2026年4月16日，中南大学湘雅二医院代谢内分泌科胡芳团队联合温州医科大学附属第一医院郑明华团队等，在Metabolism （中科院1区，IF=11.9）在线发表题为 “Hepatocyte DDIT4 aggravates MASH progression through GPX4-mediated ferroptosis” 的研究论文。该研究聚焦代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）进展过程中肝细胞铁死亡的关键调控机制，首次系统揭示 DDIT4通过抑制GPX4表达及其线粒体转运，促进肝细胞铁死亡，从而加重MASH脂质沉积、炎症反应和肝纤维化进展，为MASH治疗提供了新的潜在分子靶点。
▼编者按:
MASH是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的进展形式，可进一步发展为肝硬化甚至肝癌。尽管目前已有药物获得FDA有条件批准用于伴纤维化的成人MASH患者，但MASH的有效治疗手段仍然有限，寻找安全、精准的新型干预靶点具有重要临床意义。该研究从公共转录组数据库和铁死亡相关基因数据库入手，筛选出与MASH和铁死亡高度相关的核心分子DDIT4，并在MASH患者肝组织、MASH小鼠模型以及脂肪酸诱导的肝细胞模型中验证其显著上调。
研究发现，DDIT4表达水平与MASH严重程度、肝损伤指标以及铁死亡标志物呈正相关。进一步通过肝细胞特异性DDIT4过表达和敲除小鼠模型，作者证明DDIT4并非单纯的伴随性变化，而是MASH进展的重要推动因素。DDIT4过表达会显著加重肝脏脂质沉积、炎症浸润、肝损伤和纤维化；相反，抑制或敲除DDIT4则能够缓解MASH病理进展。
机制上，该研究揭示了一个关键的 DDIT4—GPX4—铁死亡轴。GPX4是抑制铁死亡的重要抗氧化酶，而DDIT4一方面通过抑制mTORC1信号降低GPX4蛋白表达，另一方面又可与胞质中的GPX4发生相互作用，并干扰TOM22介导的GPX4线粒体转运，导致线粒体GPX4减少，最终增强脂质过氧化和铁死亡敏感性。换言之，DDIT4通过“双重打击”削弱GPX4的抗铁死亡防线，使肝细胞更容易发生铁死亡，从而推动MASH恶化。
更具转化意义的是，研究团队通过分子对接和表面等离子体共振实验筛选并验证天然黄酮类化合物 Quercetagetin 可作为潜在DDIT4靶向化合物。动物实验显示，Quercetagetin干预能够缓解MASH小鼠的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，提示DDIT4不仅是MASH进展机制中的关键节点，也可能成为未来MASH药物开发的重要靶点。
总体而言，该研究从“铁死亡驱动MASH进展”这一核心科学问题出发，系统阐明了肝细胞DDIT4在GPX4调控、线粒体抗氧化防御和铁死亡激活中的关键作用，提出 靶向DDIT4阻断铁死亡 可能是干预MASH进展的新策略。该成果不仅丰富了MASH发生发展的分子机制，也为天然产物靶向治疗MASH提供了新的理论依据和实验支撑。
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【摘要】
背景与目的：代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一种进展性肝病，目前治疗选择有限；铁死亡在其发病机制中的作用仍有待充分阐明。本研究旨在探究 DNA 损伤诱导转录物 4（DDIT4）在铁死亡以及 MASH 进展调控中的作用。
方法：研究利用 MASH 小鼠模型的 Gene Expression Omnibus 数据库和铁死亡数据库，筛选 MASH 中关键的铁死亡相关基因；在 MASH 患者、小鼠模型和肝细胞中检测肝脏 DDIT4 表达；在不同饮食诱导的 MASH 小鼠模型中，通过肝细胞特异性 DDIT4 过表达或敲除评估 DDIT4 的功能作用；采用 RNA 测序和免疫沉淀-质谱（IP-MS）确定 DDIT4 的相互作用蛋白；并通过分子对接探索可能靶向 DDIT4 的化合物。
结果：研究发现，MASH 小鼠和患者中的 DDIT4 水平均显著升高，并且与 MASH 严重程度呈正相关。肝细胞特异性 DDIT4 过表达会加重铁死亡和 MASH 进展，而 DDIT4 缺失则缓解铁死亡和 MASH 进展。机制上，DDIT4 以 mTORC1 依赖方式降低谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的表达。此外，DDIT4 与胞质 GPX4 相互作用，并抑制 TOM22 介导的 GPX4 向线粒体转位，导致线粒体 GPX4 减少并激活铁死亡。重要的是，研究通过分子对接和表面等离子体共振（SPR）鉴定出天然黄酮类化合物槲皮万寿菊素（quercetagetin，QG）是潜在的 DDIT4 靶向化合物。给予 QG 能够缓解 MASH 小鼠的肝脂肪变、炎症和纤维化。
结论：本研究确立了 DDIT4-GPX4-铁死亡轴是 MASH 进展中的一个新的调控节点，并提示 DDIT4 可能成为 MASH 的潜在治疗靶点 。
01
研究背景及科学问题
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球最常见的慢性肝病之一。其进展形式——代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）——可导致肝硬化和肝癌等严重后果，给全球医疗卫生与经济系统造成重大负担[1–3]。瑞美替罗（Resmetirom）是一种 THR-β 受体激动剂[4]，目前是唯一获得美国 FDA 有条件批准、用于治疗伴有肝纤维化的成人 MASH 患者的药物。然而，其具体疗效和安全性仍需通过更大规模临床研究进一步验证。因此，识别安全且有效的 MASH 治疗靶点至关重要。
