食盐（NaCl）是日常饮食中咸度的重要来源，能赋予食品令人愉快的风味。然而，过量的摄入会引起高血压和心血管等相关疾病的发生。鉴于人群血压水平与心血管事件和总死亡之间早已存在的大量因果关联证据，世界卫生组织（WHO）在2007年已将减盐（钠盐）列为预防慢性病的最佳措施之一，并号召成员国在2020年达到人均钠摄入量减少30%的目标。然而，号召人们减盐预防心血管病的行动进展并不顺利。WHO建议成年人每日盐摄入量应低于5 g，但全球范围内许多国家的人均盐摄入量远超这一标准。为了应对这一健康挑战，开发低盐食品成为食品工业的重要方向。然而，盐的减少往往会导致食品风味降低，影响消费者接受度。因此，在不改变原有食品感官质量的前提下，寻找“减盐不减咸”的方法受到了全世界的广泛重视，开发盐替代品已经成为研究的热点。
咸味肽和咸味增强肽作为一种盐替代品，可以在没有任何Na+的情况下提供咸味或增强咸味感知。同时这些肽也更容易被吸收和消化。与传统的盐替代物（如氯化钾）相比，咸味肽具有天然安全、来源广泛、低味阈值、营养丰富等优点。因此，来源于天然动植物的咸味肽作为氯化钠的理想替代品显示出巨大的潜力。
咸味感知主要分为阿米洛利敏感性和阿米洛利不敏感性两种方式。低盐浓度感知与阿米洛利敏感性相关，由上皮钠离子通道（ENaCs）介导。高盐浓度会引发额外的厌恶性味觉途径，受辣椒素受体瞬时受体电位香草素1（TRPV1）调控。近年来，高盐浓度介导的跨膜通道样蛋白4（TMC4）受体途径被报道，其作为新型电压依赖性氯离子通道，在一定阴离子浓度下可使带负电位的阴离子被动进入细胞，增强味觉感受，成为筛选高咸味强度肽的潜在受体。目前，咸味肽与ENaCs和TRPV1受体的作用机制研究较为成熟，但与TMC4受体的结合机制研究仍较匮乏，因此，选择TMC4受体为研究对象。AlphaFold3作为高精度蛋白质结构预测工具，可为本研究TMC4受体模型构建提供可靠支持。
传统咸味肽筛选依赖体外活性测试、感官评价等实验驱动流程，存在重复性高、通量低、周期长、成本高、伦理争议及结果主观性强等问题。而分子对接技术可快速模拟肽与受体的结合情况，缩短研发周期、降低成本，还能揭示分子作用基础。Wang Ran等采用分子对接技术证实了植物乳植杆菌发酵鹅血产生的咸味肽NEALQRM、GDAVKNLD、HAYNLRVD、PEMHAAFDK和AEEKQLITGL通过氢键、疏水作用和静电相互作用与TMC4结合。Wang Haiyan等利用分子对接技术，解析了从牛骨水解物中鉴定的咸味二肽DP、DR和RE与TMC4的结合能和关键结合位点，结合能分别为-6.2、-7.1 kcal/mol和-6.8 kcal/mol，关键结合位点为LYS412和GLU531。有研究通过虚拟筛选获得的大豆蛋白源咸味肽DIF、QPR等与TMC4的结合自由能范围为-5.9～-7.3 kcal/mol，主要相互作用力为氢键和离子键。这些研究系统阐明了咸味肽与TMC4受体的结合关系，为减盐食品开发提供了分子基础。
尽管已有部分研究探讨了咸味肽与TMC4受体的结合关系，但关于咸味肽的结构特点以及二者结合过程中关键作用的氨基酸类型等核心问题仍未明确。因此，沈阳农业大学食品学院的胡龙坤、乌日娜*、武俊瑞*等人以TastePeptidesDB数据库中的咸味肽为研究对象，通过SeqLogo序列分析明确咸味肽的序列特征，借助分子对接技术解析咸味肽与TMC4的相互作用机制，利用分子动力学模拟计算二者间的动态相互作用，通过前沿分子轨道（FMO）计算分析咸味肽的活性中心和最高占据分子轨道（HOMO）-最低未占据分子轨道（LUMO）能级差，并结合感官评价验证咸味肽的咸味结果，旨在达成明确咸味肽与TMC4受体结合的关键结构基础，阐明二者相互作用的分子机制，建立结合能与实际咸味强度的关联，以期为潜在咸味肽挖掘及基于计算模拟的高效筛选体系建立提供理论支撑、为低盐食品开发提供创新策略的研究目标。
1 咸味肽序列规律
