Cell | 消除“场效应”的膀胱癌尿液液体活检|治疗|活检|特异性|病灶|肿瘤|膀胱癌

撰文 |章台柳

非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）是一种高度异质性的疾病，即使具有相似的临床和病理特征，不同NMIBC肿瘤对治疗的反应也可能存在显著差异。根据肿瘤分级、分期、大小以及是否伴有原位癌（CIS）等因素，NMIBC可分为低危、中危和高危组。所有风险组均接受经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）治疗，中危和高危患者还需接受为期6周的诱导期膀胱内灌注卡介苗（BCG）免疫治疗（联用或不联用后续的BCG维持治疗）。虽然这种疗法已经应用多年，且尚无疗法能够超越该方案的疗效，但对NMIBC中BCG应答的生物学机制理解尚不完全。

目前临床上缺乏能够准确识别哪些患者能从BCG中获益的生物标志物。既往研究主要集中于寻找生物标志物来区分接受TURBT+BCG疗法的患者是否会复发。这一终点存在局限性，因为未复发的患者可能仅通过TURBT或仅通过BCG就已治愈，而两者相关的分子很可能不同。事实上，对比单独TURBT和TURBT+BCG联用的随机试验中，约2/3的NMIBC患者可能仅通过手术即可治愈，因此只有少数长期应答者是因联用BCG而治愈的。这一挑战并非NMIBC独有，也影响许多其他接受序贯治疗的癌症类型。

尿液生物标志物有望用于膀胱癌（BLCA）复发的无创评估。然而，现有的尿液生物标志物在早期评估疾病复发方面缺乏最佳性能。一种可能具有前景的方法是检测肿瘤脱落至尿液中的DNA。尿液肿瘤DNA（utDNA）分析可用于在完成NMIBC治疗后检测微小残留病灶（MRD），并据此指导个体化辅助治疗。然而，基于utDNA的MRD检测面临的一个潜在复杂因素是，在显微镜下形态正常的尿路上皮中存在体细胞突变，这种现象被称为“区域癌化”或“场效应”。这类突变可能脱落至尿液中，导致MRD结果假阳性，从而引发不必要的焦虑、检查和治疗。场效应并非NMIBC独有，已在包括但不限于乳腺癌、肺癌、头颈癌、结直肠癌和食管癌在内的其他癌症类型中得到充分记录，同样可能降低液体活检MRD方法的特异性。因此，用于癌症检测和监测的液体活检方法需要解决场效应可能引起的特异性问题。

2026年1月27日，来自斯坦福大学的Maximilian Diehn、Joseph C. Liao和Ash A. Alizadeh团队合作在Cell杂志上发表文章Field-effect-informed urine liquid biopsy for bladder cancer，发现尿液中体细胞突变的检出率随年龄增长而增加。提出了一种改进的utDNA微小残留病灶（MRD）检测方法，并排除场效应突变来提高其特异性。将其应用于261例接受手术及术后BCG辅助治疗的NMIBC患者样本，识别出三类分子反应群体：手术应答者、BCG应答者以及无应答者。对两种治疗方案的分子预测因素存在差异：预先存在的免疫激活和更高的突变负荷在BCG应答者中富集，而不是手术应答者。这些发现凸显了基于场效应校正的液体活检方法在指导个体化治疗以及揭示多模式治疗中各环节生物标志物方面的潜力。

研究团队之前开发了一种尿液癌症深度测序个性化分析（uCAPP-seq）的方法。这种基于新一代测序的液体活检方法使用一个固定的靶向数百个膀胱癌常见突变基因的生物素化寡核苷酸探针组，分析尿液游离DNA中是否存在体细胞突变。它既可用于无肿瘤先验信息（即直接分析尿液）的分析，也可用于基于肿瘤信息（即先对诊断样本进行测序以识别肿瘤突变，然后在后续尿液样本中追踪这些突变）的分析。研究人员使用uCAPP-seq技术分析了不同年龄段非癌症对照尿液样本中的游离DNA。值得注意的是，推测的致癌突变频率随着年龄急剧增加，在75岁以上个体的检出率可达～20%。这一发现与先前在无血液系统恶性肿瘤的患者中观察到的血细胞体细胞突变随年龄积累（称为克隆性造血）的现象相似。为进一步探究正常尿路上皮中体细胞突变对utDNA MRD检测的潜在影响，研究人员在一项包含51例既往入组BLCA患者的队列中，检测了BLCA肿瘤中的体细胞突变在癌旁正常组织中出现的频率。其中16例（31%）患者的所有肿瘤突变均存在于癌旁正常样本中，这可能是肿瘤污染或场效应突变与肿瘤突变高度重叠所致。然而，在25例（49%）患者中，仅部分肿瘤突变存在于癌旁正常组织，这种模式与肿瘤污染不符，而是正常细胞中存在包含部分肿瘤体细胞突变的现象。因此，场效应突变在早期BLCA中普遍存在，是utDNA MRD分析中一个潜在的干扰因素。

