Nat Commun | 刘志红团队通过序贯测序剖解Alport综合征基因变异致病密码|刘志红|基因变异|基因诊断|序贯测序|显子|表型

Alport综合征（AS）是由编码IV型胶原 α 3、 α 4或 α 5链的基因（COL4A3/4/5）突变所引起的遗传性疾病。临床表现为血尿、蛋白尿，可出现进行性肾功能衰竭，常伴耳聋和眼部病变。在精准医学时代，基因诊断是AS诊疗的“金标准”。尽管二代测序技术已普及，然而，临床常用的全外显子组测序（WES）等检测手段对于隐藏在基因组“边缘”或“背景”中的复杂变异，如深部内含子变异、复杂结构变异等，往往无能为力，这导致约15%-45%的临床诊断为AS患者在目前常规基因检测后依然拿不到确切结论，处于“遗传诊断不明”的灰色地带，延误患者的精准诊疗。

2026年3月23日，东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心刘志红院士团队与浙江大学医学院良渚实验室龚亮研究员团队在Nature Communications发表题为Sequential sequencing reveals the architecture and complexity of genomic variants in patients with Alport syndrome的重要研究成果。他们通过一种创新的“序贯式测序策略”，将中国AS队列的遗传诊断率提升至91.7%，并首次揭露了多种复杂变异和解析了中国AS患者特有的遗传特征。研究结果在拓展AS基因变异谱系认知，建立更加精准的AS基因诊断体系的同时，为遗传性疾病的遗传分析研究和临床遗传诊断实践提供了新范式。

序贯式测序让“隐性变异”无处遁形

研究团队对555名经肾活检确诊的中国AS患者构建了一个严密的 “序贯式测序策略”。这套策略通过多层级递进设计，系统揭示AS的遗传变异全景。研究团队首先通过WES，锁定了87.6%患者的编码区变异和侧翼非编码区变异；在此基础上扩大搜索，针对WES阴性者，利用全基因组测序（WGS）搜寻深部非编码区（内含子）变异及拷贝数变异（CNV）；同时，对WGS阴性患者开展RNA测序，直接筛查异常剪接事件，再反向结合WGS数据定位致病性非编码区变异，有效提升非编码区变异的检测敏感性。最后，针对极其复杂的染色体结构重排，启用三代纳米孔长读长测序（NLR-seq）技术，实现复杂结构变异的精准解析与破译。在这套组合拳下，研究团队在509名患者中发现了431个独特变异（图1），总体检测率高达91.7%！其中，42.2%的变异为全球首次发现。这不仅验证了“序贯式测序策略”的有效性，极大地拓展了AS基因变异谱，尤其丰富了中国人群特有的变异信息，同时也为其他遗传性疾病的致病基因变异分析研究提供了一个全新范式。

图1. AS基因变异图谱概览。

WGS和RNA测序联合解析非编码区变异

更值得关注的是，该研究不仅拓展了对AS基因变异认知的广度，更增加了对其认知的深度。传统WES因仅覆盖编码区及侧翼少量序列，难以检测深部内含子区等非编码区变异，而这类变异正是导致部分AS患者诊断不明的重要原因。此外，目前对于非编码区变异解析主要依赖WGS结合计算机预测软件（如SpliceAI）筛选候选位点，但预测结果存在假阴性，部分真实致病变异因评分低而被遗漏。该研究团队创新性地采用WGS与RNA测序互补策略：首先对WES阴性患者进行WGS检测并预测异常剪接，随后通过minigene实验或RNA测序验证其致病性；同时，对预测阴性患者直接开展RNA测序，捕获真实发生的异常剪接事件，再反向比对WGS数据定位致病变异。

通过这一策略，研究首次证实了位于内含子区域的基因变异在AS发病中的重要性。研究发现非编码区变异占到了COL4A3/4/5基因检出变异的11.4%-19.1%（图1）。通过WGS和RNA测序的联合应用，研究团队发现了多个位于内含子深部的变异，例如COL4A5: c.1032+563T>G和COL4A5: c.277-566A>G。这些变异虽然不直接改变蛋白编码序列，却通过影响RNA剪接过程，导致了伪外显子插入或正常外显子跳跃，最终破坏IV型胶原蛋白的结构与功能。这不仅充分体现了非编码区变异在AS发病中的重要贡献，提示临床遗传诊断需突破“编码区优先”的传统思路，并且研究团队采用的“RNA测序驱动的WGS重分析”模式有效突破了计算机预测的局限性，实现了非编码区变异的高灵敏度解析，为解读遗传性疾病中非编码区变异的致病机制提供了依据。