从脂肪变性向 MASH 的转变始于肝细胞死亡，随后触发炎症和纤维化[5]。尽管在 MASH 进展过程中，凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡等多种细胞死亡形式并存，但其中占主导地位的机制仍不清楚[6,7]。值得注意的是，铁死亡被定义为铁依赖性脂质过氧化过程[8]，越来越多证据提示其是 MASH 发病机制中的早期事件[9,10]；同时，铁死亡抑制剂已被证明能够缓解 MASH 模型中的疾病病理改变[11,12]。
除 Fe2+ 过载可催化多不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化外，氧化还原代谢改变也会从根本上提高细胞对铁死亡的敏感性。线粒体产生的活性氧（ROS）增加会触发肝脏脂质过氧化，该过程可在内质网膜中扩散，并最终到达质膜[13,14]。谷胱甘肽（GSH）-硒酶谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）系统是一种关键的硫醇依赖性细胞抗氧化系统。GSH 生物合成以及 GPX4 的正常功能能够保护细胞免于多种氧化应激条件所诱发的死亡，尤其是可导致硫醇耗竭的应激条件[15]。由于 GPX4 具有还原复杂氢过氧化物、从而中断脂质过氧化链式反应的独特能力，它已被确立为癌细胞铁死亡的关键上游调节因子[16]。GPX4 的蛋白降解、基因敲除或化学抑制均可在多种细胞中促进铁死亡[17]。近期研究报道，GPX4 活性降低可促进 MASLD 中的铁死亡[18]；线粒体中 GPX4 降解会触发铁死亡，导致肝损伤和肝纤维化加重[19]；相反，GPX4 过表达则能够缓解 MASH[20]。尽管现有研究提示氧化还原状态和关键酶 GPX4 将铁死亡与 MASH 联系起来，但在 MASH 中调控铁死亡的具体蛋白仍缺乏充分表征。
本研究通过整合分析铁死亡数据集和 MASH 模型 RNA 测序数据，鉴定出 DNA 损伤诱导转录物 4（DDIT4）是 MASH 进展的关键调控因子。DDIT4 在人类 MASH 样本以及啮齿动物细胞和动物模型中表达升高，并通过靶向 GPX4 促进铁死亡，进而导致肝脏脂质积累、炎症和纤维化增加。遗传学或药理学抑制肝脏 DDIT4 均可缓解 MASH。本研究揭示了 GPX4 的一个新的调控因子，并提示 DDIT4 可能是 MASH 的潜在治疗靶点。
02
重要发现及亮点
3.1 DDIT4 在 MASH 中显著上调，并与 MASH 进展相关
为寻找参与铁死亡并调控 MASH 进展的潜在分子，研究首先检索了公开可获得的 MASH 小鼠模型肝脏转录组数据。由于 MASH 可由不同饮食或化学因素诱导[23]，研究从 GEO 数据库中选择了 5 个数据集（GSE197322、GSE35961、GSE207856、GSE200352 和 GSE162863），这些数据集代表了不同饮食、化学诱导方式或不同处理时长所诱导的 MASH 模型；随后分析其共同差异表达基因（DEGs）。最终，在 5 个数据库中鉴定出 17 个与 MASH 高度相关的枢纽基因（图 1A）。
为进一步筛选与铁死亡相关的基因，研究从铁死亡数据库 FerrDb（zhounan.org/ferrdb）中获得 564 个铁死亡相关基因。将上述 17 个枢纽基因与铁死亡基因进一步取交集后，最终鉴定出 4 个基因（Nupr1、Ddit4、Plin4 和 Stmn1）（图 1A）。其中 Nupr1（核蛋白 1）已被证明是铁死亡抑制因子[24]，而另外 3 个基因在铁死亡和 MASH 中的作用尚不清楚。基于已发表数据[25]，研究发现仅 Ddit4 在铁死亡诱导剂 Erastin 刺激后显著上调。
DDIT4（DNA damage-induced transcript 4，基因名 Ddit4；亦称 REDD1 或 RTP801）是一种高度保守的蛋白，可由多种细胞应激因素诱导，例如缺氧、DNA 损伤、电离辐射、内质网应激和热休克[26,27]。然而，其在 MASH 中的作用仍不清楚。
为首先明确 DDIT4 在铁死亡和 MASH 中的临床相关性，研究收集了原发疾病为肝内胆管结石、肝囊肿或肝血管瘤患者的肝组织。根据 NAFLD 活动度评分（NAS），将患者分为 MASH 组和非 MASH 组。研究通过免疫组织化学（IHC）分析评估患者肝脏中 DDIT4 和 4-羟基壬烯醛（4-HNE，铁死亡标志物）的蛋白水平。结果显示，MASH 组中 DDIT4（图 1B-C）和 4-HNE 均显著上调（补充图 S1A-B）。值得注意的是，DDIT4 与 4-HNE 呈强正相关（补充图 S1C）。DDIT4 阳性区域还与 NAS 评分以及 γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平呈正相关（图 1D），后两者均为肝损伤相关酶。此外，对 29 例患者肝样本的分析显示，Ddit4 mRNA 表达与血清 ALT、AST 和甘油三酯（TG）水平呈显著正相关（图 1E）。综上，DDIT4 表达升高与患者肝损伤、铁死亡和 MASH 进展加重相关。
为进一步验证 DDIT4 在啮齿动物 MASH 发展中的变化，研究检测了 MASH 动物模型肝脏中的 DDIT4 蛋白表达。Gubra-Amylin NASH（GAN）饮食含有饱和脂肪（40%）、果糖（22%）和胆固醇（2%），以 GAN 饮食喂养的动物可代表纤维化性 MASH 模型[28]。数据显示，与普通饲料（NC）喂养小鼠相比，GAN 饮食诱导的肥胖小鼠肝脏 DDIT4 蛋白水平显著升高（图 1F）。此外，与各自野生型（WT）对照小鼠相比，db/db 和 ob/ob 小鼠肝脏中 DDIT4 表达也显著升高（图 1G-H）。