从各个长度肽的SeqLogo图（图1）可以看出，每种长度的肽都至少含有D（Asp）和E（Glu）两种鲜味氨基酸中的一种，这两种氨基酸可能与肽的咸味相关。与Chen Xin等的结果类似，谷氨酸和天冬氨酸经常出现在咸味和咸味增强肽中，这些氨基酸的侧链末端是羧基（—COOH），在生理pH值下失去一个氢原子，变成带负电荷的羧酸根（—COO-），其在与TMC4结合时取代了Cl-，从而产生咸味信号。同时Song Chunyong等的研究结果表明，咸味肽富含Leu、Asp和Glu残基，其N端和C端主要由疏水性和极性氨基酸残基组成，这使得酸性氨基酸残基及其相关序列成为肽内重要的“咸味序列”。天冬氨酸和谷氨酸属于鲜味氨基酸，广泛存在于鲜味肽中，证明了咸味肽与鲜味肽在分子层面存在“共享结构基础”。咸味肽的长度分布广泛，从2～11肽均有出现，表明味肽的活性不受严格长度限制。多数序列富含带电或极性氨基酸（如D、E、R、K、H），尤其是酸性（D/E）和碱性（R/K）氨基酸，可能通过静电作用模拟钠离子的咸味信号。相同长度的肽序列差异较大，说明咸味肽的序列模式并非绝对保守，但共性在于电荷分布或关键位点。
2 TMC4模型构建结果
TMC4受体模型使用AlphaFold3从头折叠建模方法和Swiss-model同源建模方法建模，结果如图2a、c所示，与Wang Haiyan等构建的结果类似。使用SAVES v6.1对两种模型进行评估的拉氏图（图2b、d）分析结果表明，AlphaFold3从头折叠建模受体模型绝大部分残基均位于合理区域内，其中94.9%的残基位于最有利区域，4.4%位于额外允许地区，0.3%位于宽松允许区域，而同源建模模型93.8%的残基位于最有利区域，5.2%位于额外允许地区，0.5%位于宽松允许区域，两种模型均符合SAVES v6.0质量标准，该标准要求超过90%的残基在合理（有利和允许的组合）范围内。AlphaFold3从头折叠建模与基于同源建模所构建的受体结构相比，其位于不合理区域的氨基酸残基（图中红点部分）减少。因此，选用AlphaFold3从头折叠建模模型进行后续分子对接。
然而，作为确定结合腔的基本前提，深入推测TMC4的详细跨膜结构是必要的。TMHMM-2.0服务器用于预测TMC4的跨膜区，如图2e所示，TMHMM-2.0服务器发现该蛋白有8个跨膜区，这与 Kasahara等的研究结果一致。如图2f所示，DeepSite预测出两个结合口袋及其中心位点，口袋1的中心位点为[2.02, -48.77,-16.25]，得分为0.986 7，口袋2的中心位点为[8.02,13.23, -4.25]，得分为0.997 4，因此选用口袋2的中心位点作为分子对接的中心位点，这与Chen Daoyou等预测的口袋2一致。
3 分子对接结果
分子对接是一个涉及分子间空间和能量匹配的过程。它可以研究小分子配体与受体的相互作用，并预测它们的结合模式和亲和力。分子对接有助于更深入地理解咸味肽与TMC4受体相互作用的本质及其咸味效果机制。
3.1 对接分数
45条咸味肽与TMC4受体分子对接分数大小如表2所示。结果表明，45条咸味肽的对接分数范围为-8.50～-5.30 kcal/mol，平均对接分数为-7.06 kcal/mol，与Song Chunyong等的结果平均对接分数（-7.3 kcal/mol）接近。长链肽可以具有比短链肽更低的对接分数，这可能是由于长链咸味肽和受体之间的对接距离短，或者是因为长链肽可能有更多的扭转键，足够柔韧以与受体相互作用，也可能是长链肽侧链基团更多，与受体活性位点结合的概率增加而导致的。因此，在对接分数和肽长度之间存在关系。对接分数大小与咸味肽咸味强度相关性分析结果如表3所示，发现咸味肽的咸味强度变化与TMC4受体对接分数有关（P＜0.01），咸味肽与TMC4受体结合越紧密（对接分数越小），咸味肽的咸味强度越高，对于短肽（2～4肽）也具有相关性（P＜0.05），但对于中等长度肽（5～7肽）和长肽（8～11肽）却无相关性。TMC4结合口袋与短肽空间适配，短肽可能可以完全嵌入，与受体关键位点形成稳定作用；而对于中等长度肽，分子体积呈“过渡态”，部分肽段可能适配口袋，部分因疏水侧链与口袋边缘冲突导致结合不稳定，两种情况抵消；长肽的体积超出口袋容纳范围，仅核心片段结合，多余链段可能干扰受体跨膜区构象，破坏“结合紧密→信号激活”关联。因此，对接分数可有效反映短肽的咸味强度差异，但不适用于跨长度范围的咸味肽咸味强度比较。明确不同长度咸味肽的关键活性位点及与TMC4受体的特异性相互作用模式，是深入解析咸味识别分子机制的核心前提。
