瘤免疫的“生态系统”高度复杂并由多种细胞组成，但是单细胞技术已成为解析肿瘤微环境的有力工具 27。尽管已经投入大量精力研究T细胞特性，但是固有和适应性免疫系统的其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和B细胞，也影响肿瘤进展和免疫治疗的反应。在本文中，我们将概述肿瘤免疫治疗的主要分类与发展历史，肿瘤浸润免疫细胞在人类肿瘤的最新研究结果及其与免疫治疗的关系和潜在临床应用。
图1.免疫治疗的主要种类。在临床实践中发展起来、具有广阔前景的肿瘤免疫免疫治疗形式包括：溶瘤病毒治疗、肿瘤疫苗、细胞因子治疗、过继细胞移植免疫治疗和免疫检查点抑制。本文描述每种治疗的基本原理及每步所涉及的细胞和分子基础。（注：DCs，树突状细胞；NK，自然杀伤细胞；TCR，T细胞受体；CAT-T嵌合抗原受体T细胞）
免疫治疗的主要种类
我们简要回顾已用于肿瘤治疗的免疫治疗的既往研究。这些研究促进主要几类免疫治疗的发展。（图1）
溶瘤病毒治疗
一个多世纪以来，传统免疫治疗利用细菌或病毒感染来增强免疫应答。早在1863年，Virchow观察到肿瘤组织总是伴随着免疫系统的淋巴细胞浸润，首次发现肿瘤和炎症之间的联系。最早的肿瘤免疫治疗病例能追溯到1891年，免疫治疗之父--William Coley，首次尝试利用免疫系统治疗肿瘤，观察到活的和灭活化脓性链球菌和沙雷氏菌可能导致肉瘤患者的肿瘤消退。虽然这种前卫的治疗策略为利用免疫系统治疗肿瘤提供一种验证性概念，但其作用机制及感染风险尚不明确。数十年后，溶瘤病毒治疗被发现，该方法利用转基因病毒感染肿瘤细胞，从而刺激产生促炎环境，增强全身性抗肿瘤免疫。随着基因工程和病毒转染技术的进步，溶瘤病毒治疗近些年已经取得巨大进步。特别是talimogene laherparepvec（T-Vec，别名Imlygic），它是一种基因修饰的I型单纯疱疹病毒，对晚期黑色素瘤患者的临床疗效很好，并已被批准用于治疗不可切除的转移性黑色素瘤。
肿瘤疫苗
肿瘤疫苗利用肿瘤特异性抗原激活T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。之前报道的一项关键研究证实，MZ2-E和MZ2-D能被T细胞识别而激活免疫应答，MZ2-E和MZ2-D都是MAGE（黑色素瘤相关抗原）基因家族编码的抗原。同时，在黑色素瘤患者体内肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）介导的免疫应答反应中，另一人类黑色素瘤抗原--gp100，被证明与肿瘤抑制相关。这些发现为肿瘤免疫治疗中利用肿瘤抗原作为疫苗奠定理论基础。除了肿瘤抗原，基于树突状细胞的疫苗也展示出显著的临床效果。树突状细胞是抗原提呈能力最强的抗原呈递细胞（APC），在活化抗肿瘤免疫中发挥关键作用。具体来说，肿瘤抗原激活的树突状细胞能内化、加工处理抗原，并将加工的表位提呈给T细胞，从而诱导毒性T淋巴细胞（CTL）免疫应答。由于树突状细胞在抗原提呈中的主要作用，因而在基于树突状细胞的疫苗中得到应用，其中涉及用分离到负载有肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物的树突状细胞，这些树突状细胞经体外确定成熟的鸡尾酒抗原刺激后再回输至患者体内。其中典型的例子是sipuleucel-T，该疫苗是基于树突状细胞的免疫治疗并已被批准用于晚期前列腺癌的治疗。此外，完整肿瘤细胞也可以用来激活自发免疫应答。GVAX是一种自体肿瘤细胞经基因修饰后分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的肿瘤疫苗，已在多种肿瘤类型中显示出增强肿瘤特异性免疫应答的潜力。这些进展强调肿瘤疫苗在肿瘤治疗临床应用中的重要性。
细胞因子
细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞分泌以应对细胞内应激状态如感染、炎症和肿瘤的发生，其功能是作为调节免疫系统细胞内相互作用以及沟通的信号。分泌型细胞因子能够以复杂而高效的方式快速传递免疫信号，从而对靶抗原产生强有力的协同免疫应答。 细胞因子在肿瘤治疗中的潜在应用获益于1976年对白细胞介素2（IL-2）的认识。 IL-2最初被命名为T细胞生长因子，在体内、外都具有促进T细胞增殖的能力，从而发挥免疫刺激作用。 一个典型的细胞因子治疗案例是，在转移性肿瘤患者中大剂量应用IL-2可使肿瘤明显消退。除IL-2外，在肿瘤治疗中，干扰素-α（IFN-α）也是一种经典细胞因子治疗。干扰素家族（IFNs）由大量细胞因子组成，其中属于I型干扰素的IFN-α是多效能细胞因子，是决定抗肿瘤免疫效果的关键因子。IFN-α在肿瘤控制中发挥多种角色，包括通过诱导细胞衰老和凋亡直接消灭肿瘤细胞，通过刺激树突状细胞成熟和增强T细胞的细胞毒性而促进有效的抗肿瘤免疫应答。 临床研究已经证实高剂量IFN-α对慢性髓系白血病和黑色素瘤的治疗作用。尽管这些细胞因子具有临床益处，但耐受性差和毒副作用严重，使得细胞因子作为单一治疗的进一步应用受阻。不过，细胞因子与其他免疫治疗如过继细胞移植（ACT）联合应用仍在研究中，以规避细胞因子治疗的严重不良反应。
