蛋白质与DNA的相互作用是DNA复制、转录、重组与修复等关键核内生命过程得以实现的分子基础。针对蛋白质–DNA相互作用的传统研究方法存在局限性。体外实验如electrophoretic mobility shift assay (EMSA)作为检测蛋白质–DNA互作的常规方法，操作简便、快速高效，但多采用体外重组蛋白，难以完整保留蛋白质天然的翻译后修饰与空间结构；而体内实验如chromatin immunoprecipitation (ChIP)虽能还原细胞内蛋白质真实生理状态，但耗时长、步骤复杂、对抗体与实验条件要求严格。因此，亟需发展兼具操作简便与保留蛋白质天然状态的检测方法。
近日，Journal of Genetics and Genomics在线发表东北林业大学/沈阳农业大学王玉成教授团队题为“Plant-based native electrophoretic shift immunoassay (PN-ESI) enables semi-in-vivo detection of native protein-DNA interactions”的研究论文。该研究开发的基于植物的非变性凝胶迁移免疫分析技术(PN‑ESI)，兼具保留植物体内蛋白质真实生理状态与体外生化检测操作简便、流程高效的双重优势，在近生理状态下实现了蛋白质–DNA相互作用的精准、高效检测。
该研究首先在植物体内瞬时表达带标签的目标蛋白，提取含目标蛋白的细胞核提取物后，与无标记的目标DNA片段进行体外结合反应，再经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过免疫印迹完成蛋白质–DNA复合物的特异性检测。在总核蛋白用量、DNA探针及其用量相同的条件下，PN-ESI的检测灵敏度较传统EMSA提升至少10倍，且检测结果与ChIP相互印证。随后，利用PN-ESI进一步检测了预测的蛋白质(转录因子PdbSCL1和BpTCP20)与DNA的相互作用，同时进行了EMSA验证。鉴于PN-ESI直接采用细胞核内的天然功能状态的蛋白质，可最大程度保留磷酸化、乙酰化等关键翻译后修饰状态，为解析翻译后修饰对蛋白质–DNA相互作用的调控效应提供了可靠技术支撑。
基于植物的非变性凝胶迁移免疫分析技术(PN-ESI)流程及检测应用
综上所述，该研究建立了一套快速、灵敏、可忠实反映蛋白质天然功能状态的半体内检测技术体系PN-ESI。该技术与EMSA和ChIP互为补充，可在近生理条件下解析蛋白质–DNA相互作用。
作者简介
东北林业大学林木遗传育种全国重点实验室博士后王鹏宇为该论文第一作者，东北林业大学/沈阳农业大学王玉成教授为通讯作者。相关工作得到国家自然科学基金资助。
热门跟贴