咸味强度前10的10条咸味肽依据咸味强度排序依次为WDDMEK、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLDDW、ANPGPVRDLR、EDEGEQPRPF、FDELLEK、LIDVDGKPQ和QEVEISRR。这10条咸味肽与TMC4受体的对接分数范围为-6.40～-8.50 kcal/mol，平均对接分数为-7.54 kcal/mol，大于45条咸味肽的平均对接分数（-7.06 kcal/mol），说明对接分数与咸味强度存在一定的关系，咸味强度较高的咸味肽可能通常具有较低的对接分数，即与TMC4受体结合的更加紧密。从图3可以看出，10条咸味肽均能进入TMC4受体空腔的结合口袋与受体结合。
3.2 结合位点
分析了咸味强度前10的咸味肽与TMC4受体分子对接的关键结合位点和相互作用力。了解多肽的关键活性位点对于理解配体和受体识别模式至关重要。热图（图4）强调了肽与TMC4结合位点的相互作用力个数。
在TMC4的所有结合位点中，ALA401、PHE405、LYS412、ARG437、VAL495、GLN524、GLN527和GLU531被鉴定为与本研究中检测的至少6种咸味肽相互作用。所有10种咸味肽与TMC4残基LYS412的相互作用始终涉及。此外，已观察到残基GLN524、GLN527和GLU531参与咸味肽的多个氢键形成。这8个活性位点（ALA401、PHE405、LYS412、ARG437、VAL495、GLN524、GLN527和GLU531）与10条咸味肽（WDDMEK、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLDDW、ANPGPVRDLR、EDEGEQPRPF、FDELLEK、LIDVDGKPQ和QEVEISRR）的总相互作用力分别占相应肽-TMC4复合物中所有相互作用力的60.87%、60.00%、63.64%、75.00%、40.91%、50.00%、55.56%、50.00%、47.06%和33.33%。同时，在这些位点形成的氢键分别占肽-TMC4复合物中所有氢键的71.43%、76.92%、71.43%、62.50%、50.00%、69.23%、72.73%、71.43%、66.67%和31.58%。这些结果表明，这些位点可能是TMC4的关键活性位点，在感受咸味过程中发挥着关键作用。这些结果与以前发现的Arg、Thr和Tyr被认为在咸味肽与TMC4受体的结合中起重要作用不一致，可能由于存在一些特殊的残基，结合涉及离子键、氢键和π-氢键，也可能是预测的结合口袋的不同所导致。而与Chen Daoyou等发现的关键结合位点ARG437、GLN527、ARG580、ARG506和LYS412相似，可能与所选的结合口袋类似有关。
3.3 相互作用力
图5 描述了1 0种咸味肽与T M C 4受体的最佳结合构型，总结了这些最佳结合模式中的相互作用力和结合位点。分析发现，关键结合位点的氢键占比分别为28.57%（ALA401）、57.14%（PHE405）、27.78%（LYS412）、56.25%（ARG437）、50.00%（VAL495）、100%（GLN524）、85.71%（GLN527）和77.78%（GLU531）。推测氢键是TMC4受体与多肽之间的主要非键相互作用力，这与Li Jun和Bu Ying等的研究结果一致，氢键作用是TMC4受体与咸味肽之间最重要的相互作用力。
与此同时， 1 0条咸味肽（ W D D M E K 、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLD DW、ANPGPVRDLR、EDEGEQPRPF、FDELLEK、LIDVDGKPQ和QEVEISRR）分别与TMC4构成23、25、11、12、22、26、18、16、17、30个相互作用力。TMC4与咸味肽之间的结合作用主要涉及氢键、疏水相互作用和静电相互作用。在各肽与TMC4的相互作用力中，氢键是最主要的因素，其占比分别为60.87%（WDDMEK）、52.00%（DWTDDVEAR）、6 3.6 4%（D A T）、6 6.6 7%（L P G D）、2 7.2 7%（RDETLDDW）、65.38%（ANPGPVRDLR）、61.11%（EDEGEQPRPF）、43.75%（FDELLEK）、35.29%（LIDVDGKPQ）和63.33%（QEVEISRR）。这些发现与Chen Ruixia等的研究结果一致。这些结果证实了咸味肽可能主要通过氢键与TMC4受体结合，从而发挥咸味效果。咸味肽与TMC4结合后，可能引发该电压依赖性氯离子通道发生构象变化，促使通道开放，引发阴离子内流与细胞膜去极化，进而产生可传导的神经电信号，形成咸味感知。
