麦卢卡蜂蜜是由蜜蜂采集生长于新西兰和澳大利亚的麦卢卡树（Leptospermum scoparium）的花蜜制成，其含有甲基乙二醛（MGO）、多酚类化合物和黄酮类物质等活性成分，这些成分被认为是其强效抗炎作用的主要贡献者。研究表明，麦卢卡蜂蜜通过调控炎症信号通路，不仅可以抑制促炎因子的释放，还能够减轻氧化应激对细胞的损伤。
炎症是一种复杂的生理免疫反应，当炎症反应过度或调控失衡时，常导致组织损伤，进而诱发多种慢性炎症性疾病。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要成分，是研究体外炎症模型中广泛应用的经典诱导剂。核因子κB（NF-κB）作为炎症信号通路的核心转录因子，在调控多种与炎症反应、免疫应答和细胞生存相关的基因中发挥关键作用。
中国计量大学生命科学学院周小玲、赵微、张雅芬*等通过LPS诱导构建Caco-2和HepG2细胞炎症损伤模型，分别模拟肠道屏障和肝脏炎症环境，进一步通过细胞活性检测和促炎因子的表达系统评估麦卢卡蜂蜜的抗炎作用及其可能机制，旨在明确麦卢卡蜂蜜在炎症调控中的作用，为其在肠道和肝脏炎症性疾病中的应用提供理论支持，并为炎症相关疾病的治疗策略提供新的思路和方向。
1 细胞炎症模型的建立
采用CCK-8法检测LPS对细胞生存率的影响，初步得选合适的LPS诱导质量浓度，结果如图1所示，在1、6、12 h内，LPS质量浓度在2.00 μg/mL及以上时，HepG2细胞活性显著下降（P＜0.05），LPS质量浓度为4.00 μg/mL时，Caco-2细胞活性显著下降（P＜0.05）。
进一步通过显微镜观察不同质量浓度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）LPS处理对HepG2和Caco-2细胞形态的影响。如图2所示，正常的HepG2呈现典型的上皮样形态，胞体圆润。0.25、0.50 μg/mL LPS处理HepG2在1、6、12 h无明显变化，细胞间连接略微松散，但整体细胞层保持较为完整。1.00、2.00、4.00 μg/mL LPS处理组形态发生了显著变化，细胞黏连，变得更加扩展，当处理6 h和12 h时，2.00、4.00 μg/mL细胞损伤更加严重，大量细胞死亡。而正常生长状态下Caco-2细胞呈片状分布并形成明显的纹状细胞紧密连接结构（图3）。经0.25、0.50、1.00 μg/mL LPS处理后，1、6 h和12 h内，Caco-2细胞的细胞间连接保持紧密，未见显著形态变化。在2.00、4.00 μg/mL LPS处理细胞时，细胞紧密连接结构消失，4.00 μg/mL出现大量死细胞。在2.00 μg/mL LPS处理下，细胞出现炎症损伤并伴随纹状紧密连接的模糊，细胞出现凋亡现象。
最后，通过实时荧光定量PCR检测HepG2和Caco-2细胞在LPS诱导后不同时间点（1、6、12 h）IL-1β和IL-6基因的表达量。如图4所示，LPS处理组中，IL-1β和IL-6的表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），表明LPS处理成功诱导了促炎因子的表达。HepG2和Caco-2中IL-1β基因的表达水平在LPS诱导1 h后达到最高（P＜0.05）。IL-6基因的表达峰值则存在一定的细胞差异：在HepG2细胞中，IL-6基因的表达在1 h时达到最高水平，随着时间的延长，其基因表达量显著下降（P＜0.05）；而在Caco-2细胞中，IL-6基因的表达在6 h时达到最高水平，随后在12 h时出现回落。
结合分析细胞活性、细胞形态特征和炎症因子的表达情况，结果表明，1.00 μg/mL的LPS诱导细胞出现了炎症反应特征，但是未出现细胞坏死，细胞存活率没有显著性降低；因此，对于HepG2细胞选择1.00 μg/mL的LPS诱导炎症损伤；对于Caco-2细胞，2.00 μg/mL LPS可诱导典型的炎症反应特征，同样未观察到细胞凋亡或坏死，细胞存活率也未显著下降，因此Caco-2细胞选择2.00 μg/mL的LPS诱导炎症损伤。进一步通过炎症因子的诱导响应表达确认炎症模型构建成功。
2 麦卢卡蜂蜜对HepG2和Caco-2细胞活性影响