过继细胞移植
过继细胞移植（Adoptive cell transfer ACT）治疗使用自体免疫细胞，特别是T细胞。这些细胞经过分离或基因工程改造，体外扩增，之后重新输入患者体内以消灭癌细胞。过继细胞移植治疗已显示出持续的临床疗效。Rosenberg等证明向转移性肿瘤患者施用大剂量IL-2并联合输注自体淋巴因子激活杀伤细胞的治疗是有效的。在首次成功过继免疫治疗试验之后，研究小组随后使用肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）改进这种方法，并证明IL-2扩增的肿瘤浸润淋巴细胞过继转移显示出更强的治疗效果。这些研究为使用肿瘤浸润淋巴细胞治疗晚期人类肿瘤提供了理论依据。
此后发现，将针对过度表达、自身衍生分化抗原的高选择性肿瘤反应性T细胞过继移植输注给转移性黑色素瘤患者，可导致肿瘤患者T细胞持续性克隆再增殖。以上做法提示，在过继转移中可使用针对特定新抗原的基因修饰T细胞。当前，已经发明了两种类型的基因修饰T细胞，即嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞和T细胞受体（T-cell receptor, TCR）工程改造的T细胞用于过继移植，并已经在恶性肿瘤治疗方面取得实质性进展。
CAR-T细胞治疗利用抗体片段来识别在癌细胞表面表达的特定抗原。第一代CAR-T细胞是通过表达免疫球蛋白-TCR嵌合分子作为功能性受体，具有抗体特异性的基因修饰T细胞。然而，这些CAR-T细胞直到1998年才能够在体内持续存在。当时Maher等通过将CD28等共刺激分子引入到基因工程化CARs中，建立了新一代CAR-T细胞，使基因修饰T细胞能够在体内持续存在并保持活性。随后，他们证明CD19特异、CD28 / CD3-zeta双重信号CAR修饰T细胞可以诱导成人急性淋巴细胞白血病的分子缓解。此外，还研究了其他分子与CAR偶联时的功效。Porter等改造自体T细胞，使其表达与CD3-zeta和4–1BB信号域连接的抗CD19分子，用其靶向B细胞抗原CD19，发现这些被遗传修饰的自体T细胞可在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中产生强有力的CD19特异性免疫应答。这些发现揭示了CAR-T治疗在人类肿瘤治疗中的良好前景。Clay等首先报道用TCR工程改造的T细胞或TCR-T治疗方法。他们证明将TCR基因转移到黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞（PBL）中可以产生具有抗肿瘤反应性的效应T细胞。随后，当用TCR工程化T细胞治疗转移性黑色素瘤患者时，这种治疗的临床潜力得到证实。
值得注意的是，在肿瘤细胞中异常表达的典型肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1，已被转基因TCR-T细胞靶向，介导持续的抗原特异性抗肿瘤作用，最终导致肿瘤退缩。因此，CAR-T细胞治疗和TCR-T细胞治疗都在肿瘤治疗方面取得实质性进展，并已取得令人鼓舞的临床效果。
免疫检查点抑制剂
尽管过继细胞移植治疗取得巨大进展，但一类新型的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）即免疫检查点抑制剂（ICIs），现已进入医学实践，并成为最重要的免疫治疗方法之一。免疫检查点分子即共抑制信号传导途径的分子，其作用是维持免疫耐受，但经常被癌细胞利用以逃避免疫监视。免疫检查点抑制剂旨在通过阻断共抑制信号通路来恢复抗肿瘤免疫反应，并促进免疫介导的恶性细胞清除。其最广泛使用的靶点是细胞毒性T淋巴细胞相关分子4（CTLA-4）、程序性细胞死亡受体1（PD-1）和程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）。