3.4 关键氨基酸类型
对咸味肽与TMC4受体在结合过程中发挥关键作用的关键氨基酸类型分析有助于理解咸味肽与与TMC4受体的作用机制。由图5可知，咸味肽中的亲水性氨基酸与TMC4形成平均13.9个相互作用力，疏水性氨基酸与TMC4形成平均6.1个相互作用力。此外，肽中的亲水性氨基酸建立了平均8.7个氢键，而疏水性氨基酸为2.1个。在进一步研究咸味肽的N-末端和C-末端氨基酸后，观察到N-或C-末端的亲水性氨基酸显示出更高的平均氢键数（4.4），而疏水性氨基酸的平均氢键数为0.5。具体地，10条咸味肽（WDDMEK、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLDDW、ANPGPVRDLR、E D E G E Q P R P F、F D E L L E K、L I D V D G K P Q和QEVEISRR）中的亲水性氨基酸形成的相互作用力相对于与TMC4的相互作用力总数的百分比分别为65.22%、60.00%、81.81%、50.00%、63.64%、80.77%、66.67%、62.50%、52.94%和93.33%。相应地，这些肽中亲水性氨基酸形成的氢键数占每个肽中总氢键数的78.57%、69.23%、85.71%、62.50%、100%、82.35%、81.81%、85.71%、66.67%和89.47%。由此可知，除了咸味肽LPGD亲水性氨基酸形成的相互作用力与疏水性氨基酸形成的相互作用力相等外，其余肽由亲水性氨基酸形成的相互作用力和氢键的百分比均高于由疏水性氨基酸形成的。这些结果显示了亲水性氨基酸在咸味肽与TMC4咸味受体结合中的重要性，表明咸味肽主要通过亲水性氨基酸与TMC4受体结合，有效激活了氯离子通道，使具有正电位的阴离子被动进入细胞，从而增强味觉感受。同时，大多数咸味肽序列的N端或C端出现亲水性氨基酸，且显示出高氢键数，表明末端电荷或极性对活性至关重要，末端电荷可能直接参与受体结合，类似于钠离子的“锚定”作用。具体而言，在肽中的所有氨基酸中，精氨酸（Arg）不仅表现出与TMC4形成的氢键的最高平均数（3.43），而且还表现出相互作用力的较高平均数（5.43）。Le Bei等也提出，Arg可以作为咸味增强能力的间接指标，表明它可能是咸味肽中的关键氨基酸。
10条咸味肽（WDDMEK、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLDDW、ANPGPVRDLR、E D E G E Q P R P F、F D E L L E K、L I D V D G K P Q和QEVEISRR）分别与TMC4形成13、15、7、12、10、12、15、12、12、13、16个位点结合。对这些结合位点的氨基酸组成的检查显示，除了肽序列LIDVDGKPQ与TMC4中的亲水性氨基酸位点的相互作用数量小于疏水性氨基酸位点的相互作用数量外，其余9种咸味肽与TMC4中的亲水性氨基酸位点的结合百分比范围为68.00%～91.30%。与TMC4中疏水氨基酸位点的结合百分比（8.70%～52.94%）相比有显著的提高。TMC4的亲水性氨基酸残基与10条咸味肽（WDDMEK、DWTDDVEAR、DAT、LPGD、RDETLD DW、ANPGPVRDLR、EDEGEQPRPF、FDELLEK、LIDVDGKPQ和QEVEISRR）的相互作用，分别占TMC4与各肽形成的总相互作用的91.30%、68.00%、72.73%、83.33%、72.73%、73.08%、68.75%、47.06%和80.00%。此外，TMC4的亲水性氨基酸残基与10条咸味肽建立的氢键，分别占TMC4与每种肽形成的总氢键的100.00%、84.62%、71.43%、100.00%、83.33%、76.47%、90.91%、85.71%、66.67%和84.21%。这些结果强调了TMC4的亲水性氨基酸残基在与咸味肽的结合过程中的重要性，与Niu Yajie等的研究结果一致，来自肽和TMC4的亲水性氨基酸在其结合中起关键作用。