如图5所示，不同质量浓度（5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mg/mL）的麦卢卡蜂蜜对HepG2和Caco-2细胞的存活率影响不同。在低于或等于20.00 mg/mL的蜂蜜质量浓度条件下，两种细胞的存活率均接近100%，未观察到显著毒性（P＞0.05），表明低质量浓度蜂蜜对细胞的增殖无抑制作用，且具有良好的生物相容性。然而，当质量浓度增加至25.00 mg/mL及以上时，细胞存活率显著下降（P＜0.05），其中在25.00 mg/mL和30.00 mg/mL时，HepG2细胞的存活率分别降至70.23%和59.33%，同时Caco-2细胞则降至67.93%和65.84%。这表明高质量浓度麦卢卡蜂蜜对细胞增殖产生抑制作用或毒性效应。
根据实验结果分析，在后续研究中，应优先选择蜂蜜质量浓度低于20.00 mg/mL作为研究剂量，以避免对细胞产生毒性作用。
3 麦卢卡蜂蜜对LPS诱导HepG2和Caco-2细胞中炎症因子基因表达的影响
通过qPCR分析了LPS不同诱导时间（1、6、12 h）条件下对HepG2和Caco-2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65、COX-2基因表达的影响，以及麦卢卡蜂蜜对其表达的调节作用。如图6所示，炎症因子的响应结果在不同时间段和不同细胞系中有所不同。在LPS诱导后的早期反应（1 h），HepG2细胞中主要的炎症因子为IL-6和IL-1β，而Caco-2细胞是TNF-α和IL-1β。在反应进行6 h后，HepG2细胞的下游基因COX-2开始迅速响应并表达，并在12 h后达到稳定的高水平，成为主要的炎症因子。而Caco-2细胞中，6 h时NF-κB通路的核心因子p65和IL-6仍然是主要的炎症因子，12 h后成为最显著的炎症因子。
随着麦卢卡蜂蜜质量浓度的增加（2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL），LPS诱导的炎症因子基因表达显著降低（P＜0.05）。在不同时间不同细胞，麦卢卡蜂蜜质量浓度为10.00 mg/mL时，LPS诱导的炎症因子基因表达均显著低于LPS组，接近对照组水平。
4 麦卢卡蜂蜜对LPS诱导Caco-2和HepG2细胞中相关炎症蛋白的影响
为进一步验证qPCR分析结果，通过ELISA法分析了HepG2和Caco-2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65和COX-2的蛋白表达水平。由图7可知，ELISA实验结果与qPCR结果相印证，LPS诱导后，细胞中上述炎症因子的表达量在不同时间点存在显著变化。在LPS刺激后，HepG2细胞于早期（1 h）中IL-6与IL-1β的蛋白表达水平明显升高，6～12 h时COX-2蛋白表达水平逐渐升高；而Caco-2细胞中，早期（1 h）主要表现为TNF-α和IL-1β表达水平升高，6 h时NF-κB p65和IL-6表达增强，至12 h则以COX-2为主要炎症因子。与单独LPS处理组相比，10.00 mg/mL麦卢卡蜂蜜对炎症因子蛋白的表达抑制作用最为显著，而20.00 mg/mL麦卢卡蜂蜜的抗炎能力相较10.00 mg/mL略有减弱（P＜0.05），进一步验证了qPCR分析的趋势。
讨论与结论
Caco-2细胞常用于研究肠道炎症反应及屏障功能保护，HepG2细胞则常用于揭示肝脏在炎症和免疫调控中的作用。本研究基于Caco-2细胞和HepG2细胞构建LPS诱导的炎症损伤模型，揭示了麦卢卡蜂蜜在不同质量浓度下对LPS不同时间诱导下的炎症反应的调控作用，明确了其主要通过NF-κB信号通路实现抗炎效果。结合两种不同细胞模型，可为解析麦卢卡蜂蜜在肠道和肝脏炎症中的作用提供更为全面的视角，并为其在炎症性疾病治疗中的应用提供依据。
