J. Future Foods | 冷等离子体处理对花生蛋白免疫活性、结构和功能特性的影响|免疫|冷等离子体|活性|花生蛋白|荧光|蛋白质

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Introduction

花生作为一种重要的全球植物蛋白来源，富含多种生物活性物质和必需氨基酸，具有高持水性、持油性和乳化性，适于肉制品等食品开发，但同时也是主要食物过敏原之一，可引发从轻微胃肠道症状、皮肤反应到严重哮喘甚至过敏性休克等不同程度的免疫反应。近年来花生过敏的流行率和严重性显著上升，已成为全球公共卫生问题。

为降低花生过敏原性，当前主要采用热加工和非热加工技术。热加工方法（如煮沸、油炸和烘焙）可通过高温破坏蛋白结构以减少过敏原性，但可能影响食品感官特性，且烘焙甚至可能增加致敏性。非热加工技术（如高压处理、辐照和脉冲电场）虽有一定效果，但效果不稳定或需辅助处理，因此亟需寻找高效环保的新技术。冷等离子体（CP）作为一种新型非热加工技术，对食品风味影响小，且介质阻挡放电（DBD）等离子体具有适用气体和电极范围广、处理效果稳定、适应性强等优势。CP处理过程中产生的活性氧、活性氮及离子等可通过氧化作用引起蛋白质交联、聚集和断裂，改变蛋白结构，进而影响其性质和功能。已有研究证明CP可降低大豆、原肌球蛋白和乳蛋白等的致敏性。目前研究多集中于花生单一过敏原（如Ara h 1和Ara h 2），对花生粗提蛋白的综合研究较少。

本研究旨在探究CP处理过程中活性物质的氧化作用，分析CP对花生蛋白（PP）免疫反应性的影响并从结构变化角度解释机制，同时评估处理后蛋白功能性和营养特性的变化，以全面阐明CP对PP的影响。

Results

CP处理对PP化学性质的影响

如图1A所示，随着CP处理时间的增加，PP溶液中H2O2没有明显的积累。然而，与处理期的持续时间相对应的NO2–水平显著上升（图1B）。然而，在PP溶液中，CP处理后的pH值仅从最初的7.93±0.02略有下降到7.16±0.02（图1C）。随着处理时间的延长，羰基含量显著升高，其中CP25的含量最高（图1D）。此外，结果表明，CP处理导致总SH含量在处理25 min后呈下降趋势（图1E）。

A. H2O2；B. NO2–；C. pH值；D.羰基含量；E.总SH含量。不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）；下同。

图1不同CP处理时间对PP化学性质的影响

CP处理对PP免疫反应性的影响

如图2A所示，PP的所有条带的分子质量范围为11～70 kDa。与对照组相比，处理5、15 min后强度无明显变化。然而，将处理时间延长至25 min后，所有条带的强度均显著降低，尤其是Ara h 1（70 kDa）和Ara h 3（27 kDa）。同时，CP25凝胶中出现了一些新的低分子质量片段。蛋白质印迹法（WB）结果显示，CP25中Ara h 1和Ara h 3的条带强度显著降低（图2B）。斑点印迹的结果表明，随着处理时间的延长，PP过敏原的表达显著降低（图2D）。

A. SDS-PAGE；B. 蛋白质印迹法（WB）；C. 间接ELISA；D. 斑点杂交；E. 抑制性ELISA。

图2 不同CP处理时间的PP样本的免疫反应性分析

此外，通过利用间接和抑制ELISA探究了不同样品的IgG结合能力（图2C、E）。间接ELISA结果显示，CP处理后PP的IgG结合能力显著降低，相对于未处理的PP分别降低至11%、56%和69%。同样，CP处理样品的IgG结合能力表现出显著的下降。

CP处理对PP体外消化率的影响

如图3所示，SDS-PAGE分析显示，大部分花生过敏原在胃/肠消化后水解成低分子质量片段。此外，处理持续时间与花生过敏原水解速率之间呈正相关。然而，在胃消化过程中，在38 kDa附近出现了新的条带，并在消化60 min后表现出持续的稳定性。此外，结果表明，胰蛋白酶对PP的水解效果优于胃蛋白酶。

A. SGF消解过程；B.SIF消化过程。

图3 不同CP处理时间下PP样品体外静态胃/肠消化

在整个胃肠道消化过程中，所有组的游离氨基浓度逐渐增加（表1）。胃/肠消化60 min后，与其他组相比，CP25组的游离氨基水平明显降低。

表1 不同CP处理时间PP样品体外酶解过程中游离氨基含量的变化

此外，对消化的样品进行了间接ELISA，发现随着消化时间的增加，PP的IgG结合能力逐渐下降（表2）。

表2 不同CP处理时间的PP样品在体外酶切过程中免疫原性的变化

CP处理对PP结构性能的影响

如图4A所示，与对照组相比，用CP处理的样品的粒径明显增加。CP25的粒径是对照组的2.26 倍。此外，SEM结果表明，未经处理的PP表现出平面且相对光滑的结构，而蛋白质表面随着CP处理时间的延长而发生粗糙和聚集（图5）。

A.粒径；B. CD光谱；C.二级结构相对含量；D.紫外光谱；E.本征荧光光谱；F.外在荧光光谱。

图4 不同CP处理时间的PP样品结构性能

A.对照组；B. CP5；C. CP15；D. CP25。

图5 不同CP处理时间的PP样品的SEM图像

由图4B可知，PP在208 nm的波长处显示出明显的负峰（

-螺旋结构的典型特征峰）。与未处理的PP相比，各组的峰值强度分别下降了19.9%、49.5%和57.5%，表明PP的二级结构被破坏。 CDNN分析结果表明，未经处理的PP表现出有序结构含量，包括18.97%