4 Arg在咸味肽与TMC4受体结合中的作用机制
4.1 静电势能分析
Arg作为典型的碱性氨基酸，其侧链胍基（—C(NH2)2+）在生理pH值环境下可稳定携带正电荷，这一结构特征使其成为咸味肽与TMC4受体结合的关键“电荷锚定位点”。静电势能计算发现（图6），Arg位置的静电势能普遍呈现蓝色（数值为正），表明这些咸味肽中Arg残基的侧链（尤其是胍基）区域具有显著的正静电势分布。由此说明，Arg的胍基（—C(＝NH)NH2）具有强碱性和高电荷密度，可通过质子化形成稳定的正电中心，使其成为肽链中关键的正电位点。从结合机制来看，这种正静电势特性能够与TMC4受体中带负电的关键活性位点（Glu、Asp残基的羧基）形成强静电相互作用，成为肽-受体结合的核心锚定位点。
4.2 残基突变
为了明确Arg侧链的电荷特性、氢键供体功能及多向结合优势在肽-受体相互作用中的核心作用，验证其在咸味肽活性表达中的不可替代性，本研究通过定点突变将Arg分别替换为Ala（A）、Lys（K）和Gln（Q），构建电荷与氢键功能差异化的突变体，以明确Arg不同特性的具体作用。
对接结果分析显示（图7），所有突变体的平均对接分数均较对照组（未残基突变组）有所升高，其中Lys（K）突变体对接分数升高幅度最大，Ala（A）和Gln（Q）突变体也呈现不同程度的对接分数提高且多数达到统计学显著水平。这表明Arg残基的正电特性、多向氢键能力及胍基专属结构是维持肽与TMC4受体高效稳定结合的关键，其缺失或被替代会显著降低结合亲和力，且Arg胍基介导的“多向氢键+静电协同”作用不可被Lys的单一正电特性替代，正电特性作为结合先决条件也无法通过Gln的单纯氢键能力弥补，进一步印证了Arg残基通过多结构特征协同作用决定咸味肽与受体的结合稳定性的结论。
5 分子动力学模拟分析结果
为了进一步研究肽与蛋白质之间的相互作用，对咸味味觉受体与肽形成的复合物进行了10 ns的分子动力学模拟。
较高的RMSD值表示更大的波动和更明显的运动，而较低的值表示更大的稳定性。研究表明，当肽与受体形成稳定的复合物时，RMSD在0.5 nm内波动，并且在整个模拟过程中没有显著的波动。如图8a、b所示，在TMC4-咸味肽复合物中，除TMC4-DWTDDVEAR在8 ns之前表现出较大的波动外，其他复合物均在4 ns后达到动态平衡，且RMSD值均小于1.3 nm，表现出较高的稳定性。
RMSF用于表征模拟过程中蛋白质链上每个氨基酸残基的构象变化，更大的RMSF值表明更大的构象灵活性。如图8c、d所示，与咸味肽结合后的TMC4受体具有相似的RMSF值，均在残基500处左右具有较大的波动，这一现象的出现可能是由于这些区域的氨基酸残基通过氢键、疏水作用和静电相互作用与配体发生相互作用，从而产生较大的波动，这与分子对接的结果一致。
Rg评估了蛋白质结构的紧密度，较低的值表明密度较大，较高的值反映了构象熵和无序度的增加。SASA反映分子的折叠状态，折叠紧密的分子SASA较小，而展开或部分变性的分子SASA较大。如图8e～h所示，与咸味肽结合后的受体蛋白的Rg和SASA都逐渐减小，说明蛋白质趋于紧密折叠，表现出稳定的状态。
为了更直观地了解蛋白质和化合物的结合，计算整个模拟过程中肽和咸味受体之间形成的氢键的数量。从图8i、j可以看出，所有咸味肽-TMC4受体复合物均形成了稳定的氢键相互作用。其中TMC4-DWTDDVEAR与TMC4-QEVEISRR复合物的氢键数量峰值可达6个，且在模拟周期内分别稳定维持在3、2个左右。其余咸味肽-TMC4复合物的氢键数量亦围绕2个波动，未出现长时间无氢键结合的解离现象。该结果验证了分子对接中“氢键是咸味肽与TMC4受体结合的主要相互作用力”这一核心结论，排除了对接预测的氢键作用仅为偶然构象匹配的可能性，进一步证实咸味肽与TMC4受体的结合模式具有生理环境下的可靠性。
6 FMO分析
6.1 活性位点