为阐明 Ddit4 在肝脏不同细胞中的表达模式，研究重新分析了公开可获得的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集（GSE166504），该数据集包含对照、MAFL 和 MASH 小鼠模型的肝样本。研究发现，在对照条件下，Ddit4 在肝细胞中的表达较低，但在 MAFL 和 MASH 中显著升高（补充图 S1D-E）。星状细胞中也出现了类似表达模式。相反，Kupffer 细胞中的 Ddit4 水平在对照组较高，而在 MAFL 和 MASH 中显著下降（补充图 S1D-E）。这些数据表明，小鼠肝脏中 Ddit4 具有与 MASH 进展相关的细胞特异性表达模式。
此外，体外实验显示，在棕榈酸（PA）和油酸（OA）处理原代肝细胞所诱导的 MASH 细胞模型中，DDIT4 表达显著上调（图 1I）。综合来看，DDIT4 是一种与 MASH 和铁死亡相关的蛋白，升高的 DDIT4 可能参与 MASH 进展。
图 1. DDIT4 表达在 MASH 中显著上调，并与 MASH 进展相关。A. 将 DDIT4 鉴定为 MASH 和铁死亡中的核心基因。B. 非 MASH 与 MASH 个体肝切片中 DDIT4 IHC 染色的代表性显微图像。C. 对所示个体肝切片中 DDIT4 IHC 染色的定量分析（n = 12/组）。D. DDIT4 表达与 NAS 评分、血清 ALT 和 GGT 水平的相关性分析。E. MASH 患者和健康对照中 Ddit4 mRNA 表达与 NAS 评分、血清 ALT、AST 和 TG 水平的相关性分析。F. GAN 饮食诱导 MASH 小鼠和普通饲料（NC）喂养小鼠肝脏中 DDIT4 蛋白表达（n = 5-6 只/组）。G. db/db 小鼠和野生型（WT）小鼠肝脏中 DDIT4 蛋白表达（n = 5 只/组）。H. ob/ob 小鼠和 WT 小鼠肝脏中 DDIT4 蛋白表达（n = 5 只/组）。I. PAOA 或 BSA 处理原代肝细胞中 DDIT4 蛋白表达（n = 3/组）。数据表示为均值 ± SEM，****p < 0.0001。两组比较采用双尾 Student t 检验。
3.2 肝细胞特异性 DDIT4 过表达加重 GAN 饮食诱导的 MASH
为研究肝脏 DDIT4 在体内的作用，研究利用 CRISPR-Cas9 技术和白蛋白-Cre 系统构建了肝细胞特异性 DDIT4 敲入小鼠（DDIT4 LKI）（补充图 S2A-B）。Western blot 分析验证 DDIT4 表达仅在肝脏中特异性升高，而不影响其他组织（补充图 S2C）。研究首先考察了在 NC 饮食条件下，肝脏特异性 DDIT4 过表达对小鼠代谢表型的影响。与同窝对照（DDIT4 FLOX）小鼠相比，DDIT4 LKI 小鼠的体重、肝重、葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）均无显著差异（补充图 S2D-F）。血清 TG、总胆固醇（TC）含量以及血清 ALT 和 AST 水平也无差异（补充图 S2G-H），提示在正常营养条件下，肝细胞 DDIT4 过表达不影响小鼠的生理功能及全身糖脂代谢。
为探索肝细胞 DDIT4 在 MASH 中的作用，研究用 GAN 饮食喂养 LKI 小鼠和 FLOX 对照小鼠（补充图 S2I）。在 16 周喂养期间，两组小鼠体重无显著差异（补充图 S2J），但与对照组相比，LKI 组肝重以及肝重/体重比显著升高（图 2D-E）。此外，GTT 和 ITT 结果显示，LKI 小鼠葡萄糖耐量受损更严重，胰岛素敏感性更差（图 2A-B），提示肝细胞 DDIT4 过表达加重了 MASH 小鼠的糖代谢异常。
就肝脏而言，根据 H&E 染色和油红 O 染色的组织学评估，LKI 小鼠表现出更严重的脂肪变性或脂质积累（图 2C）。研究分别采用 F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色检测肝脏炎症和胶原纤维沉积，结果显示 LKI 小鼠肝脏炎症和纤维化更严重（图 2C）。同时，与对照小鼠相比，LKI 小鼠血清（图 2F-G）和肝脏（图 2H-I）TG 与 TC 水平均显著升高。此外，LKI 小鼠血清 ALT 和 AST 水平也较对照组升高（图 2J-K）。总体而言，肝细胞 DDIT4 过表达会加重 GAN 饮食诱导的 MASH 小鼠模型中的肝脏脂质积累、炎症和纤维化。
为进一步探索肝细胞 DDIT4 过表达导致的转录组变化，研究在 GAN 饮食喂养 16 周后提取 LKI 和 FLOX 小鼠肝组织进行 RNA 测序（RNA-seq）。聚类分析和主成分分析（PCA）显示，FLOX 组和 LKI 组之间存在显著差异（补充图 S2K-L）。两组之间共有 184 个差异表达基因，其中 128 个上调、56 个下调（补充图 S2M）。为明确 DDIT4 过表达改变了哪些通路，研究进行了基因集富集分析（GSEA），结果显示 LKI 小鼠中脂质代谢、炎症和纤维化相关通路显著富集（图 2L）。同时，介导上述通路变化的核心基因在 LKI 小鼠中均升高（图 2M）。实时 qPCR 验证显示，与脂质转运和脂质合成相关的基因（Lipin3、Gpat3、Cd36 和 Fasn）、促炎基因（Bcl2、Il1b、Ccl6 和 Cxcl16）以及促纤维化基因（a-Sma、Col1a1、Timp1 和 Tgfb）的 mRNA 水平均在 LKI 小鼠中显著上调（图 2N-P）。总体而言，肝脏特异性 DDIT4 过表达可加重 GAN 饮食诱导的 MASH。
