《食品科学》：浙江海洋大学林慧敏教授等：真空低温烹饪对南美白对虾肌原纤维蛋白结构的影响|多肽|林慧敏|氨基酸|白对虾|蛋白质|食品科学

南美白对虾（

Penaeus vannamei

）因其令人愉悦的风味和丰富的营养价值而广受消费者的青睐。新鲜南美白对虾的含水量、不饱和脂肪酸含量和蛋白酶活性均较高，极易受微生物、酶等因素的影响而腐败变质。所以鲜虾在捕捞之后，需冷藏冷冻或尽快加工成产品以延长保质期。热处理被认为是南美白对虾的重要加工手段之一。深入了解热加工过程中肉制品的蛋白质氧化情况显得尤为关键。而在南美白对虾中，肌原纤维蛋白（MP）约占其总蛋白的50%，是影响其加工生产质量的主要成分。

真空低温烹饪（SV）被认为是实现食品加工理想效果和功能属性的最佳技术，其采用真空袋密封食物并以水或蒸汽作为传热介质。该加工工艺的最大优势在于能够防止水分、营养物质和挥发性物质的流失，抑制好氧细菌的生长，进而延长产品在贮藏过程中的保质期。

浙江海洋大学食品与药学学院的冯洁、费雨萱、林慧敏*等通过在不同温度（40、50、60、70、80 ℃）条件下SV加工南美白对虾5、10、15 min，测定溶解度、表面疏水性、羰基、总巯基含量的变化等指标，探究不同温度和时间组合SV加工南美白对虾MP结构的影响。旨在为SV加工南美白对虾的优势提供一定的理论依据，为市面上虾产品的加工提供新的参考。

1 SDS-PAGE分析

电泳是对蛋白质结构变化的一种表征方法。SDS-PAGE通常用于表征蛋白质片段间所形成的共价键作用，其条带的变化可以反映蛋白质交联和降解的变化情况。如图1所示，南美白对虾的MP主要由肌球蛋白重链（MHC）、副肌球蛋白（PM）、肌动蛋白（Actin）、原肌球蛋白（TM）和肌球蛋白轻链（MLC）组成。分子质量高达240 kDa的是MHC，大约在100 kDa的是PM，而中等分子质量的则为Actin（约45 kDa）和TM（约38 kDa）以及可能的肌浆蛋白（SP）（接近30 kDa和75 kDa）。20 kDa和15 kDa的两个低分子质量条带被认为是MLC（调节轻链和必需轻链）。其中MHC和Actin被认为是最重要的部分。Yu Jiaqi等也报道了类似的结果。MHC是虾肌肉中对温度波动最敏感的蛋白质。在电泳条带中，40 ℃-5 min的MHC条带强度低于40 ℃-10 min的条带强度，50 ℃-5 min的MHC条带也窄于50 ℃-10 min的条带，并且80 ℃后条带逐渐变浅。可能是由于蛋白质的热不稳定性在加热初期发生降解，即发生解构现象，MHC的头部或尾部逐渐展开。但是在一定程度上随着加热时间的延长，MHC展开的头部或尾部参与分子间和分子内交联，即发生重组现象，在60 ℃-10 min条带强度达到最高。

2 溶解度分析

溶解度不仅是评估蛋白质聚集程度的指标之一，也是衡量蛋白质功能特性的有效指标。在加热过程中，MP可能经历变性、去折叠和聚集等变化，这可能对其溶解度产生影响。如图2所示，随着SV加工温度升高和加工时间延长，溶解度在总体上呈现下降的趋势，50 ℃-5 min条件下溶解度与鲜样相比出现显著差异（

P

＜0.05），这与Kang Zhuangli等的研究结果具有一致性。这一结果表明，SV加工对南美白对虾MP溶解度有显著影响，并且与加工温度和时间密切相关。同时，MP大约在50 ℃-5 min条件下到达变性点。这可能是由于SV加工后的蛋白发生解构，内部的疏水基团、巯基暴露，进而形成二硫键，疏水性增加，引发蛋白交联聚集，导致溶解度降低。但是随着加工温度升高和加工时间延长，溶解度略有升高。这可能是因为SV加工过程中蛋白质发生了重组，加热导致Actin和肌球蛋白解聚，MP小片化程度提高，促进可溶性蛋白的形成，进而使溶解度短暂升高。

