2026年5月，广东省人民医院（广东省医学科学院）顾兵团队、华南理工大学张磊团队等，联合南方医科大学、华南理工大学等单位，在Journal of Medicinal Chemistry（2024 Impact Factor=6.8）在线发表题为“Discovery of Non-Carboxylic Steroidal FXR Agonist as a Promising Preclinical Candidate for Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis”的研究论文。该文于2025年11月5日投稿，2026年3月25日修回，2026年4月29日接收。
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是脂肪肝疾病进展中的关键阶段，可进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝衰竭，已成为全球代谢性肝病治疗领域的重要难题。FXR 是当前 MASH 药物研发中的重要靶点，代表性药物 OCA 已在临床研究中显示出抗纤维化潜力，但其剂量相关性瘙痒等不良反应限制了进一步应用。因此，如何在保持 FXR 强效激活的同时降低脱靶风险，成为新一代 FXR 激动剂设计中的核心挑战。
本研究围绕这一痛点，采用基于结构的药物设计策略，对 OCA 的侧链结构进行系统优化，提出了“去羧酸化+构象限制”的设计思路。研究团队发现，OCA 的羧基结构可能与 MRGPRX4 激活相关，而 MRGPRX4 被认为与非组胺能瘙痒反应密切相关。基于此，作者设计并合成了一系列非羧酸甾体类 FXR 激动剂，最终筛选出表现突出的候选化合物 compound 27。
实验结果显示，compound 27 具有强效 FXR 激动活性，在 TR-FRET 实验中的 EC₅₀ 为 10 ± 3 nM，在细胞荧光素酶报告基因实验中的 EC₅₀ 为 128 ± 9 nM，活性优于 OCA。同时，compound 27 对 MRGPRX4 的非期望激活明显降低，其选择性指数达到 201，约为 OCA 的 25 倍，提示其可能具有更优的安全性窗口。此外，compound 27 还表现出较高的大鼠口服生物利用度（F = 70.30%），并可激活 hTGR5，形成 FXR/TGR5 双通路调控优势。
在体内药效方面，compound 27 在 CCl₄ 诱导的肝纤维化模型中显著减轻胶原沉积，改善肝组织纤维化病理变化；在 WD 与 CCl₄ 共诱导的 MASH 模型中，compound 27 能明显改善肝脂肪变性、炎症浸润、肝细胞气球样变和纤维化指标，部分疗效优于 OCA。这说明 compound 27 不仅在分子和细胞水平具有良好活性，也在复杂疾病模型中展现出扎实的临床前治疗潜力。
总体来看，该研究的亮点不只是发现了一个更强的 FXR 激动剂，更重要的是提出了一种兼顾疗效与安全性的药物设计逻辑：通过非羧酸结构降低 MRGPRX4 相关瘙痒风险，同时保留并增强 FXR/TGR5 介导的代谢调控和抗纤维化作用。compound 27 因此有望成为 MASH 治疗领域具有进一步开发价值的新型临床前候选化合物，也为下一代胆汁酸受体调节剂的结构优化提供了重要参考。
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【摘要】
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）正成为日益严峻的全球健康挑战，迫切需要有效的治疗手段。法尼醇 X 受体（FXR）是治疗 MASH 的一个有前景的靶点。本研究报道了一种新型非羧酸甾体类 FXR 激动剂——化合物 27 的理性设计。该化合物表现出有效的 FXR 激动活性（TR-FRET：EC₅₀ = 10 ± 3 nM；荧光素酶报告基因实验：EC₅₀ = 128 ± 9 nM），同时与 OCA 相比，对脱靶受体 MRGPRX4 的激活作用降低。化合物 27 在大鼠中具有较高的口服生物利用度（F = 70.30%），并能激活 hTGR5（HTRF：EC₅₀ = 1360 nM）。体内研究证实了其疗效：在 CCl₄ 诱导的肝纤维化模型中，化合物 27 能减轻胶原沉积；在 MASH 模型中，它能改善脂肪变性和炎症灶。总体而言，化合物 27 通过增强 FXR/TGR5 活性并抑制 MRGPRX4 的“双路径”策略，获得了较有前景的疗效与安全性特征，支持其作为 MASH 新型治疗药物进一步开发。
01
研究背景及科学问题
