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清醒小鼠头部固定是一种常用技术用于在动物保持清醒状态下进行高精度的神经记录（如双光子成像、虚拟现实、宽场成像、在体电生理记录等），同时避免运动伪影。

多电极阵列（如Neuropixels探针）能够以高时间分辨率对大量单个神经元进行电生理记录。通过使用这类探针可在同一动物体内同时测量功能上相互关联但解剖位置不同的多个脑区的神经活动。然而，在小鼠等小型动物中使用多个探针需要移除相当大一部分颅骨，同时必须尽量减少组织损伤并在记录过程中保持大脑稳定。

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Fig1 头架与颅骨开窗植入术

颅骨开窗：

选项 A（急性记录）：暂不开窗，仅预留区域，记录当天再开。

选项 B（慢性窗口）：

在头架中央开口内，用精细颅骨钻（<0.5 mm）缓慢磨出一个大范围薄层颅骨窗（如 4×4 mm²），或多个小孔（用于多探针）。接近硬脑膜时改用镊子或针尖轻柔剥离残余骨片，避免损伤硬脑膜或引起出血。若需长期成像，可保留完整硬脑膜；若用于电极插入，可小心移除。

Neuropixels 多探针清醒小鼠记录

阶段一：头架与可拆卸玻璃盖片植入

术前准备：

小鼠（通常为成年 C57BL/6 或转基因品系）经适应性训练，熟悉抓握和轻度约束。术前给予镇痛药（如布洛芬或卡洛芬）和抗生素。使用异氟烷维持麻醉，配合眼膏防干。

立体定位手术：

固定小鼠于立体定位仪，剃毛、消毒头皮。沿中线切开皮肤，剥离筋膜，暴露颅骨。清理颅骨表面（H₂O₂ 或生理盐水），确保干燥无出血。

头架固定：

使用牙科水泥将定制金属或3D打印头架牢固粘附于颅骨（覆盖顶骨及部分额骨）。

头架中央预留一个大开口（直径约 8–10 mm），用于后续多探针插入。

植入可拆卸玻璃盖片：

在头架开口处覆盖一块圆形玻璃盖片，用少量快速固化胶（如 UV 胶）临时固定。盖片可在记录前移除，避免阻碍探针插入。

术后恢复：

缝合皮肤边缘，给予术后镇痛 48–72 小时。恢复期 ≥7 天，并进行清醒头部固定适应训练（每天 10–30 分钟，持续 3–5 天）。

阶段二：探针精确定位与成像窗口安装（记录当天）

移除玻璃盖片：

轻柔取下临时玻璃盖片，暴露完整颅骨窗区域。

颅骨开窗（关键步骤）：

使用精细颅骨钻（<0.5 mm tip）在目标脑区上方小心磨薄或打孔（通常 4–6 个孔，直径 0.5–1 mm），避开主要血管。孔位根据目标脑区坐标预先设计。用 PBS 冲洗碎屑，保持硬脑膜完整（或轻柔移除）。