CTLA-4是一种在T细胞上表达的共抑制分子，具有负调节T细胞活化的功能。一项开创性研究表明，用抗体阻断CTLA-4可以诱导有效的免疫反应并导致肿瘤消退，开启了用抗体给免疫细胞”松开刹车”来增强抗肿瘤免疫反应的时代。经临床试验和疗效评估后，CTLA-4单抗ipilimumab以其增强T细胞活化和持续诱导免疫反应的能力，成为首个被批准用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂。同时，PD-1被发现在T细胞表面表达，最初被认为参与程序性细胞死亡，后来证明PD-1是免疫反应的负调节分子。然而，PD-1的调节机制在其配体PD-L1的发现之前仍然是难以捉摸的。PD-L1在正常组织中表达，当与PD-1结合时，通过抑制TCR介导的淋巴细胞增殖和细胞因子分泌来调节免疫耐受。然而，肿瘤细胞也异常表达PD-L1以逃避免疫监视。研究表明，抑制PD-1或PD-L1可以恢复T细胞的细胞毒性能力并诱导肿瘤消退，提示PD-1或PD-L1可以作为治疗靶点。事实上，阻断PD-1通路已取得显著的临床效果，靶向PD-1或PD-L1的抗体已被批准用于治疗多种肿瘤 。
该综述下篇主要是肿瘤微环境中免疫细胞浸润的总结，是我们关注的核心。
肿瘤浸润免疫细胞及其与免疫治疗的关系
肿瘤免疫治疗，如细胞过继转移和肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的成功，已经证明免疫细胞，特别是T细胞，可以用来消除肿瘤细胞。尽管免疫治疗有持续的临床疗效，但只有一小部分肿瘤患者从中受益。作为肿瘤微环境的主要组成部分，免疫浸润已被证实有助于肿瘤进展和免疫治疗反应。因此，更好地理解肿瘤微环境中的固有免疫细胞和适应性免疫细胞对于破译免疫治疗机制、定义预测性生物标志物和识别新的治疗靶点至关重要。
注：无论是基础研究还是生信分析，免疫浸润细胞一般包括6种细胞，T细胞、B细胞、NK细胞（俗称TBNK），树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞（统称髓系细胞）。
T细胞
因具有强效的肿瘤杀伤能力，T细胞成为肿瘤免疫的焦点。T细胞通过主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）分子或人类白细胞抗原呈递的肿瘤抗原短肽与T细胞受体（TCR）反应而发挥作用。T细胞受体由大量TCR基因片段随机重组的基因重排产生，其过程可能产生各种T细胞受体组成成分，赋予T细胞多样性和特异性。肿瘤浸润淋巴细胞在有效抗肿瘤免疫中起关键作用，并且不同类型T细胞，包括细胞毒性T细胞（CTL），辅助性T细胞（T）和调节性T细胞（Tregs），均参与肿瘤微环境内T细胞介导的免疫反应。
细胞毒性T细胞是关键的效应细胞，可与细胞毒性分子，如颗粒酶和穿孔素，一起发挥功能。研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞的存在，与多种癌症患者存活呈正相关。但是，由于肿瘤微环境的免疫抑制导致其耗竭或功能失调，肿瘤部位浸润的细胞毒性T细胞往往不能控制肿瘤生长。T细胞耗竭的特征是PD-1和其它抑制分子上调，最初在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠模型中报道，并证明在人类癌症中普遍存在。例如，Thommen等对非小细胞肺癌（NSCLC）患者中PD-1表达水平不同的三群瘤内CD8肿瘤浸润淋巴细胞亚群的特性进行分析，发现PD-1高表达的肿瘤浸润淋巴细胞已耗竭，但可预测非小细胞肺癌患者对PD-1抗体治疗的反应。这些发现及免疫检查点抑制剂深入人心的临床疗效突显了干预T细胞功能异常在肿瘤治疗中的重要性。
CD4 T细胞包含辅助性细胞和调节性T细胞。辅助性T细胞通过帮助CD8效应T细胞或通过充当细胞毒性T细胞来直接消除肿瘤细胞而有助于抗肿瘤免疫。与此相反，调节性T细胞对于维持稳态必不可少，通过可溶性免疫抑制因子直接破坏T细胞功能，以及CTLA-4介导的抑制抗原呈递细胞共刺激信号间接阻止T细胞活化，从而协调抗肿瘤免疫。值得注意的是，抗CTLA-4抗体不仅可以阻断负调节信号通路来加强T细胞反应，也可诱导Treg耗尽，表明免疫检查点抑制剂在抗肿瘤免疫中作用机制复杂。
B细胞
B细胞是在适应性免疫系统体液免疫中起作用的体液免疫细胞。在被感染细胞或肿瘤细胞的刺激下，B细胞分化为记忆B细胞或浆细胞，后者可分泌免疫球蛋白（Igs，也称为抗体）以结合并中和靶抗原。值得注意的是，B细胞激活涉及抗原与B细胞受体（BCR）相互作用。BCR是膜结合形式的Ig（mIg），赋予B细胞抗原特异性。每个B细胞都具有独特的BCR，该BCR源自Ig基因片段随机重排产生的高度多样化的BCR基因库。BCR基因库具有不同的抗原特异性，当遇到抗原时，可以通过生发中心的类型转换重组和体细胞超突变进一步修饰所选择的BCR，从而获得针对靶抗原的最佳抗体。