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），过去称为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），已经成为一种全球性流行疾病。MASH 是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）疾病谱中具有重要临床意义的阶段。MASH 的进展始于肝细胞内脂质过度积累，组织学上表现为细胞质内脂滴沉积，即肝脂肪变性。持续性的脂肪变性会进一步引发肝细胞损伤和炎症反应，随着时间推移可能发展为进行性肝纤维化和肝硬化。值得注意的是，MASH 已经成为全球肝移植和肝相关死亡的重要原因。虽然饮食干预和体育锻炼等生活方式改变在早期 MASH 中具有治疗效果，但多数患者很难长期坚持。因此，开发既能改善 MASH 症状、又能阻止纤维化进展的药物具有迫切需求。然而，MASH 的病理机制尚未完全阐明，目前治疗选择也非常有限，这凸显了开发安全性和有效性更优的新疗法的紧迫性。
法尼醇 X 受体（FXR）是一种配体激活型核受体转录因子，可被其内源性配体激活，如鹅去氧胆酸（CDCA）。FXR 激活后会通过诱导小异二聚体伴侣（SHP）形成反馈调节环路，从而抑制胆固醇 7α-羟化酶（CYP7A1）的表达，减少胆汁酸生物合成，并影响胆汁酸稳态。具体而言，FXR 还能通过抑制 SREBP 转录因子的活性，影响肝脏胆固醇和甘油三酯代谢。FXR 也与脂质氧化过程密切相关，并可被过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α（PGC-1α）激活，从而促进 PGC-1α 介导的脂肪酸 β 氧化。因此，FXR 在调控胆汁酸合成、转运和代谢方面具有关键作用，同时还参与调节脂质代谢、葡萄糖代谢和炎症反应等生理过程，这使其成为治疗 MASH 的有前景靶点。
近年来，许多 FXR 激动剂被开发用于 MASH 治疗，并进入不同阶段的临床试验。奥贝胆酸（OCA，也称 INT-747，图 1）是鹅去氧胆酸的 C6α-乙基修饰衍生物，因其抗胆汁淤积和肝保护特性，已作为原发性胆汁性胆管炎（PBC）的二线治疗药物获得加速批准。一项针对非肝硬化 MASH 患者的随机、双盲、安慰剂对照研究显示，每日 25 mg OCA 在 18 个月中期分析时达到了主要终点，即在 MASH 未恶化的情况下实现纤维化改善（至少降低 1 个分期），提示结果积极。然而，在每日口服 25 mg OCA 的剂量下，超过 50% 的患者出现了瘙痒这一最常见不良事件。TC-100（INT-787，图 1）是一种新型 C11β-羟基化 OCA 衍生物，具有与 OCA 相当的 FXR 激动活性，可通过调节胆汁酸稳态和肠道菌群改善肠黏膜损伤。
非甾体类 FXR 激动剂 Cilofexor（GS-9674，图 1）可显著降低非肝硬化 MASH 患者的肝脂肪变性，并可能通过降低血清纤维化标志物发挥抗纤维化作用。然而，中度至重度瘙痒是常见不良反应，尤其在较高剂量下更明显。Tropifexor（LJN-452，图 1）是选择性最强的 FXR 激动剂，可显著降低 ALT、GGT、体重和肝脂肪含量。FXR 激动剂 omesdafexor（MET-409，图 1）与恩格列净联合治疗，在一项针对 2 型糖尿病合并 MASH 患者的 12 周 IIa 期试验中显示出良好的安全性，并可降低肝脂肪含量。
OCA 作为 FDA 批准用于 PBC 的药物，也是首个进入 MASH III 期临床试验的 FXR 靶向治疗药物，说明其作用机制和临床疗效已经得到较系统的验证。然而，剂量依赖性瘙痒严重限制了其临床应用。尤其是在高剂量组中，9% 的患者因难以耐受瘙痒而停药，这凸显了开发安全性更优的优化型 FXR 激动剂的必要性。已有研究表明，OCA 可通过选择性激活人 MRGPRX4（hX4，一种表达于背根神经节神经元的 Mrgpr 家族孤儿 GPCR 成员）诱导非组胺能瘙痒，而这一作用并不依赖其经典靶点 FXR 或 TGR5。进一步机制研究显示，3-磷酸化脱氧胆酸（DCA-3P，图 S1）通过其磷酸基团与 Arg82、Arg95 和 Arg86 三个周围残基相互作用，对 hX4 的活性比 DCA 高 65 倍；DCA 是天然胆汁酸中最强的 hX4 激动剂，EC₅₀ 为 2.9 μM。这提示 hX4 与激动剂之间相互作用增强可能诱发更强烈的瘙痒。此外，Nateglinide 的更强效衍生物 MS47134（图 S1）也可通过其羧基与 Arg82 残基发生电荷相互作用，插入正电性静电势口袋中。
与此同时，Takeda G 蛋白偶联受体 5（TGR5）是另一种胆汁酸受体。同时靶向 FXR 和 TGR5 的双重激动剂已显示出治疗代谢性和慢性肝病的潜力，因此开发此类药物也是治疗 MASH 的可行策略。胆汁酸衍生配体 BAR502（图 S1）为这一策略提供了概念验证；它是一种 FXR/TGR5 双重激动剂，并在临床前模型中显示出疗效。相关类似物也提供了重要的构效关系信息：BAR501（图 S1）通过 7-OH 和 6-Et 的异构化获得，表现为选择性 TGR5 激动剂而不激活 FXR，证实 7α-OH 对 FXR 结合至关重要。相反，BAR704（图 S1）是一种 3-脱氧衍生物，作为选择性 FXR 激动剂发挥作用，提示 3α-OH 对 TGR5 激活具有关键作用。这些构效关系共同表明，同时保留 3α-OH 和 7α-OH 基团，是维持 FXR/TGR5 平衡双重激动活性的关键。