FMO分析是预测分子反应活性的重要理论工具。具体地说，HOMO表现出给电子能力，而LUMO表现出接受电子能力。在本研究中，咸味强度最高的10条咸味肽被用于FMO的研究。从图9和表4可以看出，根据结构分析和HOMO-LUMO计算，咸味肽的活性位点主要位于肽序列中的Asp和Glu氨基酸。除ANPGPVRDLR和DAT外，其他氨基酸的活性位点都至少有Asp和Glu氨基酸中的一种。一些研究结果表明，Glu可能是咸味肽的重要组成部分。同时，Yu Xuening等发现鲜味肽的咸味机制主要与Glu、Arg和Gln有关。此外，本研究的分子对接结果显示，咸味肽的活性位点氨基酸残基与TMC4受体形成了多个相互作用。其中，各咸味肽的活性中心与TMC4受体的关键活性位点形成2～6个相互作用力，对应氢键数量为0～5个，具体表现为：与ANPGPVRDLR形成4个相互作用力（2个氢键），与DAT形成3个相互作用力（2个氢键），与DWTDDVEAR形成5个相互作用力（5个氢键），与EDEGEQPRPF形成2个相互作用力（2个氢键），与FDELLEK形成6个相互作用力（4个氢键），与LIDVDGKPQ形成2个相互作用力（1个氢键），与LPGD形成6个相互作用力（5个氢键），与QEVEISRR形成6个相互作用力（4个氢键），与RDETLDDW形成3个相互作用力（0个氢键），与WDDMEK形成4个相互作用力（3个氢键）。这一观察结果表明，咸味肽主要通过氢键与TMC4受体结合，从而发挥咸味效果。咸味肽的咸味强度大小可以通过活性位点分析解释。
6.2 HOMO-LUMO能级差
除活性位点分布外，HOMO-LUMO能级差作为反映分子电子转移能力的关键参数，其与肽-受体对接分数的关联同样为理解咸味肽的作用机制提供了重要线索。能极差越小，分子反应活性越大，分子越活泼。对10条高咸味强度肽的FMO参数与对接分数数据统计分析显示，咸味肽的HOMO-LUMO能级差与对接分数之间呈现“低能级差倾向于对应低对接分数（强结合），但高能级差未必对应弱结合”的非严格线性关联特征（表4）。
具 体 来 看， 5条 肽 段（ Q E V E I S R R 、E D E G E Q P R P F、L I D V D G K P Q、W D D M E K、FDELLEK）的能级差处于0.17～0.33 eV的低范围，其对接分数普遍较低（-6.90～-8.07 kcal/mol），其中EDEGEQPRPF（能级差0.23 eV）的对接分数达-8.07 kcal/mol，体现出低能级差通过促进电子转移增强肽-受体结合稳定性的趋势，与经典FMO理论中“能级差越小，分子间电子转移越容易，相互作用越强”的规律一致。但该趋势并非绝对，ANPGPVRDLR和DWTDDVEAR的能级差分别为1.38 eV和1.23 eV（中等水平），对接分数却低至-8.50 kcal/mol和-7.77 kcal/mol，结合能力优于部分低能级差肽段；更特殊的是，能级差最高的肽RDETLDDW（5.48 eV），对接分数仍达-8.13 kcal/mol，接近最低值。表明这些肽段可能通过其他机制补偿电子转移效率的不足，ANPGPVRDLR和Q E V E I S R R中A r g残基介导的多向静电作用、DWTDDVEAR中Asp残基形成的密集氢键网络等，进而实现与TMC4受体的紧密结合。此外，LPGD（能级差2.08 eV）和DAT（能级差3.84 eV）的对接分数分别为-7.20 kcal/mol和-6.40 kcal/mol，处于中等水平，进一步印证了能级差对对接分数的影响存在序列特异性。
HOMO-LUMO能级差是影响咸味肽与TMC4受体对接分数的重要因素之一，但并非唯一决定性因素。该发现进一步提示，咸味肽与TMC4受体的结合是电子转移、空间匹配及多类型分子间作用力协同作用的结果，单一FMO参数难以全面反映结合能力的差异，需结合分子对接、分子动力学模拟等多维度数据进行综合评估，才能为咸味肽的活性预测与筛选提供可靠依据。
7 感官评价