B细胞不仅通过产生的抗体在体液免疫中起着至关重要的作用，而且还通过充当抗原呈递细胞来增强T细胞介导的免疫反应，或通过细胞因子或调节性B细胞调节免疫应答，参与细胞免疫。此外，B细胞在慢性炎症和肿瘤部位辅助维持二级淋巴器官结构和促进三级淋巴结构（TLSs）形成。三级淋巴结构是免疫细胞，如T细胞、B细胞和滤泡树突状细胞聚集的高级有序结构。三级淋巴结构对于B细胞和T细胞募集和局部激活特别重要，因此有助于长期免疫。
由于在体液和细胞免疫中的多功能性， B细胞在抗肿瘤免疫中表现出表型多样性。研究表明，肿瘤浸润B细胞（Tumor-infiltrating B cells，TIB）通过分泌可溶性因子促进髓样细胞促血管生成和促肿瘤功能，或通过产生促进肿瘤细胞信号转导的因子来抑制T细胞介导的免疫反应，从而促进肿瘤进展。然而，与促肿瘤作用相反的是，越来越多研究表明B细胞具有抗肿瘤免疫功能，并可能有利于患者预后。研究证明，CD20 肿瘤浸润B细胞与非小细胞肺癌和卵巢癌患者的预后良好相关，机制可能是充当抗原呈递细胞来增强细胞毒性T细胞反应。值得注意的是，Cabrita等发现，三级淋巴结构形成以及肿瘤中CD20 B细胞和CD8 T细胞同时存在与转移性黑色素瘤患者的生存期改善有关，并可预测免疫检查点抑制剂的临床效果。与这些观察一致的是，B细胞与免疫治疗反应有关。Hollern等在高突变负荷的三阴性乳腺癌小鼠模型中发现，免疫检查点抑制剂可诱导滤泡辅助性T细胞和B细胞的活化，而活化的B细胞通过分泌抗体和呈递抗原激活T细胞来促进抗肿瘤反应。与小鼠研究的这些发现相一致，临床研究也强调B细胞与三级淋巴结构在肿瘤免疫治疗中的重要性。例如，Jahrsdörfer等发现B细胞可产生颗粒酶B，并可在B-CLL中基于IL-2活化而获得细胞毒性。此外，Petitprez等发现，包含B细胞和其他免疫细胞的三级淋巴结构为特征的软组织肉瘤亚型患者，其生存率改善，PD-1阻断剂反应率较高。同时，Helmink等发现，在对免疫检查点抑制剂治疗有反应的转移性黑色素瘤和转移性肾细胞癌（RCC）患者肿瘤的三级淋巴结构中，CD20 B细胞与T细胞存在共定位。此外，他们进一步鉴定到有反应患者中存在明显的克隆扩增和BCR多样性，为深入了解B细胞和三级淋巴结构在肿瘤免疫治疗的关键作用提供视角。
因此，尽管还需要进一步研究以阐明B细胞介导反应在免疫治疗中的机制，这些发现已指出B细胞在抗肿瘤免疫调节中的关键作用，并表明B细胞和三级淋巴结构在肿瘤治疗的重要应用。
NK细胞 （自然杀伤细胞）
NK细胞是能发挥细胞毒作用而无MHC特异性的典型固有淋巴样细胞，因此能与细胞毒性T细胞所介导的MHC限制性肿瘤溶解相辅相成。NK细胞可通过溶细胞颗粒直接清除肿瘤细胞，还可通过促炎细胞因子和趋化因子协同其他免疫细胞起作用。重要的是，NK细胞的活化是由其表面的激活或抑制性受体共同介导的。抑制性受体能与正常细胞上的MHC I类分子相互作用，使NK细胞产生自身耐受。而激活性受体则感知细胞应激（病毒感染或病毒感染细胞发生肿瘤增生，及或肿瘤细胞MHC I类分子表达缺失）的信号，从而引起NK细胞的活化和效应作用。越来越多研究表明，在肿瘤微环境中，NK细胞的功能会因细胞毒效应减弱和促炎性因子的表达改变而受到阻碍。Böttcher等发现肿瘤中的NK细胞能在肿瘤微环境中募集cDC1 细胞，并促进抗肿瘤免疫，而肿瘤细胞能产生前列腺素E2损害NK细胞的功能，引起免疫逃逸。因此，NK细胞也可作为潜在的靶点。
现已探索出几个基于NK细胞的免疫治疗, 包括过继转移自体抑制NK细胞，也就是把从活体中提取的活化NK 细胞和，经体外扩增后输注到患者体内。还有CAR-NK细胞治疗，也就是输注改造过的NK细胞，这类NK细胞能表达抗特定肿瘤抗原CARs。还有细胞因子治疗，也就是输注增强NK细胞活性的特定细胞因子。最后，还有基于mAbs的治疗，指输注抗体以阻断NK细胞上的抑制性受体。