基于这些关键的结构—功能认识，下一代 FXR 激动剂的开发需要采取双目标优化策略：一方面增强疗效，另一方面减少副作用。首先，应采用基于结构的药物设计（SBDD）方法，以提高效力和疗效，并优化药代动力学特征，从而降低临床剂量。与此同时，基于结构的选择性优化对于消除 MRGPRX4 交叉激活风险至关重要，这对于减轻未来 FXR 激动剂在临床应用中可能出现的瘙痒相关不良反应具有重要意义。
图 1. 代表性 FXR 激动剂的化学结构。
02
重要发现及亮点
2.1. 理性设计
选择性 FXR 激动剂的开发需要同时关注两个方面：既要保持对 FXR 的高亲和力，又要尽量减少脱靶相互作用，尤其是降低或消除与 MRGPRX4 的相互作用。OCA 与 FXR-LBD 复合物的 X 射线晶体结构显示，OCA 的甾体母核占据疏水口袋（S1），而末端羧基部分延伸至两个不同的潜在亚口袋方向：一个是“后门”位点（S2，由 Tyr257、Phe298 和 Thr383 构成），另一个是溶剂暴露区域。这种结合模式通过疏水相互作用和特异性氢键稳定 FXR 的活性构象，从而促进共激活因子募集。
鉴于羧基是许多 FXR 激动剂的共同结构特征，并且已被认为可能是激活 MRGPRX4 的潜在药效团，本研究的设计策略聚焦于修饰侧链拓扑结构，以利用 FXR 与 MRGPRX4 亚口袋结构之间的细微差异。
为探究 OCA 激活 MRGPRX4 的结构基础，研究构建了 OCA 与 MRGPRX4 的结合模式（图 2B）。结果显示，OCA 与 MRGPRX4 的相互作用模式与 MS47134 相似（图 S3）。两种配体的羧基部分几乎完全重叠（图 2C），提示羧基可能是激活 MRGPRX4 的关键药效团。OCA 的甾体骨架与 Val99、Trp158、Ile239、Tyr240、Leu246、Glu247 和 Leu249 等疏水残基相互作用，通过疏水作用维持结合模式的明显稳定性。OCA 柔性侧链发生约 90° 翻转，使其羧基能够与 Arg82 形成盐桥，并与 MRGPRX4 中的 Tyr254 和 Tyr250 形成氢键相互作用。此外，该侧链进一步伸入一个由 Phe78、Ile81、Arg82、Leu85、Ile90、Arg95、Leu98、Val99 和 Met102 构成的狭窄疏水亚口袋。
FXR 与 MRGPRX4 亚口袋结合位点中的细微差异，为选择性 FXR 激动剂的理性设计提供了坚实的结构基础。因此，构效优化工作将 OCA 侧链作为提高选择性的关键修饰位点。
为减轻 MRGPRX4 的脱靶激活，研究者试图通过去除侧链中的羧基来降低设计分子与 MRGPRX4 的结合亲和力。OCA 侧链中的羧基被酰肼基团替代，以施加构象限制，从而有效限制侧链翻转。这一结构修饰得到化合物 7（图 2D 和图 S4），其对 MRGPRX4 的对接评分显著低于先导结构（Glide XP Score：−5.63 kcal/mol；OCA 为 −7.17 kcal/mol，表 S1）。然而，这一改变也导致其 FXR 激动活性下降约 3 倍；在荧光素酶报告基因实验中，化合物 7 在 10 μM 时的效能仅为 OCA 的 32%。因此，为了在保持 FXR 活性的同时进一步降低 MRGPRX4 结合，研究者在酰肼侧链末端引入了结构不同的基团。该策略旨在通过空间位阻阻碍其与 MRGPRX4 相互作用，同时维持其与 FXR-LBD 内关键位点的接触。在这一思路指导下，研究者系统优化了 OCA 衍生侧链结构，并合成了一系列聚焦型类似物，用于评价其 FXR 特异性药理性质。
图 2. 非羧酸甾体类 FXR 激动剂的设计策略：（A）基于 OCA 的结构设计策略进行新型 FXR 激动剂的理性设计；（B）OCA 在 MRGPRX4 中的预测结合模式；（C）MS47134 与 OCA 在 MRGPRX4 中的叠合对接模拟；（D）OCA 与化合物 7 在 MRGPRX4 中的叠合对接模拟。
2.2. 构效关系
本研究采用两种独立实验评价所合成化合物的体外 FXR 激动活性，以确定半数最大有效浓度（EC₅₀）和最大激动效能。首先，采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）共激活因子募集实验，直接定量配体诱导的 FXR 与共激活因子肽之间的相互作用。该均相实验使用铽标记抗 GST 抗体、荧光素标记共激活因子肽和 GST 标记 FXR-LBD，以测量化合物亲和力和效能。TR-FRET 中的 EC₅₀ 和效能主要反映化合物对 FXR-LBD 的内在结合亲和力。此外，研究还在 HEK-293 细胞中进行 FXR 驱动的荧光素酶报告基因实验，这些细胞共同转染人 FXR 表达质粒和相应报告构建体。该实验得到的 EC₅₀ 和效能用于评价细胞水平的功能活性，即通过完整转录级联反应测量受体激活。在两种实验中，均以 OCA 作为参照激动剂，并将 10 μM OCA 的反应定义为 100% 效能。
