Nat Cell Biol | 三维模型解密胚胎最初的形态之谜|tgf|三维模型|上皮|外胚层|多能干细胞|间质

撰文 |咸姐

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，多能性细胞经历了一系列复杂而有序的形态发生事件，这一过程对人类生命起源的理解至关重要。全能性的合子经过卵裂形成内细胞团，在着床后，内细胞团中的原始外胚层细胞会发生根本性转变：它们从相对无序的细胞团，自组织形成一个具有顶-基极性的柱状上皮结构，并围绕着一个管腔（未来的羊膜腔）排列。这个上皮化的外胚层是后续发育的基石，它将暂时维持多能性，直到原肠运动开始。在原肠运动期间，外胚层上皮中的一部分细胞会经历上皮-间质转化（EMT），失去上皮特性并获得迁移能力，从而形成原条（P S ），并最终产生胚胎的三个胚层。因此，外胚层从上皮身份的建立到部分细胞的上皮特性丧失，是胚胎模式形成和细胞命运决定的关键转折点【1,2】。

然而，在人类发育中，究竟是哪些信号分子诱导并维持了着床后外胚层（PostEpi）的上皮身份？上皮身份的维持与细胞多能性状态是紧密耦联还是彼此独立的过程？这些问题在很大程度上仍然是未知的。这主要是由于对人类着床后胚胎进行研究面临着严峻的伦理约束和技术壁垒。传统的二维人多能干细胞培养体系虽然模拟了着床后外胚层的某些分子特征，但无法重现胚胎的三维结构和细胞间相互作用的复杂性，因而难以捕捉调控上皮极化和组织形态发生的完整信号网络。近年来，科学家们开发了多种三维胚胎模型来模拟早期发育，这些模型极大地增进了我们对某些发育事件（如管腔形成）的理解。然而，这些模型往往在复杂性与效率/可重复性之间存在权衡，且细胞类型异质性和培养成分的不确定性为精准解析特定发育过程的分子调控机制带来了挑战。例如， TGFβ超家族信号（包括TGFβ、Activin、NODAL等）在人类上胚层发育中的具体作用一直存在争议：这些信号分子既被报道可维持多能性，又被发现能诱导EMT和原条形成，其双重功能如何时空协调仍不清楚。因此，开发一个化学成分明确、高效且可重复的三维人类胚胎着床后外胚层模型，对于揭示调控上皮身份建立和原条形成的分子机制至关重要【3,4】。

近日，来自意大利帕多瓦大学的Graziano Martello团队在Nature Cell Biology上在线发表题为A human epiblast model reveals dynamic TGFβ-mediated control of epithelial identity during mammalian epiblast development的文章，开发了一种化学成分确定的三维模型，使多能干细胞自组织形成具有管腔的柱状上皮，并自发产生原条样细胞。这一模型的成功建立，为在体外深入探究人类胚胎着床后上皮身份的调控机制，特别是TGFβ超家族信号在这一动态过程中可能扮演的、此前未被充分认识的复杂角色，提供了一个强大、可靠且可进行高通量分析的研究平台。通过结合该模型与小鼠胚胎模型及体内实验验证，本研究揭示了一个在进化上保守的、动态调控多能性外胚层上皮身份的分子开关。

本文研究人员通过对人类及小鼠胚胎单细胞转录组数据进行分析，识别出上皮化过程的关键标记物变化，并基于此设计了一种明确含有TGFβ1、FGF2和 I NSULIN （三条在 PostEpi 阶段处于活跃状态的通路的配体）的培养基体系（E 8 ），然后将H9胚胎干细胞或KiPS诱导多能干细胞接种于基质胶上，最终高效地形成了具有管腔的柱状上皮囊肿。单细胞转录组分析证实，这些囊状结构包含转录谱与体内着床后外胚层高度一致的“PostEpi样”细胞群，以及后续自发产生的表达原条标记物的“PS样”细胞群。值得注意的是，体外模型中细胞的伪时间发育轨迹清晰地展现了从二维多能态向PostEpi样状态（上调上皮和极性基因）以及向PS样状态（上调间质和原条基因）转化的两条路径。该模型被命名为“3D-hE-gastruloids”，它高效地再现了外胚层上皮形成、管腔发生以及原条样细胞产生的关键发育事件，为后续机制研究提供了可重复且可控的实验平台。

随后，研究人员系统性地阻断 E 8培养基中的关键信号通路，发现撤除I NSULIN会导致细胞死亡，阻断FGF通路主要影响结构大小和存活，而抑制TGFβ家族信号（使用抑制剂SB43或A83，或通过CRISPRi敲低SMAD2）则不会影响细胞存活，但会严重破坏细胞自组织过程 —— 三维结构失去典型的柱状形态，顶端的F-肌动蛋白极性消失，上皮标志物（如CDH1、ESRP1）表达下调，间质标志物（如CDH2、VIM）则上调。时序实验表明，TGFβ1信号仅在上皮形成的起始阶段（培养的前2天）是必需的，此时抑制信号会彻底阻止上皮化；一旦上皮结构建立后（2天后），抑制信号对其维持则无显著影响。这些结果证明TGFB1通过SMAD2依赖的经典通路，在3D-hE-gastruloids形成的最初48小时内驱动多能干细胞获得并稳固柱状上皮身份，且此功能独立于其对多能性标志物的持续调控作用。

