细胞死亡是生命体维持稳态的重要过程。细胞凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）是两种形态和机制截然不同的死亡方式。凋亡由caspase蛋白酶介导，过程中细胞膜保持完整，细胞内容物被有序包裹在凋亡小体中，通过“胞葬作用”被清除，不会引发炎症反应。而坏死则以早期细胞膜完整性丧失为特征，内容物泄漏，往往诱发炎症和自身免疫病理。然而，与凋亡中caspase介导的广泛蛋白切割已被清晰认知不同，坏死终末阶段是否发生类似的系统性蛋白水解事件，长期以来我们知之甚少。
2026年4月7日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心袁钧瑛院士和单冰研究员团队在《Vita》期刊发表了题为“Distinct necrotic protein cleavages define terminal events in necrosis”的研究论文。该研究系统揭示了坏死细胞在质膜破裂后，胞外胰蛋白酶样蛋白酶侵入细胞内，对大量蛋白底物进行特异性切割，这一过程驱动核结构重塑、染色质DNA降解，并促进坏死细胞残骸的吞噬清除，从而限制自身免疫病理。
研究团队首先利用三维光学衍射断层扫描技术对活细胞进行无标记成像，发现坏死细胞（包括坏死性凋亡和铁死亡）的核膜和核仁在早期即变得弥散，折射率显著下降；而凋亡细胞则形成典型的凋亡小体，核膜相对完整。免疫荧光染色进一步显示，坏死细胞中核纤层蛋白Lamin-B1信号特异性丧失，但核孔复合物蛋白Nup98信号仍保留；凋亡细胞则表现为核膜变形但两者信号均存在。值得注意的是，在诱导焦亡的LPS/Nigericin处理中，单个细胞呈现出两种不同的死亡形态：部分细胞表现为凋亡样，部分表现为坏死样，揭示了焦亡执行方式的异质性。
通过蛋白质免疫印迹分析，研究团队发现坏死细胞中Lamin-B1和Lamin-A/C产生与凋亡截然不同的切割产物：坏死产生约50 kDa和55 kDa的较大片段，而凋亡产生约40 kDa和30 kDa的较小片段。这些坏死特异性切割可被RIPK1、RIPK3、MLKL抑制剂或铁死亡抑制剂Liproxstatin-1所阻断，并在小鼠肾缺血再灌注损伤模型中同样被观察到，提示该现象具有体内病理生理相关性。
利用SYTOX Green标记丧失质膜完整性的细胞并进行流式分选，研究者发现坏死性Lamin-B1切割仅发生在SYTOX Green阳性细胞中，而磷酸化MLKL在阴性和阳性细胞中均可检测到。这一关键结果表明：坏死性蛋白切割发生在质膜破裂之后，是细胞死亡执行终末阶段的事件。进一步研究发现，这一切割可被广谱蛋白酶抑制剂leupeptin有效抑制，且依赖于培养基中胎牛血清或新鲜小鼠血清中的蛋白酶，提示胞外蛋白酶在质膜破裂后侵入细胞介导了这些切割事件。
为了系统鉴定坏死中的蛋白切割底物，团队开展了neo-N端组学分析。在坏死性凋亡的HT29细胞、BMDMs以及小鼠肾缺血再灌注损伤模型中，他们鉴定出大量以精氨酸/赖氨酸残基后切割为特征的neo-N端肽段。其中在BMDMs和AKI模型中共有的切割肽段达1253条，源自772个蛋白，切割位点同样高度富集于精氨酸/赖氨酸之后。这些特征与胰蛋白酶样蛋白酶的切割特异性高度一致，且可被leupeptin抑制。通过质谱鉴定和功能互补实验，PRSS家族胰蛋白酶和纤溶酶原被证实可介导这些坏死性蛋白切割。
研究进一步发现，leupeptin抑制这些切割事件后，可显著减轻坏死细胞中基因组DNA的降解，保护核膜和核仁结构的完整性。在吞噬实验中，抑制坏死性切割会减少巨噬细胞对坏死细胞核组分的吞噬，但对胞质成分的摄取无影响。将经leupeptin处理的坏死细胞注射到小鼠腹腔后，可导致脾肿大和血清自身抗体水平升高，表明坏死性蛋白切割在促进坏死细胞清除、防止自身免疫中发挥重要作用。
最后，研究团队针对ABHD16A（切割于R178之后）和GLUD1（切割于K397之后）开发了特异性识别坏死切割产物的单克隆抗体。这些抗体能够在小鼠肾缺血再灌注损伤、肝缺血再灌注损伤、肠道炎症模型以及人糖尿病肾病样本中特异性地标记坏死细胞，为在组织和疾病背景下评估坏死终末事件提供了重要的研究工具。
论文的通讯作者是中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心主任袁钧瑛院士和单冰副研究员。第一作者是中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心李甘泉博士。中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心张耀阳研究员给N端标记蛋白质谱分析提供宝贵建议，北京大学陈良怡研究员对超分辨率ODT显微成像技术的使用提供了宝贵帮助，上海交通大学医学院附属仁济医院李佩盈研究员提供了宝贵的病人样本。
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