图 2. 肝细胞特异性 DDIT4 过表达加重 GAN 诱导的 MASH。肝细胞特异性 DDIT4 过表达小鼠（LKI）和对照（FLOX）小鼠接受 GAN 饮食喂养 16 周。A. 葡萄糖耐量试验（GTT）及 GTT 曲线下面积（AUC）（n = 6 只/组）。B. 胰岛素耐量试验（ITT）及 ITT 的 AUC（n = 6 只/组）。C. LKI 和 FLOX 小鼠肝脏 H&E 染色、油红 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性显微图像；柱状图为相应染色阳性区域的统计分析（n = 4/组）。D-E. 肝重及肝重/体重比（n = 6 只/组）。F-G. 血清 TG 和 TC 水平（n = 6 只/组）。H-I. 肝脏 TG 和 TC 水平（n = 6 只/组）。J-K. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 6 只/组）。L. 与脂质代谢、炎症和纤维化相关通路的 GSEA 富集分析。M. 所示组别中与脂质代谢、炎症和纤维化相关基因的热图。N-P. 所示组别中与脂质代谢、炎症和纤维化相关基因的 mRNA 水平（n = 3/组）。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。两组比较采用双尾 Student t 检验。
3.3 肝细胞特异性 DDIT4 过表达加重 HFMCD 诱导的 MASH
HFMCD 喂养是另一种常用的 MASH 动物模型饮食，可在短时间内造成严重肝损伤和纤维化[29]。为进一步确认 DDIT4 在 MASH 进展中的作用，研究给予 FLOX 和 LKI 小鼠 HFMCD 饮食 4 周（补充图 S3A）。与 GAN 饮食诱导 MASH 模型中的观察一致，LKI 小鼠和对照小鼠之间体重及肝重无显著差异（补充图 S3B-C）。与对照组相比，LKI 小鼠血清和肝脏 TG 均升高，而 TC 无差异（补充图 S3D-G）。H&E 和油红 O 染色结果显示，LKI 小鼠肝脏脂质积累更严重（补充图 S3H）。Sirius red 染色和 F4/80 染色结果（补充图 S3H）以及血清 ALT 和 AST 水平（补充图 S3I-J）显示，LKI 小鼠肝纤维化和肝损伤更严重。类似地，与脂质代谢、促炎和促纤维化相关的基因 mRNA 水平显著上调（补充图 S3J）。综上，肝细胞 DDIT4 过表达加重了 HFMCD 诱导 MASH 中的肝脏脂质积累、炎症和纤维化。
3.4 DDIT4 在体内外促进肝脏铁死亡易感性
由于肝细胞死亡是 MASH 进展中的关键事件，为确定 DDIT4 过表达肝细胞中发生的细胞死亡类型，研究从 FLOX 和 LKI 小鼠中分离原代肝细胞，并在 PAOA 处理同时加入不同细胞死亡抑制剂，包括凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK（Z-VAD）、坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1（Nec-1）和铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1（Fer-1）。细胞活力结果显示，只有 Fer-1 能够逆转 DDIT4 过表达诱导的细胞死亡（图 3A），提示 DDIT4 在肝细胞中诱导铁死亡。为验证这一点，研究随后用不同浓度的铁死亡诱导剂（RSL3 或 Erastin）处理 DDIT4 过表达（Ddit4 OE）原代肝细胞。结果显示，与对照细胞相比，DDIT4 过表达肝细胞对 RSL3 处理表现出浓度依赖性的死亡率显著升高（图 3B）。Erastin 处理在最高使用剂量下也导致更高的死亡率（补充图 S4A）。
线粒体形态改变以及脂质过氧化和 ROS 积累均与铁死亡相关。研究检测了 PAOA 处理下 DDIT4 过表达原代肝细胞的特征性变化。结果显示，在电子显微镜下，DDIT4 过表达导致更明显的线粒体萎缩，线粒体更浓缩、更短（图 3C）；荧光 BODIPY581/591 C11 染色显示脂质过氧化水平升高，同时线粒体 ROS（mitoSOX）和全细胞 ROS（DCFH-DA）水平均增加（图 3D）。
此外，研究还确定肝细胞 DDIT4 过表达是否影响小鼠肝脏铁死亡。研究检测了 GAN 或 HFMCD 饮食喂养的 FLOX 和 LKI 小鼠肝脏中的肝内铁含量、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值。结果显示，与 GAN 饮食（图 3E）或 HFMCD 饮食（图 3F）喂养的对照小鼠相比，LKI 小鼠肝内铁含量和 MDA 水平均显著升高，而 GSH/GSSG 显著降低，提示肝脏 DDIT4 过表达小鼠铁死亡增加。综合这些观察结果可见，肝脏 DDIT4 过表达促进了 MASH 中的铁死亡。