跟阻断T细胞上抑制性通路的免疫检查点抑制剂相似，阻断NK细胞上的抑制性受体同样颇有前景。几种NK细胞抑制性受体的治疗潜力和临床应用已经在探索阶段。杀伤免疫球蛋白受体家族（KIR）和CD94/NKG2A异质二聚体是人类NK细胞上主要的抑制性受体。单独应用抗KIR抗体或联合其他治疗药物能提高NK细胞的抗肿瘤效应。另外，抗NKG2A抗体在触发NK细胞反应方面同样有效。还有Monalizumab，一种新型抗NKG2A抗体，目前正处在检验抗肿瘤效能的临床试验阶段。需要着重说明的是，除了抑制受体，激活受体也能被利用, 如用细胞因子上调它们的表达，或传递覆盖目标细胞的抗体来激发NK细胞毒性。举个应用该方法颇有成效的例子，Andrade 等设计了可避免人肿瘤细胞丢失细胞表面MICA和MICB的抗体，MICA和MICB都是应激诱导分子，能被NK细胞上NKG2D的激活受体识别。他们还发现，这些抗体通过增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫抑制肿瘤生长。综合考虑，将NK细胞应用于治疗中有很好的前景，值得进一步探索。
骨髓细胞
髓系细胞包含异质的细胞亚群，有粒细胞和单核巨噬细胞，它们也被证明在肿瘤免疫中扮演关键的作用。
粒细胞中最常见的亚型是中性粒细胞，其典型功能是在固有免疫中抵抗细菌和真菌感染，但其在肿瘤免疫中的角色尚具争议。Szczerba等发现，中性粒细胞辅助血流中循环肿瘤细胞，有促进其转移的潜能。而Ponzetta等则发现中性粒细胞在一种固有样表型非常规T细胞的极化中起关键作用，因此有助于抗肿瘤免疫。另外，Fridlender等发现中性粒细胞在肿瘤微环境中有不同的激活状态，N1表型起抗肿瘤生成作用，而N2起促肿瘤生成作用。这些发现强调肿瘤相关中性粒细胞作用的多样性，因此有必要做更深入的研究，全面剖析人类肿瘤中的肿瘤相关中性粒细胞，而这有可能开启通过调节中性粒细胞作为肿瘤治疗的新模式。
单核吞噬细胞，由单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞组成，通过感知病原体和吞噬作用在固有免疫中起作用，并作为相互作用的细胞成分在适应性免疫中将抗原提呈给T细胞。树突状细胞是主要的抗原呈递细胞，现已确认树突状细胞主要有两种亚型，即类浆细胞树突状细胞（pDCs）和传统树突状细胞（cDCs）。pDCs能产生高水平 I型干扰素并在调节固有和适应性免疫中起重要作用。虽然pDCs最初被认为在抗病毒免疫中起作用，但近期研究者对其在肿瘤发生方面起的作用产生了兴趣。研究表明，pDCs的次级产物，尤其是I型干扰素，在肿瘤免疫中同时有免疫原性和致耐受性作用。这些因子通过提高NK细胞和T细胞的细胞毒性，辅助激活B细胞向浆细胞分化，促进树突状细胞和促炎症反应性巨噬细胞的成熟和活化，最终共同促成一个免疫活化的肿瘤微环境。它们同时通过募集Treg细胞或诱导免疫调节分子（如参与负调控途径的免疫调节分子）的表达，营造免疫抑制肿瘤微环境。另外，pDCs能作为专业的抗原呈递细胞调节抗肿瘤免疫反应。因此，pDCs在肿瘤免疫中的多样化角色尚未明晰。cDCs包含两种亚型：cDC1s和cDC2s，它们有着不同的表型，功能和转录因子依赖。cDC1s专门将MHC I上的抗原提呈给CD8 T细胞。而cDC2s将MHC II上的抗原提呈给CD4 T细胞。cDC1s通过肿瘤微环境里的局部效应和向肿瘤引流淋巴结(dLNs)的抗原呈递促成抗肿瘤免疫。具体来说，肿瘤微环境中的cDC1s分泌如CXCL9和CXCL10的趋化因子以协助效应T细胞和NK细胞向肿瘤聚集，还产生细胞因子帮助维持效应细胞的细胞毒性作用。另外，cDC1s能迁移到引流淋巴结，将肿瘤抗原多肽提呈给初始型CD8 T细胞，引起抗原特异性免疫反应的活化和启动。cDC2s是最常见且异质性最高的DC亚型，它们促进大量CD4 T细胞介导的免疫反应。虽然cDC2s被认为主要通过激活T细胞来起作用，但其在抗肿瘤免疫中的具体作用尚未明确。研究者对解析cDC2s在肿瘤微环境中的异质性和功能的兴趣与日俱增。
巨噬细胞是一类吞噬细胞，包括一群在肿瘤微环境中有复杂表型和特性作用的异质性细胞群。巨噬细胞能通过吞噬作用或通过产生可溶性因子诱导肿瘤细胞凋亡从而清除恶性细胞。除了直接的肿瘤杀伤能力，巨噬细胞还通过血管新生，纤维化和免疫监测等机制，在调节肿瘤进展中起重要作用，巨噬细胞可通过分泌不同分子动员或中和血管内皮生长因子来发挥促血管生成和抗血管生成作用，从而调节肿瘤微环境中的血管生成。同时，巨噬细胞是肿瘤相关纤维化的关键协调者，它通过不同的介质来促进或抑制细胞外基质堆积，从而改变邻近的成纤维细胞，诱导形成的纤维化能调节T细胞的渗透和活化。此外，巨噬细胞能产生干扰素IL-12和表达包括CD86在内的共刺激分子，引起细胞相互作用，从而介导T细胞活化。相反，巨噬细胞也能通过表达T细胞抑制分子，分泌免疫抑制性因子或促进免疫抑制性Tregs募集这三种方式介导T细胞的抑制。因此，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在肿瘤微环境中有显著的作用，并可能带来肿瘤免疫治疗的新机遇。