受到化合物 7 与 MRGPRX4 复合物相互作用减弱的启发，研究者以化合物 7 为基础，在 R1 位系统评价了多种酰基或磺酰基取代衍生物，以探索 FXR-LBD 亚口袋的空间耐受性。表 1 总结显示，乙酰基取代（8）显著削弱 FXR 激活。相反，苯甲酰衍生物（9）在两种实验形式中均较母体化合物 7 表现出增强的 FXR 激动活性。值得注意的是，化合物 9 在荧光素酶报告基因实验中的细胞激动活性更强，EC₅₀ 为 489 ± 11 nM，而 OCA 为 688 ± 10 nM。然而，在苯甲酰环对位引入甲基（10）、甲氧基（11）、氟（12）和叔丁基（13）取代基会削弱 FXR 激动活性，在荧光素酶报告基因实验中其效力低于 OCA。
使用磺酰胺生物电子等排体延长侧链（14—18）总体上导致 TR-FRET 实验中的激动效力下降，其中仅未取代苯基磺酰胺 15 表现出中等活性。化合物 9 和 15 在荧光素酶报告基因实验中的 EC₅₀ 值相近，但在 TR-FRET 实验中显示出明显不同的结合亲和力。化合物 9 的内在结合亲和力（TR-FRET 实验 EC₅₀ = 97 ± 15 nM）为其作为进一步优化的化学起点提供了可量化依据。
基于上述结果，并认识到改变侧链构象翻转有助于降低与 MRGPRX4 的相互作用，研究者提出了一种新的构象限制策略：通过碳酰肼骨架的分子内环化实现构象约束。该方法在相当于 C24 的位置引入芳香杂环，以介导受体激活。
研究者进一步探索了以杂原子替代 5-吡唑啉酮核心 4 位亚甲基的策略，以增加极性并改善其与 FXR-LBD 亲水性亚口袋的互补性。由此得到 1,3,4-噁二唑衍生物 21—27。表 2 显示，引入苯基（21）、乙氧羰基（22）、羧基（23）或羟甲基（24）取代基后，FXR 激活效力显著降低，在荧光素酶报告基因实验中相对于 OCA 的激动效能仅为 4%—40%。1,3,4-噁二唑-2(3H)-酮衍生物 25 表现出中等激动活性（荧光素酶报告基因实验：EC₅₀ = 575 ± 47 nM，Emax = 67%），而 2-氨基-1,3,4-噁二唑衍生物 26 表现为弱至中等活性。
1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮衍生物 27 则成为与 OCA 相比 FXR 激动活性明显更强的化合物。在 TR-FRET 实验中，化合物 27 对 FXR 配体结合结构域显示出高结合亲和力（EC₅₀ = 10 ± 3 nM，Emax = 133%；OCA 为 100%）。这种结合活性有效转化为细胞转录激活能力，荧光素酶报告基因实验显示其 EC₅₀ = 128 ± 9 nM，Emax = 125%（OCA 为 100%）。虽然细胞中诱导完整转录反应需要略高浓度，但该化合物在生化实验和功能实验中均表现稳定而强效，凸显了化合物 27 进一步开发的潜力。
随后，研究者进一步探索了含硫羰基杂环，得到 1,2,4-三唑（28）和 1,3,4-噻二唑（29）衍生物。与 1,3,4-噁二唑衍生物 27 中氧原子的氢键受体能力和高电负性相比，1,3,4-噻二唑衍生物 29 中的硫原子作为较弱氢键受体，可能是其结合亲和力降低的主要原因。此外，1,2,4-三唑衍生物 28 活性显著降低，可能是由于 NH 部分的阳离子化特征与目标结合口袋中以受体驱动为主的环境不相容。总体而言，表 2 所示构效关系证实，策略性引入氢键受体基团，尤其是在构象受限的五元芳香环上引入化合物 27 中的硫羰基部分，是获得高 FXR 激活效力和效能的关键。芳香杂环提供的稳定性进一步支持其作为高级先导候选物的潜力。
为了实现 FXR 相对于 MRGPRX4 的选择性激动，研究者在化合物 27 末端位置引入具有较大空间体积的苄基，并系统评价不同取代基对 FXR 激动活性的影响。所合成的一系列化合物中，带羧基的化合物 43 在 FXR 荧光素酶报告基因实验中的 EC₅₀ 为 330 ± 24 nM。相反，异丙基（39）、叔丁基（40）和叔丁酯（42）等体积较大的取代基导致 FXR 活性显著下降，这可能是由于它们在结合口袋内产生空间冲突。未取代衍生物（30）和甲基取代类似物（31）仍保持较强 FXR 激动活性，提示较小基团更容易被配体结合位点容纳。
鉴于苄基取代衍生物（30—44）表现出中等 FXR 活性，研究者随后设计了一组空间需求更低的类似物。该聚焦化合物库引入了紧凑的脂肪链和五元呋喃杂环，旨在系统探究 FXR-LBD 对空间和电子性质的耐受性，并进一步细化 FXR 激活的构效关系。