图 3. DDIT4 在体内外促进肝脏铁死亡易感性。A. 来自 FLOX（对照）或 DDIT4 LKI 小鼠（Ddit4 OE）的原代肝细胞，在 Nec-1、Z-VAD 或 Fer-1 存在下接受 BSA 或 PAOA 处理 24 h。采用 CCK8 法检测细胞活力（n = 6/组）。B. 对照或 Ddit4 OE 原代肝细胞用 DMSO 或 RSL3 处理 6 h，采用 CCK8 法检测细胞活力（n = 6/组）。C. BSA 或 PAOA 预处理后，对照和 Ddit4 OE 原代肝细胞中线粒体的代表性透射电镜图像；散点图表示各组相应线粒体长度，数据为 3 个独立生物学重复的均值 ± SEM，每组共分析 17 个线粒体。D. BSA 或 PAOA 预处理后，对照和 Ddit4 OE 原代肝细胞中 Bodipy 581/591 C11、DCFH-DA 和 MitoSOX 染色的代表性荧光显微图像；柱状图为阳性区域（A.U.）定量（n = 3/组）。E. GAN 饮食喂养 FLOX 或 LKI 小鼠肝脏铁（Fe）含量、MDA 水平和 GSH/GSSG（n = 5-6 只/组）。F. HFMCD 饮食喂养 FLOX 或 LKI 小鼠肝脏 Fe 含量、MDA 水平和 GSH/GSSG（n = 5-6 只/组）。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示无显著性。两组比较采用双尾 Student t 检验，多组比较采用单因素 ANOVA 并进行 Tukey 事后检验。
3.5 DDIT4 通过促进铁死亡加重脂质积累和炎症
为确定 DDIT4 是否在肝细胞中诱导脂质积累和炎症，研究从 FLOX 小鼠中分离原代肝细胞，并感染带 Flag 标记的 DDIT4 表达腺病毒（Flag-Ddit4）或对照病毒（Flag-Vector），随后进行 PAOA 处理。与 LKI 小鼠肝脏中的观察一致，油红 O 染色和细胞内 TG 含量检测结果证实，在基础状态或 PAOA 处理下，DDIT4 过表达均会加重细胞内脂质积累（图 4A-B）。研究还检测了与脂质代谢和炎症相关的基因，发现 DDIT4 过表达促进脂质合成基因（Srebf1、Fasn、Scd1 和 Pparg）以及促炎相关基因（Tnfa、Il1b 和 Il6）上调（图 4C-D）。
为进一步明确铁死亡是否介导 DDIT4 诱导的肝细胞脂质积累和炎症，研究在 PAOA 条件下用铁死亡抑制剂 Fer-1 处理 DDIT4 过表达肝细胞。油红 O 染色结果显示，Fer-1 处理降低了 DDIT4 过表达导致的脂质沉积（图 4E-F），并降低脂质合成相关基因（Scd1、Pparg、Fasn 和 Srebf1）以及炎症相关基因（Tnfa、Il1b 和 Il6）的表达（图 4G-H）。综上，这些结果表明，肝细胞 DDIT4 过表达会加重脂质积累和炎症，而这一过程可能由铁死亡促进所导致。
图 4. DDIT4 通过促进铁死亡加重脂质积累和炎症。A. 原代肝细胞感染 Flag 标记的空载体（Flag-Vector）或 DDIT4 表达载体（Flag-Ddit4），随后用 PAOA 或 BSA 处理；采用油红 O 染色监测脂质积累。B. 肝细胞 TG 水平（n = 6/组）。C-D. 与脂质代谢和炎症相关基因的相对 mRNA 表达（n = 3/组）。E. Ddit4 过表达（Flag-Ddit4）或对照（Flag-Vector）原代肝细胞经 PAOA 预处理后，再用 DMSO 或 Fer-1 处理；采用油红 O 染色监测脂质积累。F. 肝细胞 TG 水平（n = 3/组）。G-H. 与脂质代谢和炎症相关基因的相对 mRNA 表达（n = 3/组）。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示无显著性。两组比较采用双尾 Student t 检验，多组比较采用单因素 ANOVA 并进行 Tukey 事后检验。
3.6 DDIT4 通过抑制 GPX4 表达及其线粒体转运促进铁死亡
作为支架蛋白，DDIT4 通过与其他蛋白结合而发挥功能[30]。为研究肝细胞中 DDIT4 的相互作用蛋白，研究感染原代肝细胞使其表达 DDIT4，随后在 PAOA 处理条件下通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）筛选与 DDIT4 相互作用的蛋白。排除非特异性结合蛋白后，研究根据蛋白相互作用网络分析富集蛋白。基因本体（GO）分析显示，氧化还原酶活性是主要富集通路之一（补充图 S5A），该通路包含 13 个候选蛋白（图 5A）。
在候选蛋白中，只有 GPX4 是已知的经典铁死亡抑制因子。研究使用共免疫沉淀（CO-IP）进一步验证，在 PAOA 处理下，DDIT4 与原代肝细胞中的 GPX4 相互作用（图 5B）。由于 DDIT4 和 GPX4 均可在细胞质和线粒体中表达，研究分离了 PAOA 处理肝细胞的胞质组分和线粒体组分，并进一步明确 DDIT4 与 GPX4 在胞质中相互结合，而不在线粒体中结合（图 5C）。
为探索 DDIT4 如何调节肝细胞中的 GPX4，研究首先检测了 GPX4 表达变化。结果显示，DDIT4 过表达降低 GPX4 蛋白水平（图 5D），但不降低其 mRNA 水平（补充图 S5B）；而 DDIT4 沉默（通过 siRNA）显著提高 GPX4 蛋白水平（图 5E），提示存在潜在的翻译后调控机制。为研究 DDIT4 是否影响 GPX4 稳定性，研究从 DDIT4 过表达肝细胞中分离胞质和线粒体组分，并进行环己酰亚胺（CHX）追踪实验。CHX 处理后，DDIT4 迅速降解，而 GPX4 稳定性明显更高（补充图 S5C）。值得注意的是，与对照组相比，DDIT4 过表达肝细胞的胞质或线粒体组分中 GPX4 降解速率均无显著差异（补充图 S5C）。结合此前报道 DDIT4 蛋白半衰期仅为 5 min[31]，这些结果共同提示 DDIT4 并不直接调节 GPX4 的稳定性。