3 表面疏水性分析

表面疏水性表示暴露于蛋白质表面疏水性基团的数量，可用于衡量蛋白质促进分子间相互作用的能力。同时，它也能够对蛋白质的构象和结构变化进行有效表征。由图3可知，南美白对虾MP的表面疏水性总体呈现出随着SV加工温度升高和时间延长而呈逐渐增强的趋势，在50 ℃-10 min条件下与鲜样相比出现显著差异，与溶解度变化趋势一致，而在70 ℃-5 min条件下达到最大值，随后又降低。表明MP在此过程中发生了解构，内部的疏水区域得以暴露，尤其是一些疏水性氨基酸的暴露，从而增加了疏水性。随着加工温度升高和时间延长，蛋白质分子间发生聚集，或是暴露在周围环境中的疏水基团和其他分子发生相互作用，使得某些基团被包埋。疏水性氨基酸残基与水相之间的相互作用下降，导致该过程中疏水效应降低。

4 羰基含量分析

热加工会导致蛋白质发生氧化，氧化应激会致使蛋白质结构产生不可逆的变化，羰基化是蛋白质氧化应激过程中不可逆的关键变化之一。通常而言，蛋白质羰基含量与氧化程度之间呈正相关，即羰基含量越高，蛋白质的氧化程度就越大。由表1可知，SV加工后的南美白对虾MP中羰基含量高于鲜虾。可能是加热促进了蛋白质结构的展开，氨基酸暴露并使它们更容易受到活性氧的攻击。高温又促进了蛋白质的聚集和沉淀，导致羰基的包埋，降低了它们在蛋白质中的含量。随着SV加工过程中温度的升高，加速了蛋白质的氧化，蛋白发生解构，自由基攻击肽键的侧链产生羰基化合物，导致羰基含量的进一步升高。

5 总巯基含量分析

巯基在蛋白质结构的完整性中起着关键作用，是最活跃的官能团之一。随着蛋白质结构的展开，巯基逐渐暴露在蛋白质表面，使它们容易受到氧化并形成二硫键，这个过程会导致巯基含量的降低。由表2可知，随着加工温度升高和加工时间延长，总巯基的含量整体呈升高趋势。这可能是因为加热导致MP分子结构展开，巯基更多暴露在蛋白质表面，但是由于没有与足够的活性氧接触，故较少发生或不发生氧化。在加热过程中，蛋白质分子也会发生不规则聚集，分子内部的蛋白质分子也会再次包含一些巯基，导致总巯基含量出现降低趋势。

6 粒径分析

粒径分布反映了蛋白质颗粒的聚集程度，可以通过多分散指数（PDI）和平均粒径进行量化。如图4、5所示，随着SV加工温度升高和时间延长，MP分子的粒径和PDI也逐渐增加，说明其聚集程度逐渐增加和分布均匀程度下降，在50 ℃-5 min时出现明显变化。这与Xu Yongxia等的研究结果一致。这可能是因为加热诱导蛋白聚集，引起蛋白质去折叠和表面积增加，同时蛋白质之间的二硫键、氢键和疏水相互作用也增强，促进了MP分子间的聚集，形成较大粒径的颗粒，分布越来越不均匀，从而导致虾MP粒径和PDI增加。PDI在60 ℃-15 min条件下达到最小值，表明该SV加工条件下颗粒分散性最佳。而在80 ℃-5 min条件下处理后（80 ℃-10 min和80 ℃-15 min）PDI的下降可能是由于此时的MP形成了较为稳定的聚集体。此外，这与通常由蛋白中巯基暴露进一步形成二硫键引起的MP聚集不同。聚集的驱动力因蛋白质而异。这可能是由于在40～80 ℃各加热5～15 min进行SV，疏水相互作用在南美白对虾MP的热聚集中起主要作用，而二硫键起辅助作用。

7 FTIR分析

FTIR可以提供有关蛋白质二级结构的信息，从而反映MP的构象变化。分析不同状态、不同浓度和不同环境下蛋白质和多肽的二级结构，可研究蛋白质变性过程和蛋白质-蛋白质的相互作用。南美白对虾MP在红外区域具有几个特征吸收带。如图6所示，所有实验组均显示出了典型的吸收带和蛋白质的特征峰。其中1 600～1 700 cm-1处的酰胺I带反映了蛋白质二级结构中的C＝O拉伸振动和C＝H拉伸振动，该振动经常用于表征蛋白质的聚集和展开。蛋白质二级结构由

-折叠（1 600～1 640 cm -1 ）、无规卷曲（1 640～1 650 cm-1）、

-螺旋（1 650～1 660 cm-1）和

-转角（1 660～1 690 cm-1）组成。由图7可知，在所有的样品组中，

-折叠、无规卷曲、

-螺旋和

-转角含量随着加工温度升高和时间延长而发生了变化，这表明SV加工对南美白对虾MP的二级结构有影响，在SV加工过程中发生了解构重组现象。虾MP主要结构为

β-

折叠，

-螺旋大致呈现先降低后增加的趋势，在

-螺旋结构的消失过程中，伴有

-折叠、

-转角的形成。与

-螺旋相比，

-折叠是相对松散的结构。这会导致更多疏水区域的氨基酸侧链暴露，使得蛋白更容易进行交互，而这些相互作用对于MP的聚集来说至关重要[。可能是由于温度升高，一部分MP分子内的氢键网格状结构被破坏，导致MP分子展开并破坏了有序的二级结构，