为验证TGFβ家族信号调控外胚层上皮自组织在进化上的保守性，研究人员在三种不同的小鼠体外模型中检验了其功能。首先，在仅由小鼠初始态胚胎干细胞（ ES ）嵌入基质胶形成的“ rosette ”结构中，抑制该信号会破坏上皮组织和管腔形成。其次，在由野生型和诱导表达Gata4的ES细胞混合形成的囊状结构（无需外源细胞外基质）中，抑制信号同样导致管腔发生和细胞极化完全缺失。最后，在更为复杂的“ETIX胚胎样体”（由ES细胞、滋养层干细胞和诱导表达GATA4的ES细胞构成）中，信号抑制虽不影响早期细胞聚集，但严重破坏了后续的卵圆柱体自组织、原羊膜腔形成及结构伸长，并伴随多能性标志物表达的丧失。三个不同复杂度模型的实验结果一致表明，无论是否存在外源性基质或胚外细胞，TGFβ家族信号对于促进小鼠多能性外胚层细胞在体外自组织形成极化上皮结构都是必需的，这提示了该调控机制在哺乳动物中的广泛保守性。与此同时，研究人员还在体内胚胎水平证明， TGFβ家族信号对于小鼠着床后早期胚胎中外胚层极化上皮的自组织、管腔形成以及多能性的维持是必需的，经A83 抑制剂处理的小鼠胚胎发生了严重紊乱 —— 外胚层上皮失去正常结构、原羊膜腔无法形成、OCT4表达显著降低，同时F-肌动蛋白和极性蛋白PODXL的分布变得杂乱无章，胚胎存在伸长缺陷和尺寸减小。

进一步地，研究人员发现， ZNF398是TGFβ1信号通路实现其促上皮功能的关键下游效应因子，它对于建立和维持外胚层的上皮身份既是必需的也是充分的，但其功能与多能性的维持相对独立。深入研究则证实， ZNF398通过直接激活上皮相关基因程序并同时抑制间质相关基因程序，来协同稳固上皮细胞身份。ZNF398的抑制导致多能性和上皮基因下调，同时上调间质和神经前体基因。ZNF398结合在大量受其调控的基因调控区域，特别是增强子区，并表现出同时激活和抑制基因表达的双重功能。通过整合其结合谱与功能丧失和功能获得实验数据，研究人员鉴定出一组受ZNF398直接调控的核心靶基因，包括被激活的上皮主调控因子ESRP1和紧密连接组分基因CGN，以及被抑制的关键EMT诱导因子ZEB2和间质标志物CDH2（图1）。与此同时，研究人员探讨了在 3 D上皮结构形成后，TGFβ家族的另一成员ACTIVIN信号对原条分化的影响。研究发现，单独添加Activin A即可高效诱导原条标记物（MIXL1、TBXT）的表达和GFP阳性间质细胞的出现，其效果甚至优于包含BMP4、FGF和LY的混合诱导方案，且该诱导能力显著强于 2 D培养条件。单细胞转录组分析证实，Activin A处理能从分子水平上将上皮样细胞高效转变为具有典型原条转录特征的细胞。此外，对比分析表明，形成的PS样细胞高表达Activin/Nodal受体而低表达TGFβ受体，这可能解释了为何在结构形成后TGFβ1无法诱导、而Activin却能高效诱导原条分化的现象。这些结果揭示了TGFβ家族信号在 3 D外胚层模型中具有动态的双重功能 —— 早期TGFβ1信号促进上皮身份建立，而上皮建立后，ACTIVIN信号则能高效启动上皮-间质转化和原条分化。

图1

综上所述，本研究成功构建了一个化学定义的 3 D人类外胚层模型（3D-hE-gastruloids），在没有胚外细胞参与的情况下，成功复现了着床后外胚层发育的关键特征。这表明，基底膜以及由FGF2、INSULIN和TGFB1介导的信号刺激，是巩固着床后外胚层身份并启动原条诱导的最基本条件。通过整合该模型、多种小鼠体外模型及体内胚胎实验，研究系统揭示了TGFβ家族信号动态且保守地调控哺乳动物多能性外胚层上皮身份的核心机制，阐明了同一信号家族在时间与空间上协调截然不同的细胞命运转变的重要过程。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01831-6

制版人：十一

参考文献

1. Boroviak, T. & Nichols, J. The birth of embryonic pluripotency.Philos. Trans. R. Soc. Lond. B369, 20130541 (2014).

2. Sheng, G., Martinez Arias, A. & Sutherland, A. The primitive streak and cellular principles of building an amniote body through gastrulation.Science374, abg1727 (2021).

3. Pedroza, M. et al. Self-patterning of human stem cells into post-implantation lineages.Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-023-06354-4 (2023).

4. Zheng, Y. et al. Controlled modelling of human epiblast and amnion development using stem cells.

Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-019-1535-2 (2019).

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（*排名不分先后）