既往研究报道 GPX4 蛋白水平受 mTORC1 信号调控[32]，而 DDIT4 是 mTORC1 信号的强效抑制因子[27]。因此，为研究 DDIT4 是否通过抑制 mTORC1 信号调节 GPX4 蛋白，研究采用 WB 验证 mTORC1 相关分子的变化。DDIT4 过表达显著抑制 mTOR、S6K 和 4EBP1 的磷酸化水平，提示 mTORC1 信号激活降低（图 5F）。为进一步验证 DDIT4 以 mTORC1 依赖方式调节 GPX4 蛋白表达，研究进行了救援实验：具体而言，对 DDIT4 过表达细胞使用亮氨酸（Leu，mTORC1 激活剂）处理，而对 DDIT4 沉默细胞使用雷帕霉素（mTORC1 抑制剂）处理；随后检测两组 GPX4 蛋白水平。如图 5G 所示，亮氨酸处理有效恢复了被 DDIT4 过表达抑制的 GPX4 蛋白水平。相反，雷帕霉素处理显著降低了 DDIT4 缺陷细胞中的 GPX4 蛋白水平（图 5H）。上述数据提示 DDIT4 主要通过 mTORC1 信号通路调节 GPX4 蛋白水平。然而，GPX4 救援并不能逆转 DDIT4 对 mTORC1 活性的抑制（数据未显示），表明 DDIT4 抑制 mTORC1 信号独立于其与 GPX4 的相互作用。
考虑到 GPX4 在胞质和线粒体中的双重定位，研究进一步探索 DDIT4 是否影响 GPX4 的蛋白定位。研究检测了经 PAOA 处理的 DDIT4 过表达肝细胞中的 GPX4 蛋白含量，并分离胞质和线粒体蛋白。出乎意料的是，与对照细胞相比，DDIT4 过表达细胞线粒体中的 GPX4 蛋白含量显著降低（图 5H）。为阐明 DDIT4 如何影响 GPX4 的线粒体转运，研究首先通过 CO-IP 检测 DDIT4 与线粒体导入机器关键组分 TOM20、TOM22 和 TOM70 的相互作用。有趣的是，DDIT4 特异性结合 TOM22，而不结合 TOM20 或 TOM70（图 5J），提示 DDIT4 与 TOM22 存在直接相互作用。接下来，为确定 DDIT4 结合是否抑制 TOM22 介导的 GPX4 线粒体导入，研究在 DDIT4 缺陷原代肝细胞中使用 siRNA 敲低 Tom22。虽然 DDIT4 缺陷肝细胞中的线粒体 GPX4 水平升高，但进一步敲低 TOM22 后，线粒体 GPX4 显著减少（图 5K）。这些数据表明，TOM22 介导 GPX4 的线粒体转运，而 DDIT4 与之结合会损害这一过程。鉴于线粒体 GPX4 在抑制铁死亡中发挥关键作用[33]，研究结果提示 DDIT4 与 TOM22 相互作用可阻断 GPX4 的线粒体导入，从而使肝细胞更易发生铁死亡。
总体而言，研究提出 DDIT4 通过两个并行且协调的机制驱动线粒体铁死亡并促进 MASH 进展。一方面，它抑制 mTORC1 介导的 GPX4 从头合成；另一方面，它通过同时与 GPX4 和 TOM22 相互作用，损害 GPX4 的线粒体转运。这种双重扰动会降低全细胞尤其是线粒体中的 GPX4 储备，最终使肝细胞对铁死亡更加敏感，并促进 MASH 进展（图 5L）。
图 5. DDIT4 通过抑制 GPX4 表达及其线粒体转运促进铁死亡。A. 筛选 DDIT4 相互作用蛋白的示意图。原代肝细胞感染 Flag-Ddit4 后接受 PAOA 处理 24 h。细胞裂解物与 DDIT4 抗体或兔 IgG 对照孵育，随后进行免疫沉淀和质谱（IP-MS）分析；展示 GO 分析鉴定出的氧化还原酶活性相关蛋白。B. 取 DDIT4 过表达小鼠原代肝细胞，经 PAOA 处理 6 h；用抗 DDIT4 抗体进行免疫沉淀（IP），并对全细胞裂解物中所示蛋白进行 western blot（WB）分析。C. 用抗 DDIT4 抗体进行 IP，并对胞质和线粒体裂解物中所示蛋白进行 WB 分析。D. 原代肝细胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 后，全细胞裂解物中 GPX4 和 DDIT4 蛋白水平的 WB 分析。E. 原代肝细胞转染 Ddit4 siRNA（siDdit4）或对照后，全细胞裂解物中 GPX4 和 DDIT4 蛋白水平的 WB 分析。F. 原代肝细胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 后，mTORC1 信号相关蛋白的 WB 分析。G. 原代肝细胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 并用亮氨酸（Leu）处理后，GPX4 和 mTORC1 信号相关蛋白的 WB 分析。H. 原代肝细胞转染 Ddit4 siRNA 或对照并用雷帕霉素处理后，GPX4 和 mTORC1 信号相关蛋白的 WB 分析。I. 原代肝细胞感染 Flag-Ddit4 或 Flag-Vector 并接受 PAOA 或 BSA 处理后，胞质和线粒体裂解物中 GPX4 蛋白水平的 WB 分析。J. 来自 DDIT4 过表达小鼠的原代肝细胞经 PAOA 处理 6 h；用抗 DDIT4 抗体进行 IP，并对全细胞裂解物中所示蛋白进行 WB 分析。K. Ddit4 敲低（siDdit4）或对照原代肝细胞转染 Tom22 siRNA（siTom22）；通过 WB 检测线粒体裂解物中的 GPX4 和 TOM22 蛋白水平。L. DDIT4 介导调控 GPX4 合成及其线粒体转运的示意图。数据表示为均值 ± SEM，**p < 0.01，***p < 0.001；两组比较采用双尾 Student t 检验。图像经 BioRender.com 授权制作。
3.7 GPX4 过表达缓解 DDIT4 诱导的肝细胞脂质积累、炎症和铁死亡