甲基取代（45，Emax = 54%）使细胞效能低于 OCA，而氘代甲基（46，Emax = 72%）则提高了活性。烯丙基衍生物 47 表现出高效力（EC₅₀ = 158 ± 14 nM，Emax = 104%），其柔性链可在 FXR-LBD 中形成疏水接触。相反，刚性炔丙基（48）和氰乙基（49）基团降低了效能。极性取代基可能增强激动效力：羟乙基衍生物 50（EC₅₀ = 270 ± 22 nM）可向 His341 提供氢键（图 S5）。在含氟衍生物中，二氟乙基 53（Emax = 97%）优于二氟甲基 52（Emax = 7%），提示存在活性陡变现象。在所有设计化合物中，化合物 27、47 和 50 作为 FXR 激动剂表现出理想性质和纳摩尔级效力，因此被选为有吸引力的药理工具分子，用于进一步研究。
2.3. 化学合成
化合物 7—18 的合成过程见方案 1。简言之，OCA 在 EDCI·HCl/HOBt 介导下与乙酰肼或多种对位取代苯甲酰肼缩合，得到酰基乙酰肼 8 和酰基苯甲酰肼 9—13。中间体 2a 由 OCA 与 Boc-肼在类似的 EDCI·HCl 活化条件下制备。随后，使用浓盐酸/甲醇对 2a 进行 Boc 脱保护，得到化合物 7。最后，化合物 7 与多种磺酰氯发生亲核取代反应，得到目标磺酰肼衍生物 14—18。
如方案 2 所示，在 Novozyme 435（N435）催化下，对 OCA 的 C3 位进行区域选择性乙酰化，得到中间体 2b。2b 与 Meldrum 酸缩合得到酰基 Meldrum 酸中间体 2c。2c 在甲醇中回流得到 β-酮酯 2d。2d 与肼衍生物在乙醇中回流发生环缩合，完成吡唑啉酮核心构建，得到甲基和苯基取代吡唑啉酮 19 和 20。
如方案 3 所示，在碱性条件下对甲酯 2e 的 C3-羟基进行选择性硅基保护，得到保护中间体 2f，产率为 90%。随后，2f 在甲醇中与水合肼发生肼解，得到关键酰肼中间体 2g，产率为 93%。2g 再与苯甲酰氯发生酰胺化反应，得到化合物 2h。以 p-TsCl 作为脱水剂进行分子内环脱水，得到化合物 2i。最后，用 TBAF 脱保护，得到目标产物 21。
化合物 22—24 按照与 21 类似的路线制备，见方案 4。所得化合物 22 在 LiOH 溶液中水解，以 86% 产率得到化合物 23。最后，在 0 °C 下用 BH₃·Me₂S 选择性还原羧基，得到目标化合物 24。
化合物 25—27 的合成路线见方案 5。关键酰肼中间体 2g 与 CDI 加热发生分子内环化，得到中间体 2l。随后用 TBAF 脱除 TBS 保护基，得到目标化合物 25。2g 与 BrCN 反应后，伯胺发生亲核取代形成单取代氨基腈。随后在加热条件下，氰基水解引发分子内环化，构建 2-氨基-1,3,4-噁二唑骨架。经同样的 TBAF 脱保护流程得到目标化合物 26。在碱性条件下，2g 与 CS₂ 反应生成稳定的二硫代碳酸钾中间体。加热发生分子内环化，得到中间体 2n。最后用 TBAF 脱除 TBS 保护基，得到目标化合物 27。
目标化合物 28 和 29 的合成见方案 6。OCA 与氨基硫脲缩合，高效得到酰基中间体 2o。随后在碱性条件下环化，得到目标化合物 28。对于化合物 29，中间体 2g 与 CS₂ 反应生成二硫代碳酸钾中间体。使用浓硫酸作为脱水剂进行分子内脱水环化，同时去除 TBS 保护基，得到目标化合物 29。
如方案 7 所示，在 DMF 和 MeCN 的极性非质子混合溶剂中、碱性条件下，化合物 27 与多种烷基卤化物发生亲核取代反应，得到相应目标产物。对于化合物 52，其二氟甲基硫醚部分通过文献方法引入：先与 BrCF₂COONa 发生亲核取代，随后经热脱羧得到产物，分离产率为 43%。
2.4. 选定化合物的药代动力学研究
药代动力学（PK）研究对于阐明药物在体内的行为、优化给药剂量和给药方案具有重要作用，并能为药物开发提供重要指导。因此，研究者考察了 3 个临床前候选化合物 27、47 和 50 的 PK 性质，主要药代动力学参数见表 5。口服给药后，化合物 27 显示出最高的药物暴露量（AUC₀–t = 11000 ± 4270 h·ng/mL）和最慢的血浆清除率（CL = 931 ± 318 mL/h/kg）。这些结果支持化合物 27 在 SD 大鼠中具有良好的吸收和分布特征。化合物 27 在 SD 大鼠中具有较高口服生物利用度（F = 70.3%），提示其胃肠通透性优良。总体来看，这些数据表明化合物 27 在 SD 大鼠中具有相对有利的药代动力学性质，表现为较高吸收与分布，以及较低清除率。
2.5. 组织分布谱研究
考虑到 FXR 主要表达于肝脏和肠道，观察到化合物分布于这两个组织具有药理学意义。口服给药后，化合物 27 在给药后 1 h 即在肝脏中达到较高浓度，肝/血浆浓度比（L/P）为 24.9（表 6）。到 4 h 时，该比值仍维持在 22.5，说明其对主要靶器官具有持续且优先的分布。同时，在回肠中也检测到可测浓度，1 h 时回肠/血浆浓度比（I/P）为 1.2。以血浆浓度反映的系统暴露量从 1 h 到 4 h 明显下降，组织浓度也相应降低，提示其经历了相对快速的清除阶段。较高且持续的 L/P 比值，加上血浆水平快速下降，提示化合物 27 能被肝脏高效摄取并随后清除；这种分布特征可能有助于在维持作用部位疗效的同时限制系统暴露。