安装带孔塑料成像窗口：

放置一个定制的带孔塑料环（如聚醚醚酮 PEEK 或 Delrin 材料），孔位与探针路径对齐。该窗口可稳定脑组织、减少脑搏动，并防止探针插入时脑脊液流失。

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阶段三：清醒状态下探针插入与记录

头部固定：

将小鼠轻柔放入行为装置，用头架夹具固定头部，身体置于泡沫垫或跑步球上。

探针装载与定位：

将最多 6 根 Neuropixels 探针（如 NP 1.0 或 2.0）装载到高精度微操纵器

通过显微镜或摄像头对准颅骨开孔，缓慢下降探针至硬脑膜表面。

探针插入：

以 10–50 μm/s 的速度缓慢插入探针至目标深度。插入过程中小鼠应保持安静（可通过奖励或习惯化实现）。

电生理记录：

连接探针开始采集宽频信号（通常 30 kHz 采样率）。同步记录行为视频、跑步球运动、视觉刺激等。

阶段四：数据质量控制与探针回收

实时监测噪声水平、单位数量、LFP 特征，确保信号质量。记录结束后缓慢回撤探针，清洁并妥善保存。

关键优化点：

颅骨开窗面积大但精准：平衡多探针通路与脑稳定性。

硬脑膜处理：保留可减少炎症，移除可降低插入阻力，需根据经验选择。

清醒适应训练：小鼠必须平静。

虚拟现实模拟相关范式

头部固定小鼠能够实现对神经元活动的高分辨率监测并结合对环境刺激的精确控制。虚拟现实可用于在头部固定状态下模拟运动时的视觉体验，而一种低惯性的、可浮动的真实物理环境即“移动家园笼”（Mobile Home Cage, MHC）可调动更多感官模态，为复杂行为任务提供更丰富的实验场景。

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Fig2 基于气浮技术的清醒行为记录系统

(a) 头部固定装置：气浮支撑的碳纤维容器置于空气分配平台上的头部固定桥下方。

(b) 头部固定装置示意图（左）：小鼠头部被固定在桥上，但可通过自身运动带动下方容器自由移动；实际照片显示装有泡沫T型迷宫插件的容器（右）。

(c) 小鼠在从饲养笼转移至头部固定装置过程中，用法兰绒布包裹以减少应激。

(d) 头部固定夹持器以37°倾角安装，符合小鼠自然姿势。

(e) 连续多日限水对小鼠体重的影响：蓝色表示自由饮水期，灰色表示限水期。

(f) 在连续多日的15分钟实验中，每只小鼠完成的试验次数（即圆形跑道的圈数）

采用立体定位手术在实验前一周为小鼠植入头件。手术中，小鼠经异氟烷麻醉后固定于立体定位仪，在Bregma与Lambda之间切开皮肤暴露颅骨，用3%过氧化氢清洁表面并以Vetbond胶将皮肤边缘固定于颅骨以减少术后收缩。随后轻划颅骨以增强粘附力。在背侧海马上方钻取直径1.5 mm的颅骨开窗电生理实验中该窗口以琼脂封堵；最后，以牙科丙烯酸树脂将头板及导管整体稳固于颅骨。术后小鼠先单笼饲养48小时，再恢复至常规双笼环境继续休养3–5天。从术后第5天起，开始为期数日的清醒头部固定适应训练。每日进行15分钟手法接触：通过笼内熟悉的纸筒隧道温和取出小鼠，用手掌托持并允许其探索；随后将其放入Mobile Home Cage（MHC）系统的碳纤维圆形arena中自由活动5分钟。当小鼠能主动返回实验员手掌后，次日引入转移布巾训练将其置于布巾上反复包裹/展开数次（每次<20秒）。达到稳定配合后，正式进入头部固定阶段：小鼠被布巾包裹后置于MHC系统中，该系统由铝制支架和气浮支撑的超轻碳纤维容器（直径34 cm）组成。头板被夹紧于头柱，移除布巾后启动空气压缩机（噪音约50 dB），调节气压使平台悬浮高度刚好容许一张纸通过。实验中可通过更换泡沫插件切换跑道构型（如圆形或T迷宫）并在周围设置条纹、斑点等视觉线索辅助空间定位。所有头部固定实验连续多日进行，单次时长不超过20分钟，确保动物在清醒、低应激状态下完成神经记录或行为任务。

双光子成像中小鼠头部固定

对清醒小鼠在双光子显微镜下的高分辨率、长期稳定成像：

1. 头架手术植入

成年小鼠（8–12周龄）经异氟烷麻醉后，固定于立体定位仪。沿颅骨中线切开皮肤，将定制钛合金头板（其连接杆位于颅骨后方并抬高，避免遮挡小鼠±59.3°水平与±47°垂直视野）以快干胶初步粘附，并用牙科丙烯酸树脂牢固固定于顶骨与额骨。若需长期成像，在目标脑区（如视觉皮层或海马）上方钻取直径约3–5 mm的颅骨开窗，小心保留或移除硬脑膜，并覆盖玻璃盖片密封。术后给予镇痛药，单笼恢复48小时后转为常规饲养，恢复期不少于5天。