-螺旋反卷积展开转化为

-折叠结构，导致

-螺旋含量的降低。随着加工温度升高和时间延长，MP的二级结构可能发生重组，或是形成有序的凝胶状结构，导致

-螺旋的含量增加。该结果表明，SV加工导致蛋白质变性、疏水基团暴露和含水量降低，破坏了支持

-螺旋构型的链内氢键，从而出现蛋白质去折叠，同时加强了

-折叠中占主导地位的疏水相互作用，蛋白质聚集体逐渐增加。此外，

-折叠含量以非线性方式增加，这与Sun Peizi等的研究结果一致。

8 拉曼光谱分析

拉曼光谱是一种可以提供有关蛋白质多肽主链构象、蛋白质侧链微环境和化学信息的无损检测工具，其中酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）常用于分析蛋白质的二级结构信息，主要由C＝O拉伸产生，部分由肽组的C—N拉伸、C

-C-N弯曲和N—H平面内弯曲产生，可通过分析酰胺带的频率确定蛋白质中二级结构的分布。如图8所示，鲜样中拉曼带以1 663 cm -1 为中心，随着加工温度升高和加工时间延长，该波段的最大拉曼强度总体上逐渐向更高频率位移。表明SV热处理导致了蛋白质二级结构的变化，且随着加工温度升高和加工时间延长，

-折叠和无规卷曲含量增加。原因可能是加热导致南美白对虾MP部分展开和聚集，即在该过程中蛋白发生了解构与重组现象。

-折叠的形成更有利于蛋白质间的相互作用，并有助于生成蛋白质凝胶网络。该变化印证了MP表面疏水性、粒径以及FTIR分析结果。

结论

本研究分析了不同SV加工温度和时间组合对南美白对虾MP结构的影响。当SV加工温度恒定时，随着加工时间的延长（或当加工时间恒定时，随着加工温度的升高），南美白对虾MP的理化指标总体呈现出溶解度降低、表面疏水性增大、羰基和总巯基含量增加、粒径变大的趋势，说明SV加工使得南美白对虾MP氧化，结构发生改变，出现解构、重组及聚集等现象，且约在50 ℃-5 min条件下达到变性点。在SDS-PAGE分析中，40 ℃-5 min、50 ℃-5 min组的MHC条带宽度分别窄于40 ℃-10 min、50 ℃-10 min组也佐证了这一点。总巯基含量和粒径结果表明，在40～80 ℃各加热5～15 min，二硫键在MP的聚集中并非起到主要作用。同时，通过FTIR和拉曼光谱分析发现，MP二级结构中

-螺旋含量表现出先降低后增加的趋势，且降低过程中伴随

-折叠和

-转角结构的增加，进一步佐证了SV加工过程中MP发生解构重组现象。本研究结果有助于为虾加工行业和消费者设计适当的鲜虾SV处理方案。

通信作者：

林慧敏教授

浙江海洋大学食品与药学学院

林慧敏，食品科学博士，博士后，浙江海洋大学食品与药学学院教授。日本长崎大学及美国佐治亚大学访问学者。主要从事食品科学与工程、水产品加工及贮藏工程、海洋生物资源的加工与综合利用方向的教学和科研工作。先后主持国家青年基金项目“纳米自组装带鱼肽/铁/肽结构中量子点接触的功能调控研究（31301597）”，国家重点研发计划项目子课题“鱼类方便食品品质提升关键技术研发与产业示范（2020YFD0900901）”国家星火计划“鱼糜漂洗液鱼蛋白铁肽分离关键技术研究及示范（2013GA700259）”，省重大科技专项计划项目“低温等离子体在鱿鱼加工及冷链物流过程中的应用研究与示范（2014C02022）”，省自然科学基金“基于亚铁离子螯合诱导的带鱼蛋白微胶囊形成机理及缓释机制研究”，舟山市科技计划项目“青占鱼原料安全储运及即食食品开发研究产业化（2011C22048）”等。先后参与国家科技部国际合作项目“海水产品流化冰船上保鲜关键技术合作研究”（2012DFA30600），浙江省科技厅重大科技专项“冷冻水产品大肠杆菌生物控制关键技术研究与示范”（2011C13027-2）等，获2012年度舟山市科学技术进步三等奖（排名第一），2015年度中国商业联合会科学技术奖特等奖（排名第五）；2016产学研合作创新成果优秀奖（排名第二）;第八届中国技术市场金桥奖（排名第三），舟山市科学技术进步三等奖（排名第一）等。以第一或通信作者在