单细胞水平研究肿瘤免疫浸润细胞的新技术
作为适应性免疫的关键组成部分，T细胞由于其对抗原识别的特异性和强大的肿瘤杀伤力而成为免疫治疗的核心。肿瘤浸润淋巴细胞是由具有复杂功能状态（如幼稚，效应因子，记忆和功能障碍）的不同亚群组成的异质细胞群（如CD8 +，CD4 + TH1，TH2，TH17和Treg细胞）。另外，这些T细胞亚群表现出对组织分布的偏好和表肿瘤微环境中的跨组织迁移和状态转变的动态特性。
由于这种异质性，常规方法无法解析各种T细胞亚群的特征。随着单细胞技术的发展，单细胞分析下大量肿瘤浸润免疫细胞的特点引起肿瘤免疫学家的极大兴趣。最近，新型单细胞方法，包括质谱流式细胞术和单细胞测序（scRNA-seq），已呈现出发展势头，并促进对肿瘤相关T细胞和其他免疫细胞特点的了解（图2和 图3）。
单细胞蛋白质分析是了解肿瘤浸润淋巴细胞表型异质性的重要方法。质谱流式细胞术（CyTOF）利用金属同位素标记的抗体与微调质谱检测相结合，能够以低成本量化数百万个细胞中的40多种蛋白质。相比之下，单细胞测序包括plate-based 和droplet-based两种技术方法(图2a)，可以同时量化成千上万个转录本。因此，它能够揭示稀有细胞群，揭示复杂的调控机制，并跟踪发育过程。近来，这两种方法已用于评估各种类型肿瘤的肿瘤生态系统(图2), 因为蛋白组和转录组都可以提供对肿瘤微环境中免疫浸润功能特征的重要认识。
通过单细胞技术捕获T细胞状态
单细胞研究描绘不同类型肿瘤组织如皮肤，肺，肾，乳腺，结肠和头颅的T细胞特征，包括组成、功能状态以及病灶的动态变化 (图2b)。这些研究使我们对肿瘤免疫浸润有了一定了解，为探究免疫逃逸的机制和开发进一步增强抗肿瘤免疫力的新策略提供机遇。
高肿瘤突变负荷（TMB）黑色素瘤，由于其对免疫检查点抑制剂治疗具有高反应率，因此处于肿瘤免疫学研究的前沿。Tirosh等应用scRNA-seq方法研究转移性黑色素瘤的多细胞生态系统，并分析恶性细胞和非恶性细胞的表型多样性。尽管受细胞数量的限制，但该研究通过T细胞分析再现肿瘤浸润淋巴细胞的衰竭表型。同样，Li等发现功能失调的肿瘤浸润淋巴细胞是高度增殖，动态分化的单克隆细胞群，在黑素瘤的肿瘤微环境中表现出连续的分化图谱。这样的研究为我们提供了解TME肿瘤微环境中T细胞特征的机会，并扩展我们对人类黑素瘤T细胞功能衰竭的认识。
肺癌具有广泛的基因组改变，并且对检查点阻断治疗有更好的应答。因此，肺癌通常是肿瘤免疫治疗的研究目标。Lambrechts等提出肺癌中肿瘤生态系统的单细胞转录组学目录。然而，尽管有大量免疫细胞，但他们强调基质细胞的表型构建及其对免疫细胞的调节，从而与免疫治疗建立间接联系。相反，Lavin等利用质谱流式细胞术绘制与早期肺癌相关的免疫细胞图谱。 他们通过在肿瘤病灶处观察到CD8效应T细胞显著减少，伴随着Tregs细胞扩增和T细胞耗竭，发现免疫抑制性微环境。类似地，GUO等应用scRNA-seq技术描绘非小细胞肺癌中T细胞的转录组学情况。他们描绘肿瘤浸润淋巴细胞的变化轨迹，并确定两簇将耗竭CD8 T细胞的功能状态，这两种细胞均与良好预后相关。这些发现为肺癌T细胞的功能状态和动力学提供更深入的见解，这将有助于肿瘤治疗和患者分层。
肾细胞癌（RCC）是成人中最常见的肾脏肿瘤，尽管与黑色素瘤或非小细胞肺癌相比其肿瘤突变负荷较低，但是其插入和缺失突变率却很高。肾细胞癌患者的亚型可受益于免疫检查点抑制剂治疗，而纳武单抗（nivolumab）是一种已被批准用于治疗转移性肾细胞癌的抗PD-1抗体。Young等构建健康人和肿瘤患者肾脏的单细胞转录组数据，并鉴定肾肿瘤细胞及其组成。尽管他们同时鉴定免疫细胞和非免疫细胞，并重点关注非免疫细胞部分，但其提供的肾细胞癌中免疫细胞功能的信息仍然有限。相比之下，Chevrier等提出基于质谱流式细胞术的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）（最常见的肾细胞癌类型）中免疫浸润的单细胞图谱，并揭示肿瘤微环境中免疫细胞的表型复杂性。透明细胞肾细胞癌中T细胞的免疫抑制表型，包括功能耗竭T细胞和抑制性Tregs细胞。这些发现扩展了我们对T细胞表型多样性的看法，并为肾细胞癌的免疫治疗提供候选靶点。
结直肠癌（CRC）对免疫肿瘤学家的吸引力很大，因为其肿瘤浸润免疫细胞比组织病理学方法更能预测结直肠癌患者的存活率。此外，免疫检查点抑制剂对患有微卫星不稳定性（MSI）的结直肠癌患者有效，但对微卫星稳定的患者无效，其分子机制尚不明确。Li等学者使用scRNA-seq技术进行结直肠癌肿瘤生态系统的转录组分析。由于该研究专注于聚类算法开发，因此该研究提供的生物学见解有限，尤其是对于结直肠癌中的免疫细胞功能。值得注意的是Zhang等通过RNA测序和TCR追踪（STARTRAC）法整合单T细胞分析，对结直肠癌中的T细胞进行综合分析。