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2. 清醒适应与行为训练

从术后第5天起，每日进行10–15分钟的温和接触与头部固定适应训练：通过隧道或手掌转移小鼠，逐步引入包裹布巾和碳纤维跑轮环境，使其在无应激状态下习惯被固定于头柱上并能在低惯性跑轮上自由运动。训练持续3–5天，直至小鼠在固定状态下呼吸平稳、主动探索且无挣扎行为。

3. 头部固定与双光子成像对准

实验当日，将小鼠轻柔包裹后置于双光子显微镜的行为平台，通过夹具将头板牢固夹持于预校准的头柱上。系统采用统一的“小鼠–屏幕”几何构型确保刺激显示器位于标准视角范围内。为实现跨日精准复位，所有成像系统均基于一个集成头架接口的校准标尺进行配准：该标尺永久嵌入头架内，位于目标成像深度且垂直于光轴。

4. 机械稳定性验证

系统设计要求成像区域沿光学轴（z轴）总位移≤4 μm。通过计算机仿真与台架测试（悬挂20–100 g砝码）确认头架在0.5 N负载下中心挠度≤3.2 μm。活体测试中，在小鼠主动奔跑期间实时监测颅窗位移，结果显示最大瞬时位移≤2.2 μm，全程总位移≤3.3 μm，完全满足双光子钙成像对稳定性的严苛要求。

在清醒、行为活跃状态下对同一神经元群体进行功能成像

实验步骤：

本步骤旨在以最小化脑组织移动的方式植入用于头部固定的头板，必须严格遵守无菌操作以防感染；建议使用5–6周龄小鼠（雄雌均可），且进行膜片钳记录时年龄不超过12周，因年长动物颅骨增厚、脑组织特性改变易导致开颅困难、记录成功率下降及接入电阻升高。

手术开始前以异氟烷麻醉小鼠，通过呼吸频率和足趾夹捏反射确认麻醉深度，双眼涂眼科凝胶防干燥，置于加热垫保温并将头部牢固固定于立体定位仪。随后剃除头顶被毛、消毒，并在切口周围皮下注射局部镇痛药（如利多卡因/罗哌卡因）。沿颅骨轮廓切除圆形皮肤，彻底刮除顶骨与间顶骨表面及颅缝处的骨膜软组织（残留会导致头板松动；可用生理盐水湿润以助识别），再用组织粘合剂封闭皮肤边缘。待颅骨干燥后，轻磨骨面（避开目标区），沿颅缝涂3–4层组织粘合剂粘合骨片至无相对移动并覆盖其余骨面。接着用组织粘合剂初步固定头板，再以牙科水泥牢固包埋，覆盖所有暴露颅骨（仅留目标脑区）并在该区域周围构筑1–2 mm高记录腔壁（用于放置AgCl接地电极及微电极通道）；

若头板为金属须确保腔内金属完全被水泥覆盖以实现电绝缘。最后以Kwik-Cast硅胶密封开颅区，皮下注射全身镇痛药并在术后48小时内持续镇痛、提供湿粮。术后进入行为训练与习惯化阶段：每日将小鼠头部固定于实验装置中最多1小时，直至其表现规律运动（如跑轮奔跑）和舒适体态（尾巴下垂、无身体扭曲），期间可同步训练特定头部固定行为任务。

宽场成像头部固定

首先，在实验前至少7天完成慢性颅骨窗植入手术确保小鼠（通常为5–8周龄C57BL/6J或表达GCaMP等钙指示剂的转基因品系）充分恢复；从术后第3–5天起开始行为习惯化训练，每日用法兰绒布温和包裹小鼠进行转移并逐步引入短时间（5–10分钟）的头部固定于行为平台，随后逐渐延长至30–60分钟，直至小鼠表现出安静呼吸、自发跑轮运动、尾巴自然下垂且无挣扎或过度理毛等应激行为，通常需5–7天完成适应。实验当日，将实验室环境控制在安静、柔和光照和22–24°C室温条件下，提前开启宽场成像系统、行为记录设备（如跑轮旋转编码器、眼动追踪及全身摄像系统）以及视觉刺激显示器并进行预热与校准。轻柔地从饲养笼中取出小鼠，用法兰绒布包裹以减少应激迅速转移至成像平台。将小鼠头部牢固夹持于标准化头柱夹具中，确保钛合金头板与夹具完全贴合、无松动；同时调整身体支撑结构（如泡沫垫或气浮式移动家笼），使小鼠可在固定状态下自由奔跑，尾部自然下垂。校准“小鼠-屏幕”几何关系（距离15–20 cm，双眼正对中心）确保视角一致。以皮层血管为参照对焦同步记录跑轮、行为视频及刺激。