为阐明 DDIT4 诱导的铁死亡是否由 GPX4 抑制所造成，研究通过将 GPX4 表达质粒转染至从 LKI 和 FLOX 小鼠分离的原代肝细胞中来恢复 GPX4 表达。通过检测 GPX4 的 mRNA 和蛋白水平验证了转染效率（补充图 S6A-B）。GPX4 救援能够逆转 DDIT4 诱导的铁死亡，表现为细胞死亡率降低（图 6A），细胞内脂质过氧化水平以及线粒体和全细胞 ROS 水平显著下降（图 6B）。此外，油红 O 染色显示 GPX4 过表达可改善 DDIT4 诱导的脂质积累（图 6C），并降低细胞内 TG 含量（图 6D）以及脂质合成和炎症相关基因的 mRNA 表达（图 6E）。上述数据表明，GPX4 介导了 DDIT4 在调控铁死亡、脂质代谢和炎症中的作用。
为验证人肝组织中 GPX4 的变化，研究在收集的人 MASH 组织中通过 IHC 染色检测 GPX4 蛋白表达。与 DDIT4 水平升高（图 1B-C）相反，人 MASH 样本中 GPX4 表达明显降低（图 6F-G）。此外，DDIT4 与 GPX4 呈强负相关（图 6H）。综上，这些数据为小鼠和人类 MASH 中存在 DDIT4-GPX4-铁死亡轴提供了直接证据。
图 6. GPX4 过表达缓解 DDIT4 诱导的肝细胞脂质积累、炎症和铁死亡。A. 来自 FLOX（对照）或 Ddit4 LKI 小鼠（Ddit4 OE）的原代肝细胞转染 GPX4（Myc-Gpx4）或空载体（Myc-Vector），随后用 BSA 或 PAOA 处理 24 h；采用 CCK8 法检测细胞活力（n = 6/组）。B. 原代肝细胞中 Bodipy 581/591 C11、DCFH-DA 和 MitoSOX 染色的代表性荧光显微图像（上图）；柱状图为荧光染色定量（下图）（n = 4/组）。C. 转染 GPX4 或空载体的对照或 Ddit4 OE 肝细胞油红 O 染色的代表性显微图像。D. 肝细胞 TG 水平（n = 4/组）。E. 与脂质代谢和炎症相关基因的相对 mRNA 表达水平（n = 3/组）。F. 非 MASH 和 MASH 个体肝切片中 GPX4 IHC 染色的代表性显微图像。G. 所示个体肝切片中 GPX4 IHC 染色的定量分析（n = 12/组）。H. DDIT4 表达与 GPX4 表达的相关性分析。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无显著性。两组比较采用双尾 Student t 检验，多组比较采用单因素 ANOVA 并进行 Tukey 事后检验。
3.8 肝细胞特异性 DDIT4 缺失缓解铁死亡和 MASH 进展
为探索靶向 DDIT4 是否能够抑制铁死亡并缓解 MASH 进展，研究利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 DDIT4 敲除 FLOX 小鼠（补充图 S7A）。通过向 DDIT4 敲除 FLOX 小鼠尾静脉注射腺相关病毒 AAV8-TBG-Cre，获得肝细胞特异性 DDIT4 敲除小鼠（Ddit4 KO）；对照组（Control）注射 AAV8 空病毒（补充图 S7B）。研究验证了肝细胞中 DDIT4 水平显著降低（补充图 S7C）。6 周龄 DDIT4 KO 和对照小鼠接受 GAN 饮食喂养 16 周，两组体重无显著差异（补充图 S7D）；而 KO 小鼠肝重和肝重/体重比均较低（图 7D-E）。GTT 和 ITT 显示，与对照组相比，KO 小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性显著改善（图 7A-B）。H&E 染色和油红 O 染色显示，KO 小鼠肝脏脂质积累减少（图 7C）。F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色也显示，KO 小鼠肝脏炎症和纤维化得到缓解（图 7C）。
KO 小鼠血清和肝脏 TG 含量均显著低于对照组（图 7F-G），而两组 TC 含量无显著差异（图 7H-I）。KO 小鼠血清 ALT 和 AST 水平也显著低于对照组（图 7J-K）。
此外，DDIT4 敲除减轻了小鼠肝脏铁死亡，表现为肝内铁含量和 MDA 水平降低，以及 GSH/GSSG 升高（图 7L-N）。总体而言，肝细胞特异性 DDIT4 消除可通过减少铁死亡，并改善脂质积累、炎症和纤维化，从而缓解 MASH 进展。
图 7. 肝细胞特异性 DDIT4 缺失缓解铁死亡和 MASH 进展。肝细胞特异性 DDIT4 缺失小鼠（KO）和对照小鼠接受 GAN 饮食喂养 16 周。A. GTT 及 GTT 的 AUC（n = 5-6 只/组）。B. ITT 及 ITT 的 AUC（n = 5-6 只/组）。C. 对照和 Ddit4 KO 小鼠肝脏 H&E 染色、油红 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性显微图像；柱状图为相应染色阳性区域的统计分析（n = 4/组）。D-E. 肝重和肝重/体重比（n = 5-6 只/组）。F-G. 血清 TG 和 TC 水平（n = 5-6 只/组）。H-I. 肝脏 TG 和 TC 水平（n = 5 只/组）。J-K. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 5-6 只/组）。L-N. 肝脏 Fe 含量、GSH/GSSG 和 MDA 水平（n = 5 只/组）。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns 表示无显著性。两组比较采用双尾 Student t 检验。
3.9 黄酮醇类化合物槲皮万寿菊素通过靶向 DDIT4 缓解 MASH