LPS是革兰氏阴性菌细胞壁中的主要成分，LPS诱导通常导致细胞内炎症信号迅速启动，进一步释放大量炎症因子，从而引发急性或慢性炎症反应，广泛用于体外细胞实验，作为建立炎症模型的经典工具。本研究探讨了麦卢卡蜂蜜对LPS诱导的HepG2和Caco-2细胞炎症抵抗作用，通过LPS诱导建立炎症模型，评估在不同时间点（1、6、12 h）以及不同质量浓度（2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL）条件下，麦卢卡蜂蜜对关键炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65、COX-2）的基因和蛋白水平表达的调控作用。不同剂量的LPS对细胞起到的作用不同，不同的细胞对于LPS的耐受浓度也不同，研究通过CCK-8法和显微镜观察法进行对诱导浓度的初得选，发现用1.00 μg/mL LPS诱导HepG2细胞时，细胞活性处于正常对照组水平，同时细胞形态明显变长、有黏连，但不引起细胞死亡，同时在不同诱导时间下相关炎症因子的相对表达量均显著性上升；而诱导Caco-2细胞时，2.00 μg/mL LPS能够和上述诱导HepG2细胞炎症效果相同，细胞紧密连接结构会消失。不同细胞对LPS诱导的敏感性以及不同细胞表面TLR4受体的表达水平和下游信号通路的敏感性差异会影响LPS的诱导浓度。
麦卢卡蜂蜜在调控炎症反应中展现出良好的降低炎症因子水平的作用，炎症反应作为一个由先天免疫系统驱动的动态过程，通常可划分为启动、放大与维持3 个阶段，而这一过程在分子层面上高度依赖NF-κB信号通路的时序激活。在炎症反应的早期（1 h），TNF-α和IL-1β作为炎症反应的“急先锋”，其mRNA及蛋白表达水平显著上升，是炎症通路中最先被激活的关键分子，迅速合成并释放至细胞外，招募中性粒细胞和单核细胞向炎症区域聚集，从而启动急性炎症反应。TNF-α与IL-1β作为NF-κB通路直接靶基因，是通路活化的早期敏感指标。随着炎症反应进入中期（6 h），IL-6的表达达到高峰，其作为转录后响应分子，标志着炎症信号从初始应答向系统性扩展转变。IL-6不仅受NF-κB调控，还能进一步激活Janus激酶/STAT3通路，形成正反馈放大环路，持续增强炎性信号。这一阶段通常反映了细胞已完成初期基因应答，转向蛋白水平的功能执行。
在炎症反应的后期（12 h），COX-2持续高表达，作为NF-κB通路的下游基因，表现出启动延迟但维持时间长的特征。COX-2通过催化前列腺素（如前列腺素E2）的合成，扩张血管、促进炎症细胞浸润和刺激痛觉感受器，从而维持炎症微环境的活跃状态。麦卢卡蜂蜜对COX-2的表达显著抑制，进一步表明其具有干预NF-κB信号通路末端效应的能力，有助于降低慢性炎症形成的风险。该系列变化与NF-κB通路的激活过程高度相关：LPS诱导的TLR4信号引导p65亚基从细胞质释放至细胞核，启动炎症相关基因的持续表达。TNF-α和IL-1β启动免疫应答，IL-6推动炎症信号扩展，COX-2维持慢性炎症状态，构成NF-κB通路调控下炎症因子的时序表达链条。研究还发现。这一规律在HepG2和Caco-2两种细胞模型中表现出不同的响应特征：HepG2细胞作为肝细胞模型，表现出快速而短暂的炎症反应，可能与其内源性负反馈机制有关；而Caco-2细胞作为肠道屏障模型，其炎症因子峰值出现相对滞后，可能与其屏障功能及信号调控的复杂性相关。在干预实验中，麦卢卡蜂蜜对炎症因子的蛋白表现出显著抑制作用，尤其质量浓度为10.00 mg/mL时，其抑制炎症因子效果最为显著，而质量浓度提升至20.00 mg/mL时，炎症因子的抑制效果反而减弱。这一现象可由Masad等的研究解释：当麦卢卡蜂蜜超过1%（相当于10.00 mg/mL）时，尽管不表现细胞毒性，但是能够增强促炎反应，从而抵消部分抑制效果。
综上所述，麦卢卡蜂蜜可通过抑制NF-κB通路及其下游炎症因子的表达，展现出显著的抗炎效果。在不同麦卢卡蜂蜜处理质量浓度和LPS不同诱导时间条件下，其抗炎作用的差异性可为理解天然产物在炎症调控过程中的作用机制提供重要线索，同时也体现出其在肠道和肝脏炎症性疾病治疗中的潜在应用价值。然而，本研究未深入探讨麦卢卡蜂蜜中具体活性成分的分子靶点，未来研究应结合多组学技术进一步阐明其分子机制，并在体内模型中验证其抗炎效果，为开发基于天然产物的抗炎治疗策略提供新方向。
本文《麦卢卡蜂蜜对脂多糖诱导炎症反应的调控作用》来源于《食品科学》2023年46卷第18期122-131页，作者：周小玲，赵 微，叶子弘，张雅芬 *。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250116-122。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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