三代测序揭示AS新型结构变异

研究团队发现，一些AS患者携带的遗传变异为大规模基因组结构重排，WES和WGS难以准确解析，而三代纳米孔长读长测序（NLR测序）则发挥出了其独特的优势，可以更加精准的发现复杂结构变异。研究团队对经WES/WGS检测仍未确诊的13例患者进行NLR测序分析，成功在6例患者中鉴定出致病性结构变异，并首次发现两种AS新型结构变异类型，填补了AS结构变异研究的空白：这包括巨大的内含子插入，如在一个病例中发现了一个COL4A5基因约2kb的移动元件插入（MEI），该插入具有双向弱启动子活性，扰乱了正常的基因转录；以及复杂的基因组重排，如在另一个病例中发现了COL4A3基因的重复-倒位复合变异则破坏了至少3个外显子的结构，这种变异涉及基因片段的重复后再倒位，二代短读长测序难以精准解析其结构，只有通过三代长读长测序技术方可实现对此类复杂结构变异的完整识别。这充分提示了结构变异在AS遗传病因中占据重要地位，更系统展示了长读长测序在解析复杂基因组重排方面的独特技术优势，为遗传性疾病中结构变异的精准检测提供了关键技术手段。

解读中国AS患者特有遗传特征

遗传性疾病具有明显的种族差异，一些在西方人群中高频的变异位点在中国人群中并不多见，反之亦然。这也充分体现在AS疾病发生过程中。研究团队重点探索了中国AS患者特有的遗传特征，并识别出两个在中国队列中相对高频的变异—COL4A3: c.4793T>G和COL4A4: c.4421C>T。更加深入的分析显示，COL4A3: c.4793T>G变异位点位于高重组区域，且受到族群特异的复杂选择压力影响。这一发现也充分提示，建立针对中国人群的遗传病数据库至关重要，不能简单照搬西方数据进行诊断。

基因变异关联临床表型，为AS精准遗传诊断提供依据

检测基因变异是临床精准遗传诊断的第一步，而这些变异与临床表型和预后的关联，才是构建疾病精准遗传诊断的关键。研究团队通过对临床表型与基因型的深度关联分析，发现在X连锁AS（XLAS）男性中，严重变异（如无义变异、截短变异、大片段删除）进展为终末期肾病（ESKD）的风险远高于以错义变异为代表的温和点突变；而COL4A5胶原区半合子变异则与严重的耳聋高度相关，COL4A3杂合变异与肾囊肿的发生相关，提示临床中对于合并血尿、听力损失的肾囊肿患者，不应忽视COL4A3/4/5基因筛查。于此同时，研究还发现了4.1%的患者同时携带两个胶原基因的变异，这类患者的表型往往比单基因变异更复杂，提示我们在临床遗传诊断筛查时必须同时关注多个基因变异。

研究意义：为遗传性疾病提供了遗传分析新策略和基因诊断新范式

这项研究不仅拓展了AS基因变异图谱，为其遗传机制研究提供了蓝图，更加重要的是为遗传性疾病的遗传分析研究和临床基因诊断实践提供了新范式。在遗传分析策略层面，研究证明了“WES-WGS-RNA测序-NLR测序”这种逐层递进的序贯式检测和分析流程，是解决“遗传诊断不明”的疑难罕见疾病的关键路径和策略。而在基因诊断临床实践角度，则提示在将WGS作为AS一线筛查手段以实现对外显子和内含子区域进行全面分析的基础上，还需要进一步针对二代短读长测序未明确诊断的AS患者，开展长读长测序，以检测短读长测序可能遗漏的复杂结构变异，从而为AS的基因诊断、个体化干预及家族遗传咨询提供更加全面和系统的科学依据。

东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心刘志红院士和浙江大学医学院良渚实验室龚亮研究员为论文的共同通讯作者，狄泓伶博士和游禛博士生为共同第一作者。

全文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-026-70936-9

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