为鉴定可特异性靶向 DDIT4 的潜在化合物，研究通过分子对接筛选了商业可用化合物数据库（MCE Compound Library）（补充图 S8A）。根据对接评分，研究选择排名前 6 的化合物进行进一步验证，包括 Militarine（MLT）、二氢杨梅素（DHM）、槲皮万寿菊素（QG）、橙皮苷甲基查尔酮（HMC）、曲二糖（KJ）和 Robinin（RB）（图 8A）。研究评估了这些化合物是否能够降低 PAOA 处理原代肝细胞中的脂质积累；油红 O 染色和细胞内 TG 含量结果显示，只有 DHM 和 QG 能够显著降低肝细胞脂质积累（图 8B-C）。
QG（又称 6-羟基槲皮素）是一种从万寿菊（Tagetes erecta L.，菊科）中提取的黄酮醇化合物，具有抗氧化和抗病毒功能[34]。然而，其对 MASH 的作用仍不清楚。因此，研究选择 QG 进行后续验证。QG 的化学结构以及其与 DDIT4 的潜在结合模式如图 8D 所示。QG 可能在 DDIT4 蛋白 LEU-109、ARG-113、TRP-186、LYS-188 和 GLN-206 残基附近发生连接。此外，表面等离子体共振（SPR）实验确认 QG 与 DDIT4 具有较强亲和力，KD 值为 4.22e−06 M（图 8E，补充表 1）。此外，研究发现 QG 处理可下调原代肝细胞中的 DDIT4，同时上调 GPX4 蛋白水平（补充图 S8B）。
为研究 QG 给药对体内 MASH 的影响，研究用 GAN 饮食喂养 C57B6/J 小鼠 16 周。随后小鼠接受 QG 或溶剂对照灌胃 8 周。研究每周监测体重和血糖变化。结果显示，QG 处理对体重无显著影响（补充图 S8C），但显著改善了 MASH 小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性（图 8F-G）。
QG 处理显著降低肝重和肝重/体重比（图 8I-J）。根据 H&E 染色、油红 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色结果，QG 处理还缓解了 MASH 相关的肝脏脂质积累、纤维化和炎症（图 8H）。此外，QG 处理降低了血清 TG 和 TC 水平（图 8K-L），并通过降低血清 ALT 和 AST 水平缓解肝损伤（图 8M-N）。另外，QG 处理还减轻了肝脏铁死亡，表现为肝脏铁含量和 MDA 水平降低，以及肝脏 GSH/GSSG 比值升高（图 8O-Q）。在基因水平上，QG 处理下调了与脂质代谢、炎症和纤维化相关的基因（补充图 S8D）。
为明确 QG 的靶向特异性，研究用 PAOA 和 QG 处理 DDIT4 缺陷肝细胞 24 h，随后评估脂质积累。单独敲除 DDIT4 或单独 QG 处理均显著减少脂质积累，表现为油红 O 染色减少和细胞甘油三酯（TG）含量降低（补充图 S8E-F）。然而值得注意的是，在 DDIT4 缺陷肝细胞中，QG 处理不能进一步减少脂质积累，说明 QG 通过特异性靶向 DDIT4 来缓解肝脂肪变。总体而言，这些结果表明，QG 是一种可通过靶向 DDIT4 改善 MASH 的新型化合物。
图 8. 黄酮醇类化合物槲皮万寿菊素（Quercetagetin）通过靶向 DDIT4 缓解 MASH。A. 分子对接筛选出的前 6 个靶向 DDIT4 的化合物列表。B-C. 来自 WT 小鼠的原代肝细胞用 BSA 或 PAOA 处理，并联合 Militarine（MLT）、二氢杨梅素（DHM）、槲皮万寿菊素（QG）、橙皮苷甲基查尔酮（HMC）、曲二糖（KJ）或 Robinin（RB）处理后的油红 O 染色代表性显微图像及 TG 水平（n = 6/组）。D. QG 化学结构及其与 DDIT4 的潜在结合模式。E. 使用人重组 DDIT4 蛋白和逐渐升高浓度 QG 进行 SPR 分析。F. QG 或溶剂对照处理的 GAN 饮食诱导 MASH 小鼠 GTT 及 GTT 的 AUC（n = 8 只/组）。G. QG 或溶剂对照处理的 GAN 饮食诱导 MASH 小鼠 ITT 及 ITT 的 AUC（n = 4-5 只/组）。H. 对照或 QG 处理小鼠肝脏 H&E 染色、油红 O 染色、F4/80 IHC 染色、Sirius red 染色和 α-SMA IHC 染色的代表性显微图像；柱状图为相应染色阳性区域的统计分析（n = 3/组）。I-J. 肝重和肝重/体重比（n = 5 只/组）。K-L. 血清 TG 和 TC 水平（n = 5 只/组）。M-N. 血清 AST 和 ALT 水平（n = 5 只/组）。O-Q. 肝脏 Fe 含量、GSH/GSSG 和 MDA 水平（n = 5-6 只/组）。数据表示为均值 ± SEM，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns 表示无显著性。两组比较采用双尾 Student t 检验。
【Citation】:Wang, H., Liu, W.-Y., Zhang, F., Chen, W., Hu, J., Cheng, R., Chen, Z., Wu, D., Xie, L., Tao, Y., Zheng, M.-H., & Hu, F. (2026). Hepatocyte DDIT4 aggravates MASH progression through GPX4-mediated ferroptosis.Metabolism, 180, 156622.
【贡献】★★★★★
本研究揭示 DDIT4 是铁死亡的正向调控因子，其上调会加重肝细胞脂质积累、炎症和纤维化，从而促进铁死亡和 MASH 进展。消除肝细胞 DDIT4 能够缓解铁死亡和 MASH 进展。在脂质应激条件下，DDIT4 使 GPX4 滞留于胞质，降低其线粒体蛋白水平，进而促进铁死亡。因此，靶向 DDIT4 可能成为治疗 MASH 的潜在策略。
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