总体而言，组织分布数据支持化合物 27 能在 FXR 相关组织中获得相当暴露，并且明显偏向肝脏分布。高肝脏浓度和快速清除的药代模式，可能有利于作为肝脏靶向治疗药物。
2.6. 细胞毒性实验
通过 CCK-8 实验进行细胞毒性分析（图 S6）显示，化合物 27 在 40 μM 时对 HEK293 细胞无明显细胞毒性，IC₅₀ 为 82.8 μM。同样，在 80 μM 时，它对 HEK-293T 细胞也未诱导可检测的细胞毒性（IC₅₀ > 100 μM）。总体而言，这些数据表明化合物 27 在哺乳动物细胞模型中具有良好的安全性特征。
2.7. 核受体选择性
在荧光素酶报告基因实验中，化合物 27 对其他关键核受体未表现出明显激动活性，具体包括 LXRα、RXRα、RXRβ 和 THRβ（表 7）。这些结果提示化合物 27 对 FXR 具有较高选择性。当然，仍需进一步研究，以更全面地表征其对其他受体类型的选择性谱。
2.8. 化合物 27 对 MRGPRX4 激动活性的评价
研究者采用钙动员实验评价所选化合物对 MRGPRX4 的激动活性（表 8），以 DCA 作为阳性对照（EC₅₀ = 279 nM），并将其在 10 μM 时的激动效能定义为 100%。化合物 27 在 90 μM 时表现出 32% 的部分激动效能，EC₅₀ 为 25685 nM。相比之下，OCA 的激动效能为 61%，EC₅₀ 为 5379 nM。选择性指数（SI）定义为 MRGPRX4 与 FXR 的 EC₅₀ 比值。OCA 的 SI 约为 8（5379/668）。值得注意的是，化合物 27 的 SI 显著更高，为 201（25685/128），与 OCA 相比选择性提高约 25 倍。基于其对 FXR 相对于 MRGPRX4 更高的选择性指数（化合物 27：SI = 201；OCA：SI = 8），化合物 27 可被视为具有潜在更优治疗窗口的候选物。
虽然钙流实验能够可靠测量与急性瘙痒相关的主要 Gq 偶联信号，但对该受体调控特征的更完整理解仍需后续研究。此外，尽管化合物 27 的结构优化已显著降低其相对于 OCA 的 MRGPRX4 活性，但仅凭体外数据尚不能完全排除残余的、低于阈值的活性。因此，这一新化学类型应被理解为降低而非彻底消除 MRGPRX4 介导瘙痒风险。其较高的体外选择性为潜在更优治疗窗口提供了强有力的机制依据。然而，是否真正具有无瘙痒特征，仍需在经过验证的体内瘙痒模型中进一步确认。
2.9. 化合物 27 的 TGR5 激动活性评价
在 hTGR5 受体激活实验中（表 9），化合物 27 表现出明显的激动效能（EC₅₀ = 1360 nM，Emax = 151%），优于 OCA（EC₅₀ = 2826 nM，Emax = 142%）。此外，化合物 27 对 rTGR5 的最大激活效能达到 140%，显著高于 OCA（67%）。值得注意的是，人类瘙痒主要与 MRGPRX4 信号通路相关，而非 TGR5 激活。因此，化合物 27 的 TGR5 补充激活作用可能与其 FXR 激动作用一起，增强对 MASH 症状的整体改善。
重要的是，虽然 BAR502 和 OCA 都是有效的 FXR/TGR5 双重激动剂，但 OCA 中的胆汁酸核心和羧酸盐基团与 MRGPRX4 激活有关。相反，不含羧酸的 BAR502 在 17α-乙炔雌二醇小鼠瘙痒模型中未诱发抓挠行为。基于这一点，化合物 27 被设计为一种不同的非羧酸甾体骨架，其极性头部为构象受限的 1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮。该有意设计的结构修饰旨在主动破坏与 MRGPRX4 的关键相互作用。通过有效参与 TGR5 介导的通路，同时避免 MRGPRX4 相关瘙痒风险，这种双通路优化策略使化合物 27 成为下一代候选物：既能实现 FXR 激活和协调性代谢调节，又可能具备更优的瘙痒安全性特征。
2.10. 化合物 27 在 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中的体外疗效
研究者在脂多糖（LPS）诱导的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中考察了化合物 27 的抗炎活性及其潜在机制。首先通过 CCK-8 实验评价细胞毒性，结果证实化合物 27 在最高 60 μM 浓度下不会显著影响细胞活力（图 3A）。LPS 刺激显著升高培养上清中的亚硝酸盐水平；亚硝酸盐是一氧化氮（NO）的稳定代谢物，可作为炎症激活指标。在 LPS 刺激前 1 h 预处理化合物 27，可显著抑制亚硝酸盐升高，其抑制作用强于 OCA（图 3B）。