为应对场效应对MRD监测特异性可能带来的负面影响，研究人员开发了RePhyNERX，它采用一个计算框架来“精炼”肿瘤的突变谱，即排除那些在癌旁尿路上皮中也存在的突变，只保留肿瘤特有的突变。如果没有癌旁正常组织样本，则使用术后尿液样本来模拟正常尿路上皮细胞的DNA背景。在一个包含22名患者的训练队列中优化RePhyNERX算法并发现基于尿液的 RePhyNERX 算法显著提高了 MRD 检测的特异性。随后将RePhyNERX算法应用到一个前瞻性入组、接受BCG诱导治疗的中高危NMIBC患者的独立验证队列。共入组61名NMIBC患者，并在 TURBT 手术时收集肿瘤组织和癌旁正常组织，并在 TURBT 前、BCG 诱导治疗前及治疗期间的不同时间点收集系列尿液样本（TURBT 至 BCG 前的中位间隔为 1.6 个月，范围 1–8 个月；BCG 诱导开始后的第一个可用监测时间点的中位时间为 TURBT 后 4.4 个月，范围 2–10 个月）。中位随访时间为 22 个月，其中 21 名患者（34%）经历了高级别复发。当有可用肿瘤组织时（占 85% 的病例），通过对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织进行测序来识别肿瘤突变；在没有可用肿瘤组织的病例中，则通过分析 TURBT 前的尿液样本应用肿瘤全景方法鉴定肿瘤突变。所有后续的 MRD 分析均使用 RePhyNERX 算法。利用uCAPP-seq技术，在不同时间点（治疗前、BCG诱导期间及BCG诱导结束后）定量检测了utDNA浓度，并分析了其与预后的关联。在TURBT前的样本中和BCG诱导治疗前采集的样本中，高utDNA浓度与高级别无复发生存期（HG-RFS）缩短的趋势相关，但未达到统计学显著性。而BCG诱导治疗后（n = 61）可检测的utDNA浓度与HG-RFS显著相关。随后分析TURBT前、BCG诱导前及BCG诱导后utDNA浓度的分布情况。在TURBT前，复发与未复发患者的中位utDNA浓度无显著差异。然而，在BCG治疗前，复发患者的utDNA浓度明显更高。同样，BCG治疗后的utDNA浓度在复发患者中更高，而在无复发患者中较低。因此，utDNA浓度与复发风险的关联强度随着治疗进程逐渐增强。无论肿瘤突变是通过组织还是尿液样本识别，这种基于utDNA的结果分层均保持一致。

通过utDNA分析鉴定出3种主要的分子应答类型：（1）对TURBT手术完全应答：患者在TURBT后utDNA转为阴性（占39.3%）；（2）对BCG应答：患者在TURBT后utDNA仍为阳性，但在BCG诱导治疗后utDNA的下降超过4倍（占27.9%），（3）对BCG无应答：患者的utDNA上升或降幅小于4倍（占32.8%）。在对经尿道切除术（TURBT）产生分子反应的 24 例患者中，有 3 例（12.5%）出现复发；对卡介苗（BCG）产生反应的患者中无复发（0%）；而对卡介苗无 utDNA 反应的 20 例患者中，有 18 例（90%）出现复发。基于这三种分子反应类别进行分层的 Kaplan-Meier 分析表明，与对卡介苗无反应的患者相比，对经尿道切除术产生完全反应或对卡介苗产生反应的患者，其复发风险显著更低。此外，在各个 T 分期亚组中，分子反应均与无高级别复发生存期（HGRFS）相关。这些结果表明，卡介苗诱导治疗前后的 utDNA 监测可用于识别复发风险。

最后，研究人员比较了治疗开始前从同一组膀胱癌（BLCA）患者同时采集的尿液和血浆样本中，源自膀胱癌的 cfDNA 浓度。在非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）中，在100%（10/10）的尿液样本中检测到了肿瘤源性DNA，而在血浆样本中这一比例为0%（0/10）。相比之下，在肌层浸润性膀胱癌（MIBC）中，在100%（6/6）的尿液样本中检测到了肿瘤源性DNA，而在血浆样本中为 50%（3/6）。这些结果表明，无论是在非肌层浸润性膀胱癌还是肌层浸润性膀胱癌中，尿液中的膀胱癌 DNA 浓度均高于血浆。