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动物头部固定行为实验装置核心在于实现清醒、行为活跃状态下稳定、长期的神经记录或成像，同时通过受控的运动方式维持动物自然的感觉-运动交互。与自由活动范式不同，该方法通过固定头部来提供高分辨率神经技术（如双光子显微镜、电生理记录或宽场成像）所必需的机械稳定性，同时允许动物通过自由旋转的跑轮、气浮球面平台或线性轨道等方式主动参与行为任务。

关键设计原则：

1. 刚性头部固定：通过手术将定制头板牢固植入颅骨，再与实验平台上的夹具精确对接，确保在数小时乃至数周的实验中头部位移控制在微米级，满足光学或电生理记录对稳定性的严苛要求。

2. 自然运动保留：尽管头部被固定，大鼠仍可通过四肢驱动低惯性跑轮或在气浮球上行走，产生真实的本体感觉、触觉和运动输出，从而维持接近自然状态下的神经动力学（如运动调制、空间导航相关活动）。

3. 多模态行为整合：系统通常集成视觉/听觉刺激呈现、舔水奖励装置、触须刺激器、眼动追踪及全身视频监控，支持复杂感知-决策-动作闭环任务（如辨别任务、工作记忆或运动学习）。

4. 长期可重复性：借助标准化头架接口和跨日空间配准（例如使用校准标尺或血管图谱），可在同一动物、同一脑区进行连续数周至数月的纵向观测，适用于发育、学习、疾病进展或干预疗效研究。

总结

动物头部固定行为装置并非简单限制动物自由，而是一种平衡了实验精度与行为生态效度的先进神经科学平台，为在细胞或环路水平解析清醒大脑如何在主动行为中处理信息提供了强大工具。

文献引用：

  • Durand, S., Heller, G.R., Ramirez, T.K. et al. Acute head-fixed recordings in awake mice with multiple Neuropixels probes. Nat Protoc 18, 424–457 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-022-00768-6

  • Stuart, S.A., Palacios-Filardo, J., Domanski, A. et al. Hippocampal-dependent navigation in head-fixed mice using a floating real-world environment. Sci Rep 14, 14315 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-64807-w

  • Groblewski PA, Sullivan D, Lecoq J, de Vries SEJ, Caldejon S, L'Heureux Q, Keenan T, Roll K, Slaughterback C, Williford A, Farrell C. A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice. J Neurosci Methods. 2020 Dec 1;346:108922. doi: 10.1016/j.jneumeth.2020.108922. Epub 2020 Sep 15. PMID: 32946912.

  • Juczewski, K., Koussa, J.A., Kesner, A.J. et al. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Sci Rep 10, 12245 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-69132-6

  • Rebecca Jordan,Optimized protocol for in vivo whole-cell recordings in head-fixed, awake behaving mice,STAR Protocols,Volume 2, Issue 1,2021,100347,ISSN 2666-1667,https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100347.(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S266616672100054X)

  • Wienisch, M., Blauvelt, D.G., Sato, T.F., Murthy, V.N. (2011). Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. In: Fellin, T., Halassa, M. (eds) Neuronal Network Analysis. Neuromethods, vol 67. Humana Press. https://doi.org/10.1007/7657_2011_18

  • Goldey, G., Roumis, D., Glickfeld, L. et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc 9, 2515–2538 (2014). https://doi.org/10.1038/nprot.2014.165

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