此外，化合物 27 明显下调促炎标志物 Tnf、Adgre1 和 Cyp8b1 的 mRNA 表达，同时上调核受体 Nr1h4（FXR）的表达（图 3C）。与 FXR 通路参与相一致，化合物 27 还提高了抗氧化反应相关基因 Hmox1 和 Nqo1 的 mRNA 水平，并观察到 Nrf2 有相应升高趋势（图 3D）。这些结果提示，化合物 27 的抗炎活性至少部分可能通过 FXR 激活及随后增强细胞抗氧化反应实现。
总体而言，化合物 27 能有效抑制 RAW264.7 巨噬细胞中的 LPS 诱导炎症。其抗炎活性与体外低细胞毒性共同支持其作为有前景治疗候选物继续研究。
图 3. 化合物 27 在 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中的处理效果：（A）通过 CCK-8 实验评价不同剂量化合物 27 对 RAW264.7 细胞活力的影响；（B）化合物 27 降低亚硝酸盐水平，亚硝酸盐作为 NO 生成标志物；（C、D）通过 qPCR 分析相关基因，每组基因表达水平均归一化至 WT 组。所有数据以均值 ± SD 表示（n = 3—6）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用单因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比较事后检验分析。
2.11. 化合物 27 在 CCl₄ 诱导肝纤维化模型中的体内疗效
研究者通过每周两次腹腔注射 CCl₄、连续 4 周，在小鼠中诱导肝纤维化（图 4A）。与正常对照组相比，CCl₄ 模型组血清 TBA 和 TBIL 水平显著升高（图 4B），提示胆汁酸代谢紊乱和胆红素排泄受损。正常对照组肝组织的天狼星红染色显示（图 4C），肝细胞形态保持良好，肝小叶结构完整，肝索呈放射状排列，未见胶原沉积。相比之下，CCl₄ 诱导纤维化模型组表现出严重结构破坏，特征为宽大的胶原隔连接多个汇管区和中央静脉，符合桥接纤维化表现，同时纤维化面积显著增加。
为量化肝组织中的胶原沉积，研究者使用 AIPathwell v2 测量天狼星红染色切片中的胶原阳性面积。OCA 处理可部分溶解汇管区胶原隔并减少纤维化面积，但局部纤维束仍然存在。值得注意的是，化合物 27 处理显著减轻了纤维化病理表现，表现为汇管区胶原隔变薄、桥接结构减少，并且经天狼星红定量证实胶原沉积显著降低（图 4D）。一致地，羟脯氨酸定量结果显示，与 OCA 组相比，化合物 27 处理显著降低肝脏总胶原含量（图 4E）。总体而言，这些结果表明，化合物 27 能通过恢复肝实质完整性并抑制细胞外基质积累，有效改善 CCl₄ 诱导的肝纤维化。
图 4. 化合物 27 在 CCl₄ 诱导肝纤维化小鼠中的处理效果：（A）实验设计示意图；（B）血清学数据；（C）通过天狼星红染色进行肝组织病理学分析；（D）天狼星红染色阳性面积定量；（E）肝组织中羟脯氨酸含量检测。所有数据以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用单因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比较事后检验分析。
2.12. 化合物 27 在 ANIT 诱导胆汁淤积性肝损伤模型中的体内疗效
研究者进一步在 ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤模型中开展体内药效学评价，实验设计见图 5A。如图 5B 所示，与正常对照相比，ANIT 模型组中与胆汁淤积和肝损伤相关的血清生物标志物明显升高。OCA 处理使 ALP 水平中度下降，并显著降低 TBA；但对 ALT、AST 和 TBIL 的影响很小。相反，化合物 27 能有效使所有检测参数恢复至接近正常对照组水平。
H&E 染色切片中的肝损伤由 Servicebio 采用四级评分系统进行评价（表 S4）。H&E 染色病理分析（图 5C）显示，正常对照组小鼠肝结构保持完整，肝细胞形态规则，核质比平衡。相比之下，ANIT 模型组小鼠肝结构破坏，出现明显嗜酸性坏死灶，并在汇管区可见显著炎症浸润。OCA 处理可部分恢复组织结构，但仍存在残余炎症；而化合物 27 处理则使组织学形态接近正常，坏死或炎症极少。组织病理学评价（图 5D）证实，与 ANIT 模型组相比，化合物 27 显著改善肝细胞损伤。化合物 27 处理明显改善 ANIT 诱导胆汁淤积性肝损伤模型中的肝坏死、纤维化和炎性细胞浸润。这些结果显示其对肝损伤具有强保护作用，并突出其作为胆汁淤积性肝损伤高效治疗药物的潜力。
图 5. 化合物 27 在 ANIT 诱导胆汁淤积小鼠中的处理效果：（A）实验设计示意图；（B）血清学数据；（C）通过 H&E 染色进行肝组织病理学分析，其中坏死以红色箭头表示，炎症以蓝色箭头表示，出血以黑色箭头表示；（D）肝损伤组织病理学评分。所有数据以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用单因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比较事后检验分析。