选取分子对接结果中对接分数最低的2条咸味肽（ANPGPVRDLR和RDETLDDW）、对接分数中等的2条肽（QEVEISRR和HNESQN）以及对接分数最高的2条肽（AT和KG）进行感官评价分析。从10人总平均咸味评分来看（图10），低对接分数组的RDETLDDW总平均评分为（7.8±1.65）分，与阳性对照0.2% NaCl（（8.1±0.51）分）无显著差异（P＞0.05），表明其在2 mg/mL质量浓度下即可达到低盐食品所需的咸味强度；同组ANPGPVRDLR总平均评分为（6.9±0.94）分，虽略低于阳性对照，但仍处于“较强咸味”区间；中等对接分数组QEVEISRR和HNESQN总平均评分分别为（5.0±0.76）、（4.3±0.50）分，对应“中等咸味”；高对接分数组AT和KG总平均评分仅（2.4±0.31）、（2.1±0.71）分，与阴性对照水（（1.0±0.0）分）存在显著差异（P＜0.05），几乎无咸味感知，表明对接分数高的肽可能无法有效激活TMC4受体产生咸味信号。以上结果验证了分子对接预测的可靠性：与TMC4受体结合能越低的咸味肽，在实际感官评价中往往表现出越强的咸味强度。该结论与Wang Haiyan等的研究一致，其所报道的咸味肽DR也因与TMC4具有较低结合能，而对应较高的咸味感知强度。
8 讨论
在本研究中，通过序列分析发现，咸味肽序列中富含带电氨基酸（D、E、R、K）可能通过静电作用模拟钠离子的咸味信号。同时，大多数序列的N端或C端出现亲水性氨基酸，表明末端电荷或极性对活性至关重要，末端电荷可能直接参与受体结合。TMC4受体模型构建结果和拉氏评估显示，94.9%的氨基酸残基位于最适构象区，表明模型具有可靠性。TMC4受体包含8个跨膜区域。分子对接结果显示，45条咸味肽与TMC4的对接分数与其咸味强度呈显著负相关（P＜0.01），对于短肽同样具有显著相关性（P＜0.05），而对于中等长度肽和长肽则没有显著相关性。分子对接分析揭示了咸味肽主要通过氢键、疏水相互作用和静电相互作用与TMC4受体结合，其中以氢键为主，来自肽和TMC4的亲水性氨基酸可能在其结合中起关键作用，Arg可能是咸味肽中的关键氨基酸，静电势能分析和残疾突变分析证明了这一结果。此外，推测ALA401、PHE405、LYS412、ARG437、VAL495、GLN524、GLN527和GLU531是TMC4受体的关键结合位点。分子动力学模拟结果表明，咸味强度较高的咸味肽可与TMC4受体形成稳定复合物，该结合过程由特定关键氨基酸残基间的分子相互作用所介导，其中氢键被证实为维持结合稳定性的主要作用力。咸味肽活性中心计算结果表明，Asp和Glu可能是咸味肽的主要活性位点，咸味肽可能主要通过氢键与TMC4受体结合，从而发挥咸味效果。同时，HOMO-LUMO能级差是影响咸味肽与TMC4受体对接分数的重要因素。感官评价结果表明，咸味肽与TMC4受体的结合能越低，其在实际感官测评中呈现的咸味强度往往越高。本研究揭示了咸味肽的构效关系及受体结合模式，阐明了咸味肽与通道蛋白相互作用的分子机理，为基于计算模拟的高效筛选体系建立提供理论，为低钠食品开发提供了新思路。
值得注意的是，分子对接过程中采用统一对接中心且固定TMC4受体构象，虽通过排除受体构象变量确保了不同肽段对接结果的横向可比性，支撑了“肽段结构-结合能力”关联的核心结论，但未考虑生理环境中受体结合口袋残基的构象动态变化（侧链旋转、氢键重排）及柔性特征，可能对长链肽结合模式的预测产生细微偏差，无法完全模拟肽-受体相互作用的动态过程。同时，FMO计算仅针对咸味强度前10的10条肽段开展，虽明确了Asp和Glu为主要活性位点及低HOMO-LUMO能级差肽段倾向于低对接分数的规律，但样本量偏小，难以建立FMO参数与结合能的普适性关联模型，可能限制结论的推广性。后续将采用AutoDock Vina柔性对接模块构建“受体多构象-肽段对接”体系，重点探索LYS412和GLU531构象变化对不同长度肽段结合特异性的调控机制，使计算模型更贴近生理实际。同时，后续也将扩大FMO计算样本量，结合偏最小二乘回归等机器学习方法，构建“FMO参数-对接分数-咸味强度”多变量关联模型，明确FMO特征对结合能力的贡献权重，提升结论的普适性与预测价值。
作者简介
通信作者：
乌日娜，沈阳农业大学食品学院，教授，博士生导师，博士后合作导师。长期深耕食品微生物与营养健康领域，现任辽宁省食品发酵技术工程研究中心主任、食品营养与健康专业负责人，兼任益生菌发酵与生物智造团队带头人。研究方向聚焦益生菌营养健康调控、食品微生物发酵与安全控制、合成生物学及生物智造与人工智能融合应用。
学术成果丰硕，曾获全国百篇优秀博士论文提名奖，入选教育部、农业部等多项国家级人才计划，获评全国食品工业科技创新领军人物、辽宁省学术头雁、兴辽英才等荣誉称号。教学上承担本硕博多门核心课程，包括《发酵食品工艺学》《食品生物技术》等。
