泛素（Ubiquitin）及类泛素（Ubiquitin-like，UBL）蛋白介导的翻译后修饰，是调控细胞生命活动的核心分子机制之一。 犹素 UFM1 （ U biquitin F old M odifier 1 ）作为UBL家族的 一员 ，拥有与泛素及其他类泛素蛋白相似的三维结构、折叠模式及酶促反应特征，其介导的翻译后修饰被称为 犹素化修饰 （ UFMylation ）。犹素化修饰的发生依赖于UBA5–UFC1–UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3构成的E1–E2–E3级联反应， 将 UFM1共价连接 至 底物蛋白 的赖氨酸残基上，而这一修饰可被犹素化修饰特异性蛋白酶UFSP1/2可逆性去除 （ de- UFMylation ） 。作为翻译后修饰，犹素化修饰的生物学功能依赖于对底物蛋白的调控得以实现 。犹素化 修饰 的 失调与 肿瘤 发生、发育缺陷等多种疾病密切相关，是近年来分子生物学领域的研究热点之一。
然而，犹素化修饰的功能机制研究长期受限于一个关键瓶颈：已鉴定并开展功能 研究 的底物蛋白数量极少。目前，已明确的犹素化修饰底物不足30个，远 少于 泛素化、SUMO化等类泛素修饰系统。这一困境的形成主要源于 两个因素 ：一是核糖体蛋白RPL26 是 细胞内最主要的底物，高丰度的RPL26 - UFM1缀合物 显著 干扰 相对 低丰度底物的检测；二是缺乏高效、特异的底物鉴定方法，难以捕捉到低丰度且动态变化的修饰底物。
为破解这一研究瓶颈，推动犹素化修饰领域的发展，近日，杭州师范大学丛羽生教授团队梁千博士与杭州微米生物合作（第一作者为硕士研究生方瑶瑶）在 Journal of Biological Chemistry 杂志在线发表了题为 Optimization of protein UFMylation modification method and its application in substrate identification in human cells 的研究论文， 通过创新技术体系构建与优化，成功实现了犹素化修饰底物的大规模、高特异性鉴定，为该领域研究开辟了新路径。
早在2022年 ，丛羽生教授团队发现：人源UFSP1可通过上游 “ 近同源启动子（CUG） ” 起始翻译，其产物是具有完整催化活性和底物特异性的犹素化修饰蛋白酶，相关成果还入选了 Journal of Biological Chemistry 期刊的 Editors' Picks （jbc.2022.102016）。基于这一发现，团队进一步探索，成功构建了 犹素化 修饰完全阻断的UFSP1/UFSP2双基因敲除（ UFSP1 KO /UFSP2 KO , DKO）人源HEK293T细胞株。 该 DKO细胞模型的优势十分显著：在细胞中，UFM1前体（85 aa ）无法被加工为成熟的UFM1∆C2（83 aa ），导致内源性犹素化修饰完全阻断；而当向该细胞中外源转入活化型UFM1∆C2后，细胞内原本完整的E1–E2–E3级联酶系可正常催化犹素化修饰发生，同时由于缺乏UFSP1/2蛋白酶的去修饰作用， 底物 - UFM1缀合物 能够大量积累，有效解决了低丰度底物信号被掩盖的难题，为后续底物鉴定提供了理想的实验模型。
团队以三种已知底物 （ ASC1、RPL26、p53 ） 为对象 ，对比验证了该细胞模型的高效性 证实双敲除细胞为最优模型 。 随后通过 单因素实验 明确UFL1和DDRGK1为核心调控因子， 优化外源 转染体系并提升实验效率。 然后， 依托该优化体系，团队联合杭州微米生物 （提供 K-ε-GV特异性抗体与LC-MS/MS技术 支持） ，成功鉴定出 超 600个犹素化 修饰 底物，远超既往研究总和，破解底物稀缺瓶颈。
犹素化修饰底物鉴定策略图（方瑶瑶、梁千绘制）
团队通过已知底物比对、新底物实验验证双重手段，充分佐证了鉴定数据的可靠性。此外，研究还对修饰肽段的基序特征开展了系统分析，为后续犹素化位点预测工具的开发提供了理论基础；亚细胞定位与功能注释结果显示，新鉴定的底物主要分布于细胞质和细胞膜，广泛参与蛋白质翻译、核糖体合成等关键细胞通路，为深入探究犹素化修饰的生物学功能指明了方向。 综上， 该研究建立了一种更加高效、特异且可靠的UFMylation底物研究策略，为深入解析UFMylation的生物学功能及其调控机制提供了有力支撑。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2026.111320
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