2篇Science+1篇Nat Metab | NUDT5非酶活性调控核苷酸代谢的分子机制|叶酸|复合物|核苷酸|活性|细胞|蛋白

撰文丨存中一贯

叶酸（ Folate ）代谢提供的一碳单元是许多代谢物生物合成的基础，比如嘌呤、胸苷酸、甲硫氨酸等【1】。基因突变或叶酸摄入不足引起的叶酸代谢受损常导致发育缺陷和肿瘤风险增加等病理变化【2-3】。肿瘤治疗领域，一些抗叶酸剂如甲氨蝶呤（ Methotrexate ）也常被用于抑制肿瘤增殖。

叶酸代谢通路主要发生在细胞质和线粒体，部分酶也在细胞核中发挥额外功能。一些关键酶的突变会导致线粒体叶酸产生和细胞质叶酸利用之间平衡的逆转。另外，下游信号通路抑制常常会导致叶酸被转化为一些特定的衍生物（ “Folate trapping” ）进而引起叶酸缺乏，如维生素 B12 缺乏时形成5-甲基四氢叶酸（5-MeTHF），MTHFD1受抑制后形成10-甲酰四氢叶酸（10-CHO-THF）【4-5】。

MTHFD1是一种三功酶，分别通过三个催化酶结构域（甲酰四氢叶酸合成酶， S; 亚甲基四氢叶酸脱氢酶以及环化水解酶， DC ）催化 10-CHO-THF 、亚甲酰四氢叶酸（CH+-THF）和亚甲基四氢叶酸（CH2-THF）在细胞质中的转换。在 MTHFD1 的反应产物中， CH2-THF 为甲硫氨酸和胸苷酸的合成提供一碳单元，而 10-CHO-THF 则在嘌呤的从头合成途径中为嘌呤骨架提供 2 个碳原子。 MTHFD1 与嘌呤小体（ purinosome ）之间的直接相互作用可能促进了这一过程的进行【6】。在酵母和人类细胞中敲除 MTHFD1 会导致嘌呤营养缺陷，可能是源于对嘌呤从头合成途径的抑制作用。不过，在 DC 结构域点突变导致 MTHFD1 缺陷病人的细胞中，嘌呤从头合成并未受到影响，而胸苷酸和甲硫氨酸合成受损。这说明 MTHFD1 的作用机制比较复杂，并不仅限于其酶活性功能。

近日，来自奥地利科学院 CeMM 分子医学研究中心的Stefan Kubicek团队与牛津大学Kilian V. M. Huber团队合作在 Science 杂志发表了他们最新的研究成果，题目是

A non-enzymatic role of

Nudix

hydrolase 5 in repressing purine de novo

synthesis

，他们从 MTHFD1 敲除以及酶功能结构域缺陷引起嘌呤合成的异常出发，鉴定了嘌呤合成的一个新的调控因子 NUDT5 ，并阐释了其不依赖于其酶活性、仅作为支架蛋白所发挥的对嘌呤从头合成的调控机制。

研究人员在 HAP1 细胞系中分别构建了 MTHFD1 基因的敲除细胞系 MTHFD1 KO 以及两个酶活性中心的失活突变细胞系 MTHFD1 K386E （ S 区域）和 MTHFD1 K56R （ DC 区域），之后通过标准培养基以及去除 10 kDa 以下小分子代谢物的缺陷培养基培养相应细胞，检测细胞的增殖。 MTHFD1 KO 和 MTHFD1 K386E 细胞系表现出了对缺陷培养基的敏感性，细胞增殖能力减弱，而野生细胞系以及 MTHFD1 K56R 则对缺陷培养基不敏感，细胞增殖不受影响。为了探究哪些化合物影响了 MTHFD1 KO 细胞的增殖，研究人员对一个含有 90000 种化合物的小分子库进行了大规模筛选，发现含嘌呤的化合物，如 flavin adenine dinucleotide (FAD) 、 S-adenosylmethionine (SAM) 、 adenosine monophosphate (AMP) 等能够拯救 MTHFD1 KO 细胞的增殖抑制。不过，外源添加 adenosine (Ado) 在 MTHFD1 K56R 细胞系中引起了增殖抑制，而补充胸苷（ thymidine ）、三磷酸脱氧胸苷（ deoxythymidine triphosphate, dTTP ）或者 AICAR （ 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide ）则能够逆转 Ado 对 MTHFD1 K56R 细胞增殖的抑制作用。进一步分析显示， Ado 添加能够减轻 MTHFD1 KO 和 MTHFD1 K386E 细胞的 G1-S 期停滞，而增强 MTHFD1 K56R 细胞在 G1-S 期的停滞。正常情况下， 10-CHO-THF 能够通过叶酸循环或者嘌呤从头合成转化为 THF ，但是如果同时抑制这两个通路，比如通过 MTHFD1 蛋白的 DC 结构域突变抑制叶酸循环，通过外源添加 Ado 抑制嘌呤的从头合成，那么就会导致 10-CHO-THF 在细胞内的积累，实现一种叶酸 “trapping” ，并引起 DNA 损伤和细胞凋亡。