他们阐述具有不同功能和不同克隆的T细胞亚群动态关系。此外，他们发现Th1样亚型主要表达微卫星不稳定性患者中，这阐释其对免疫检查点抑制剂反应良好的潜在细胞机制。这些发现加深我们对CRC中T细胞特征的了解，并加速了免疫检查点抑制剂治疗机制的研究。
由于免疫学上的“冷结节”表型，乳腺癌（BC）历来被认为难以进行免疫治疗，但最近研究表明，免疫检查点抑制剂具有改善乳腺癌患者亚型结局的潜力。单细胞研究提供对肿瘤生态系统的了解，包括乳腺癌中的免疫细胞多样性。Chung等在原发性乳腺癌中进行单细胞转录组分析。尽管受细胞数量的限制，但这项研究发现，在乳腺癌肿瘤微环境中肿瘤内存在异质性并观察到T细胞显示出的免疫抑制特性。同样，Savas等揭示乳腺癌中T细胞亚群的细胞异质性，并发现有助于乳腺癌免疫监视的组织驻留记忆T细胞亚群表达高水平免疫检查点分子和效应蛋白。尽管此类分析为乳腺癌肿瘤学中的T细胞功能提供重要线索，但是在乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞的表型可塑性和动态变化仍需进一步探索。重要的是，Azizi等提供人类乳腺癌中免疫细胞的大规模单细胞转录图。他们发现，T细胞簇具有多种不同的环境特征，肿瘤驻留T细胞被定位在连续的活化和分化轨迹上，组合的环境刺激和TCR利用塑造肿瘤浸润淋巴细胞的多种表型。这项研究为乳腺癌中肿瘤浸润免疫细胞的表型多样性提供更为细致入微的观点，这可能有助于更好地了解肿瘤进展和治疗反应的机制。尽管涉及不同的乳腺癌亚型，但该研究受患者人数的限制，无法提供足够的信息来评估乳腺癌各类亚型中免疫细胞表型的区别。相反，Wagner等破译具有乳腺癌亚型的患者的肿瘤和免疫细胞的单细胞蛋白质组学，从而了解不同乳腺癌亚型之间的生态系统差异，尤其是免疫细胞的差异。值得注意的是，他们在高级别雌激素受体阴性（ER-）和ER阳性（ER+）肿瘤中观察到较高水平的Tregs细胞和耗竭T细胞，可能表明ER-和ER+患者有对免疫检查点抑制剂更好反应的细胞基础。在乳腺癌生态系统中的此类肿瘤免疫关系，可以帮助指导患者分层并促进个性化免疫治疗。其他具有肿瘤微环境单细胞特点的肿瘤包括头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和肝细胞癌（HCC）。Puram等通过scRNA-seq技术研究了头颈部鳞状细胞癌中的原发性和转移性肿瘤生态系统。他们鉴定头颈部鳞状细胞癌中不同的T细胞亚群，并确定T细胞功能衰竭程序，然而，由于关注点主要集中于非免疫部分，他们提供的关于T细胞功能的信息则是有限的。Zheng等绘制肝癌单细胞T细胞的转录图谱，并通过观察肿瘤中浸润的Tregs细胞和CD8 T细胞的克隆富集，发现肿瘤内T细胞的免疫抑制表型。这项研究首次对肿瘤浸润淋巴细胞进行大规模和深入分析，揭示HCC进展的潜在细胞机制。
综合来说，这些基线数据分析共同阐明多种肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的基本特性。不同肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞在抗肿瘤免疫方面表现出共同和特定的特点，这可能是由不同器官的特殊组织微环境驱动的。因此，对更多肿瘤患者进行T细胞特征的全面分析将阐明肿瘤进展的机制和治疗应答的差异，从而促进肿瘤治疗中的个性化免疫治疗。
尽管细胞组成和功能状态是肿瘤浸润淋巴细胞的主要特点，但其抗原特异性也可作为抗肿瘤免疫应答的关键决定因素，并可影响免疫治疗的有效性。越来越多证据表明，肿瘤中相当一部分T细胞与癌旁正常组织有共同的TCR（T细胞受体），这表明它们可能与抗肿瘤免疫无关。此类T细胞代表靶向突变背景或病毒感染的“旁观者”T细胞，或者它们可能反映由肿瘤内炎症反应驱动的效应或记忆T细胞从血液向组织的连续迁移。重要的是，临床上有效的肿瘤浸润淋巴细胞是靶向肿瘤抗原T细胞；因此，分离肿瘤反应性T细胞对基于T细胞的免疫治疗至关重要。实际上，目前已经建立用于确定、分离和扩增T细胞特异性抗原的创新策略。Simoni等证明特异性标记物如CD39可用于鉴定肿瘤反应性T细胞。 Tran等将肿瘤浸润淋巴细胞与自体树突状细胞共培养，并体外转染编码自体肿瘤突变基因短肽的串联基因mRNA，以分离与肿瘤特异性抗原反应的T细胞。此外，Dijkstra等利用自体肿瘤类器官与PBLs（外周血B淋巴细胞)的共培养来从外周血中富集肿瘤反应性T细胞。这种方法为临床应用提供分离肿瘤反应性T细胞的有效手段。