-螺旋和31.8%

-折叠，以及无序结构含量，包括16.67%

-折叠和32.48%无规卷曲（图4C）。CP处理后，

-螺旋下降2.32%，无规卷曲下降1.54%，

-折叠相应增加4.12%。相反，在

-转角中没有观察到明显改变。

由图4D可知，PP的最大紫外吸光度峰在276 nm处观察到，对应于Trp和Tyr。不同处理持续时间组的吸收强度逐渐增加。图4E显示了不同处理条件下PP荧光强度的变化。CP处理5、15、25 min后，荧光强度分别降低19.8%、50.8%、73.4%。

由图4F可知，CP25表现出最高的表面疏水性，是对照组的33.8 倍。随后，CP15的表面疏水性比对照组高出约16 倍。相反，CP5表现出与对照组相当的表面疏水性。此外，观察到CP15和CP25都表现出明显蓝移。

CP处理对PP功能性能的影响

如图6A所示，对照的溶解度为82.51%，而CP5的溶解度为76.94%（

P

>0.05）。 CP15和CP25的溶解度显著下降至55.89%和55.10%。由图6B、C可知，CP处理15 min后，PP的EAI显著上升；随着处理时间延长至25 min，EAI下降至与对照组相似水平。与对照组相比，所有CP处理组的ESI值均显著降低（

P

<0.05）。

A.溶解度；B.EAI；C.ESI；D.发泡特性；E.泡沫稳定性；F.氨基酸含量。

图6 不同CP处理时间下PP样品的功能特性

CP处理显著改善了PP的发泡特性和泡沫稳定性。与其他组相比，CP25表现出较好的发泡特性（213%），对照组仅为152%；此外，CP15表现出更高的泡沫稳定性（98%）（图6D、E）。特性变化可能与蛋白质结构的变化有关（图7）。由图6F可知，短暂暴露于CP（5 min）会导致PP氨基酸水平升高（

P

<0.05），而延长处理时间会导致营养流失。

图7 CP处理对PP的影响

Conclusion

本研究探究了CP对PP免疫反应性、结构和功能特性的影响。结果表明，CP处理25 min对降低PP免疫反应性效果最高，同时，该处理时间也适度增强了PP的体外消化率和发泡性能。在CP过程中，产生了大量的具有强氧化性质的NO2-。这些离子对氨基酸侧链发挥氧化作用，导致羰基和硫化合物的形成。这种生化转化表明PP构象存在潜在的改变。对PP结构的研究表明，CP处理的应用可能会破坏维持PP二级结构完整性的氢键，并暴露以前隐藏在蛋白质内部的疏水基团。因此，这引发了一系列事件，包括蛋白质展开、交联和聚集，最终影响了PP的结构稳定性。这些结构修饰促进了PP内过敏表位和消化位点的暴露，从而降低了IgG结合能力并提高了消化率。此外，这种结构转变增强了蛋白质在空气-水界面的吸附能力，增强了其发泡性能，从而提高了其实际适用性。然而，值得注意的是，过度的CP处理可能会损害蛋白质功能和营养属性。此外，不同长寿命反应物质所发挥作用的确切机制尚未得到全面研究。因此，未来的努力应侧重于进行更多研究，以确定最佳的CP处理方法，以最大限度地减少蛋白质致敏，同时增强其功能特征和营养价值。

Effect of cold plasma processing on the immunoreactivity, structure and functional properties of peanut protein

Yuxin Wanga1, Jialu Shia1, Jing Qiana, Jinlong Zhaoa, Lili Zhanga, Vijaya Raghavanb, Jin Wanga*

a

Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China

b

Department of Bioresource Engineering, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, McGill University, 21111 Lakeshore Rd, Sainte-Anne-de-Bellevue, H9 × 3V9, QC, Canada

1these authors have equal contribution

*Corresponding authors.

Abstract

Peanuts are one of the most important food allergens globally. To reduce the risk of allergies, peanuts were treated with cold plasma (CP) for varying durations. The impact of CP on the immunoreactivity, structure, and functional properties of peanut protein (PP) was investigated, aiming to comprehensively evaluate the influence of CP on PP. The results showed that following a 25-min CP treatment, the immunoreactivity of PP decreased by 69%, with improved digestibility.

The analysis of the secondary structure demonstrated a reduction of 2.32% in α-helix and 1.54% in random coil, accompanied by an increase of 4.12% in β-sheet. This result indicated the disruption of the secondary structure in protein. Furthermore, the decrease in the intensity of intrinsic fluorescence, coupled with the rise in UV and extrinsic fluorescence, represented the fluorescence quenching of Trp and the exposure of hydrophobic groups. These alterations in structure, caused by the oxidation of CP, were postulated as potential contributors to the diminished immunoreactivity of PP. In addition, these structural modifications could augment the degree of adsorption at the air-water interface, resulting in a notable enhancement in the foaming capability of PP (from 152% to 213%).

Reference:

WANG Y X, SHI J L, QIAN J, et al. Effect of cold plasma processing on the immunoreactivity, structure and functional properties of peanut protein[J]. Journal of Future Foods, 2026, 6(2): 232-243. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.09.004.