科研方面，主持国家级项目课题5 项、各类科研项目30余项，参与国家863重大项目等40余项；发表论文280余篇（SCI收录153 篇），编著教材著作16 部（英文专著4 部），授权国家专利51 件；以第一完成人荣获中国食品工业协会科技奖特等奖、辽宁省自然科学奖、科技进步奖二等奖等30余项奖励。
积极投身社会服务，与蒙牛、伊利、青岛啤酒等知名企业建立长期合作，提供技术指导并解决生产难题，多项科研成果成功转化推广，助力食品行业高质量发展。同时兼任多个国家级学会分会常务理事、理事及多本中外期刊副主编、编委，积极推动学科交流与发展。
通信作者：
武俊瑞，沈阳农业大学食品学院，教授，博士生导师，博士后合作导师。现任辽宁省食品发酵技术工程研究中心常务副主任、沈阳市微生物发酵技术创新重点实验室主任，方向带头人，荷兰瓦赫宁根大学访问学者。主要研究方向聚焦乳制品、微生物发酵食品及生物智能制造领域。
获评中国食品工业科技创新杰出人才，入选辽宁省“兴辽英才”计划、百千万人才工程千人等人才项目，荣获沈阳市中青年科技创新领军人才、天柱山英才等称号。教学上承担本硕博多门核心课程，主持省级教学项目1 项，《畜产食品工艺学》MOOC获评国家精品在线课程，3门课程分获省级一流课程、校级精品课等，获辽宁省多媒体课件优秀奖、校级教学成果奖等多项荣誉，指导学生获国家级大创项目、省食品创新大赛一等奖等各类奖项数十项。
科研成果丰硕，主持国家自然科学基金面上项目3 项及其他项目30余项，参与国家863、十二五等重大项目40余项；发表论文200余篇（SCI收录100余篇，含5 篇ESI高被引论文），授权专利51 件、软著13 件，主编著作21 部；荣获中国食品工业科技创新特等奖、农业部神农中华农业科技奖等多项科研奖励。
兼任多个国际学术组织会员、国家级学会理事及蒙牛等知名企业专家，担任多本中外核心期刊副主编或编委，同时承担国家重点研发、自然科学基金等多项评审工作，积极推动科研成果转化与行业技术进步。
第一作者：
胡龙坤，沈阳农业大学食品学院，硕士研究生。研究方向聚焦食品生物技术。学业表现优异，累计三次荣获一等校长奖学金，多次斩获二等、三等学业奖学金。科研实践能力扎实，以第一作者发表EI论文1 篇，参与发表SCI论文1 篇、国家发明专利2 篇。积极投身学科竞赛与社会实践，先后荣获优秀团员、校三好学生，以及沈阳农业大学第七届中国国际“互联网+”大赛校园选拔赛初赛三等奖、大学生食品创新大赛三等奖、第十六届“挑战杯”大学生创业计划竞赛三等奖、寒假社会实践优秀调研报告一等奖、优秀毕业生等荣誉。
引文格式：
胡龙坤, 潘国杨, 安飞宇, 等. 基于分子模拟解析咸味肽与TMC4受体结合机制[J]. 食品科学, 2026, 47(3): 25-41. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250908-063.
HU Longkun, PANG Guoyang, AN Feiyu, et al. Molecular simulation analysis of the binding mechanism between salty peptides and the TMC4 receptor[J]. Food Science, 2026, 47(3): 25-41. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250908-063.
实习编辑：王雨婷；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽农业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、皖西学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“ 第六届食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到） 在 中国 安徽 合肥 召开。
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