进一步，研究人员通过 CRISPR/Cas9 进行全基因组筛选，鉴定此 folate-trap 模型中的关键基因，并筛选到 3 个调控基因： MTHFD1 、 HPRT1 和 NUDT5 。其中， HPRT1 是嘌呤再利用途径（ purine salvage pathway ）中的关键酶， MTHFD1 K56R HPRT1 KO 细胞中，额外添加 Ado 不再引起 DNA 损伤和细胞周期停滞。而 MTHFD1 K56R NUDT5 KO 细胞则在嘌呤富集的培养基中抑制了 DNA 损伤信号以及异常细胞周期信号，并促进增殖。

研究人员通过同位素标记发现， NUDT5 敲除不影响细胞中嘌呤再利用，相反，抑制了嘌呤从头合成。NUDT5对嘌呤从头合成的调控作用不依赖于其酶活性，反而依赖其作为支架蛋白的功能。研究人员进一步通过蛋白组学鉴定了 NUDT5 的相互作用蛋白，发现 PPAT 与 NUDT5 的相互作用在抑制嘌呤从头合成中发挥了关键功能。而且，这一相互作用调控了细胞对嘌呤类似物的敏感性。总之，本研究鉴定了叶酸-嘌呤代谢途径中一个关键的调控因子NUDT5，并解析了其非酶活性调控嘌呤从头合成的分子机制，为相关药物的开发和利用提供了理论基础。

同期， Science 杂志还背靠背发表了来自美国德克萨斯大学西南医学中心 Ralph J DeBerardinis 团队的最新工作，他们同样在嘌呤代谢调控中做出了不同但类似的研究结果，他们的题目是

NUDT5 regulates purine metabolism and thiopurine sensitivity by interacting with PPAT

，他们直接从细胞中嘌呤从头合成（ de novo purine biosynthesis,DNPB）与嘌呤再利用之间的平衡入手，鉴定了一个新的调控基因 NUDT5 ，它在嘌呤稳态调控方面发挥了重要作用。

本研究中，科研人员从 6- 硫鸟嘌呤（ 6-thioguanine, 6-TG ）代谢敏感性出发，通过 CRISPR 全基因组筛选鉴定 6-TG 处理敏感的关键基因。筛选结果中除了 HPRT1 （ hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase-1 ）之外， NUDT5 也显示与 6-TG 代谢密切相关。 NUDT5 能够水解 ADPR 并产生 5- 磷酸 - 核糖（ R5P ）， R5P 是 HPRT1 底物 PRPP 的前体物质，因此， NUDT5 可能通过促进嘌呤再利用而发挥对细胞的毒性作用。进一步的蛋白组学、流式细胞分析以及 western 显示， 6-TG 处理在 WT 细胞中诱导细胞凋亡，而当 NUDT5 敲除后，细胞凋亡减弱。另外，研究人员通过突变拯救实验发现， NUDT5 的催化功能与其对细胞凋亡的诱导作用之间并无关系。同时，在 6-TG 处理的细胞中，一些线粒体代谢途径被抑制，而且这种抑制依赖于 NUDT5 的作用。研究人员还通过同位素示踪实验发现， NUDT5 介导 6-TG 作用的通路与 HPRT1 是不同的。 6-TG 介导的 DNA 损伤以及对 DNPB 的抑制也需要 NUDT5 的功能。

后续实验中，研究人员通过蛋白相互作用也鉴定到了 NUDT5 的关键相互作用蛋白是 PPAT ，二者的相互作用抑制了 PPAT 的酶活性，促进了 PPAT 的寡聚化。进一步的实验表明， NUDT5 结合 PPAT 后刺激了嘌呤小体的解聚，负调控了嘌呤小体的形成。打断 PPAT-NUDT5 的相互作用能够提高细胞对 6-TG 的抗性。