虽然上述未经治疗肿瘤的基线概况分析提供了肿瘤浸润淋巴细胞在多种肿瘤中的固有特性，但关于治疗或干预研究可更好地了解免疫治疗分子基础和开发预测临床疗效的新方法。Jerby-Arnon等应用scRNA-seq技术研究免疫检查点抑制剂治疗前后人黑素瘤中的肿瘤细胞状态。他们发现恶性肿瘤细胞可以表达与T细胞排斥和免疫逃逸相关的耐药性程序，结合免疫治疗可抑制肿瘤的生长。这些发现提出攻克免疫检查点抑制剂耐药的新策略。然而，与肿瘤细胞的分子变化相比，人们更多关注免疫检查点抑制剂治疗中肿瘤浸润淋巴细胞的表型和功能动力学。通过对接受免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者单个免疫细胞进行分析，Sade-Feldman等发现CD8 T细胞表达TCF7蛋白或功能失调的两种独特状态可以预测免疫检查点治疗的成功或失败，从而突显肿瘤微环境中异种T细胞亚型的临床意义。同样，Yost等对抗PD-1抑制剂治疗的基底或鳞状细胞癌患者T细胞进行成对单细胞RNA和TCR测序，并揭示PD-1阻断后肿瘤特异性T细胞的克隆替代。具体来说，他们发现免疫检查点抑制剂处理可诱导T细胞的克隆扩增，而克隆扩增并非源自先前存在的肿瘤浸润淋巴细胞，而是由新型克隆型组成。这些结果强调全身免疫反应的重要性以及募集外周T细胞对免疫检查点抑制剂治疗有效的必要性。
外周血中T细胞可以迁移并浸润到肿瘤中，以补充效应池。因此，在免疫检查点抑制剂治疗前和后人外周血单个核细胞的变化也得到深入研究。Wu等对不同肿瘤患者T细胞RNA和TCR进行单细胞测序，他们发现在肿瘤组织、邻近正常组织和外周血整个系统水平上，类效应器T细胞的克隆性扩增可以介导更好地抗PD-L1治疗反应。这些发现表明，对免疫检查点抑制剂有效应答需要外周血中补充新鲜的、未耗竭的T细胞。同样，Krieg等使用质谱流式细胞术鉴定转移性黑色素瘤患者抗PD-1免疫治疗之前和之后外周血中的免疫细胞亚群。他们发现，在应答者中，当肿瘤中CD8 T细胞增加时外周血中的T细胞则是减少的，这表明免疫检查点抑制剂应答和系统免疫具有重要性的主要原因是CD8 T细胞具有更高的迁移能力。值得注意的是，他们发现髓样细胞的突变频率还可以预测抗PD-1治疗反应性，从而强调髓样细胞在抗肿瘤免疫应答及其潜在临床应用中的重要性。
尽管T细胞已是肿瘤免疫治疗的重要靶点，人们希望采用单细胞技术探索髓样细胞的异质性。近年来，髓样细胞也受到关注，因为髓样细胞在肿瘤微环境中表现出特定的表型和功能，这些表型、功能通过调节T细胞功能、直接调节肿瘤细胞的生长，进而影响肿瘤进展和免疫治疗的反应 （图3）。
作为专职抗原呈递细胞，树突状细胞不仅在T细胞活化中起着核心作用，并且是维持长期抗肿瘤适应性免疫反应的必要条件。从不同树突状细胞亚群的表型和功能来看，虽然pDCs和cDC1在抗肿瘤免疫中的作用可能还需要进一步验证，但是由于二者构成相对同质，目前它们的功能较为清楚。相比之下，cDC2s由异质组分构成，因此其功能尚不清楚。单细胞技术使人们不论在健康和疾病状态下都可以全面探知树突状细胞组分。例如，Villani等使用scRNA-seq在人血液的cDC2s亚群中确定一个新的分支表型。同样，Ductertre等在风湿性疾病活动性相关的循环炎性树突状细胞和生物标记物的基础上, 从功能上揭示cDC2s中独特的亚群。关于肿瘤中树突状细胞亚群，Brown等发现以不同发育途径和转录调控因子为特征的两种主要cDC2s谱系，二者在小鼠和人类黑色素瘤中表现出明显的促炎和抗炎潜能。Zhang等报道称，表达LAMP3的cDCs子细胞亚群可从肝肿瘤转移到肝淋巴结并调节淋巴细胞的活化。这些发现强调树突状细胞亚群的异质性，并促进树突状细胞特定亚群相关靶向免疫治疗的发展。
图2.不同类型肿瘤单细胞分析策略和单细胞研究。a.单细胞技术工作流程，包括单细胞测序和流式细胞术。对于单细胞测序，深度分析或大规模分析基于平板和液滴的常用策略。b.基于目前单细胞技术分离各种组织类型肿瘤免疫浸润的研究总结。（注：Tech技术；FACS荧光激活细胞分选；T肿瘤；N邻近正常或健康组织；P外周血；其他细胞、非免疫细胞（包括恶性细胞和间质细胞）；scTCR单细胞TCR信息；BCC基底细胞癌；SCC鳞状细胞癌；NSCLC非小细胞肺癌；RCC肾癌；ccRCC肾透明细胞癌；CRC大肠癌；BC乳腺癌；HCC肝细胞；HNSCC头颈部鳞状细胞癌；Endo AD子宫内膜腺癌。）
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