另外，来自瑞士洛桑大学的Alexis A. Jourdain带领团队在 Nature Metabolism 杂志以

Uridine-sensitized screening identifies dimethoxy-coenzyme Q and NUDT5 as regulators of nucleotide synthesis

为题同样对嘧啶和嘌呤代谢关键酶进行了详细研究，通过 CRISPR 全基因组筛选，本研究发现辅酶 Q （ CoQ ）前体 DMQ 可作为嘧啶合成的替代电子受体， CoQ 对嘧啶合成并非必需，同时表明在 COQ7 缺失导致的 DMQ 积累虽不能支持线粒体复合物 I–II 介导的呼吸，但可以功能性替代 CoQ ，有效支持从 DHODH 到复合物 III 的电子传递，从而驱动嘧啶合成。

另外 NUDT5 在核苷酸代谢中发挥重要作用，其通过与嘌呤合成的第一个酶，也是限速酶 PPAT 相互作用，抑制了 PPAT 的活性，防止 PRPP 被过度用于嘌呤合成，从而为嘧啶合成保留足够的 PRPP 资源，维持核苷酸平衡。当 PRPP 水平升高时， PRPP 作为变构信号解离 NUDT5-PPAT 复合物，允许嘌呤合成以利用多余的 PRPP 。在 NUDT5 缺失的情况下， PPAT 失控性活化，耗尽 PRPP 用于嘌呤合成，导致嘧啶合成受阻和核苷酸失衡。这种 PRPP 的耗竭也使得依赖 PRPP 激活的核苷碱基类似物无法发挥作用，导致耐药。本研究首次揭示了 NUDT5 作为一个非催化性的、变构调控蛋白在维持核苷酸平衡中的核心作用。阐明了嘌呤与嘧啶合成之间通过竞争 PRPP 实现交叉调控的一个精细分子机制。

上述 3 篇文章共同解析了NUDT5通过其非酶催化活性、和PPAT的相互作用共同调控的嘧啶、嘌呤代谢平衡机制，为肿瘤、自免疾病等治疗提供了新的思路和基础。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adv4257

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adx9717

https://doi.org/10.1038/s42255-025-01419-2

制版人：十一

参考文献

1. G. S. Ducker, J. D. Rabinowitz, One-Carbon Metabolism in Health and Disease. Cell Metab . 25, 27–42 (2017).

2. P. Burda, A. Kuster, O. Hjalmarson, T. Suormala , C. Bürer , S. Lutz, G. Roussey, L.Christa , J. Asin- Cayuela , G. Kollberg, B. A. Andersson, D. Watkins, D. S. Rosenblatt, B. Fowler, E. Holme, D. S. Froese, M. R. Baumgartner, Characterization and review of MTHFD1 deficiency: Four new patients, cellular delineation and response to folic and folinic acid treatment. J. Inherit. Metab . Dis .38, 863–872 (2015).

3. H. Fu, J. Zeng, C. Liu, Y. Gu, Y. Zou, H. Chang, Folate Intake and Risk of Pancreatic Cancer: A Systematic Review and Updated Meta-Analysis of Epidemiological Studies. Dig. Dis. Sci. 66, 2368–2379 (2021).

4. B. Shane, E. L. Stokstad, Vitamin B12-folate inter relationships. Annu. Rev. Nutr . 5,115–141 (1985) .

5. A. C. Green, P. Marttila, N. Kiweler , C. Chalkiadaki , E. Wiita, V. Cookson, A. Lesur,K . Eiden, F. Bernardin, K. S. A. Vallin, S. Borhade , M. Long, E. K. Ghahe , J. J.Jiménez -Alonso, A.-S. Jemth , O. Loseva, O. Mortusewicz, M. Meyers, E. Viry , A. I.Johansson , O. Hodek, E. Homan, N. Bonagas , L. Ramos, L. Sandberg, M. Frödin , E.Moussay , A. Slipicevic , E. Letellier, J. Paggetti, C. S. Sørensen, T. Helleday , M.Henriksson , J. Meiser, Formate overflow drives toxic folate trapping in MTHFD1inhibited cancer cells. Nat. Metab . 5, 642–659 (2023) .

6. J. He, L. N. Zou, V. Pareek, S. J. Benkovic, Multienzyme interactions of the de novo purine biosynthetic protein PAICS facilitate purinosome formation and metabolic channeling. J. Biol. Chem. 298, 101853 (2022).

学术合作组织

（*排名不分先后）