2.13. 化合物 27 在 WD 与 CCl₄ 共诱导 MASH 模型中的体内疗效
鉴于候选化合物 27 在细胞水平显示出 FXR/TGR5 双靶点激动作用，研究者进一步使用 WD 与 CCl₄ 共诱导的 MASH 模型，在复杂生理环境中评价其抗 MASH 疗效，实验流程见图 6A。与正常对照组相比，模型组肝重/体重比、腹股沟脂肪组织/体重比和附睾脂肪组织/体重比显著升高，同时肝脏 TC 和 TG 水平升高（图 6B）。化合物 27（20 mg/kg）显著降低腹股沟和附睾脂肪组织/体重比，使其达到与正常组相当的水平，且无统计学显著差异。值得注意的是，OCA 和化合物 27 均明显减少肝脂质积累，其中化合物 27 的作用更为明显。
组织病理学分析（图 6D）进一步证实，WD 与 CCl₄ 共诱导模型产生了严重 MASH 特征，包括脂肪变性、炎症、肝细胞气球样变和肝纤维化。小鼠肝组织 H&E 染色显示大量细胞质脂滴空泡，并经油红 O 染色进一步验证（图 6D）。此外，MASH 小鼠肝小叶中也明显观察到炎性细胞浸润和肝细胞气球样变。相比之下，OCA 和化合物 27 均显著改善脂肪变性、小叶炎症和气球样变。采用 NAFLD 活动度评分（NAS）进行定量评估，其中 NAS ≥ 5 定义为 MASH，NAS < 3 则排除 MASH。实验结果显示，OCA 和化合物 27 均显著改善肝脂肪变性和小叶炎症。此外，化合物 27（20 mg/kg）还改善肝细胞气球样变，其疗效显著优于 OCA（图 6F）。
研究者使用 AIpathwell v2 对感兴趣区域内胶原纤维面积与总组织面积之比进行定量。与正常对照组相比，模型组表现出典型纤维化特征，包括天狼星红染色显示胶原沉积增加，以及 α-SMA 阳性面积扩大（图 6H）。OCA 和化合物 27 均明显减轻纤维化；定量分析显示，OCA 使纤维化胶原面积比例相对于模型组降低 30%，而相同剂量的化合物 27 降低超过 50%，提示其抗纤维化作用更强（图 6G）。
线粒体功能障碍在 MASH 发病机制中发挥核心作用。肝细胞透射电镜观察显示，与正常对照相比，模型组出现明显线粒体超微结构改变，表现为显著肿胀、外膜破坏以及嵴结构广泛丧失，提示线粒体功能受损。化合物 27（20 mg/kg）显著改善线粒体损伤（图 6E）。最后，与正常对照组相比，模型组血清生物标志物（ALT、AST、TBA、TC、HDL 和 LDL）显著恶化。OCA 或化合物 27 处理均显示出有益变化：所有生物标志物均显著下降，其中化合物 27（20 mg/kg）的改善最为明显（图 6C）。
综合上述数据，化合物 27 是一种值得进一步研究的有效候选物，可用于 MASH 治疗；临床前研究提示其具有克服 OCA 相关局限的潜力。
图 6. 化合物 27 在 WD 与 CCl₄ 共诱导 MASH 小鼠中的处理效果：（A）实验设计示意图；（B）体重、组织重量比和肝脂质水平；（C）血清生化参数；（D）通过 H&E、油红 O、天狼星红染色和 α-SMA 免疫组化进行肝组织病理学分析；（E）肝组织透射电镜图像，其中细胞核（N）、线粒体（M）、细胞质脂质（黄色箭头）和线粒体损伤（红色箭头）；（F）NAFLD 活动度总评分；（G）天狼星红染色阳性面积定量；（H）α-SMA 免疫组化阳性面积定量。所有数据以均值 ± SD 表示（n = 6—8）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用单因素 ANOVA 及 Dunnett 多重比较事后检验分析。
2.14. 分子动力学模拟分析
为阐明 FXR 与化合物 27 相互作用的分子机制，研究者首先对化合物 27 与 FXR（PDB：1OSV）进行分子对接，以建立初始结合构象，随后进行 100 ns 分子动力学（MD）模拟，以优化蛋白—配体相互作用。生产模拟阶段中，FXR 的 Cα 原子和化合物 27 重原子的 RMSD 如图 7A 所示。约 40 ns 后 RMSD 值达到平台期，说明体系达到平衡，并确认复合物收敛（表 S5）。作为甾体类 FXR 激动剂，化合物 27 完全占据 FXR 配体结合结构域的 S1 口袋（图 7E）。3α-OH 基团与 Tyr358 和 His444 形成稳定氢键，而 7α-OH 基团与 Ser329 和 Tyr366 形成双重氢键网络。化合物 27 的噁二唑部分精确替代 OCA 的羧酸片段，并与 Arg328 形成氢键。同时，Arg328 质子化胍基与噁二唑环之间形成阳离子—π 相互作用。
研究者通过结合自由能分解解析各残基对能量的贡献，以阐明关键相互作用位点。在 FXR-OCA 复合物中，Met262、Thr267、Leu284、Met287、Ala288、Met325、Arg328、Ser329、Ile332、Leu345、Ile349、Tyr358、Met362 和 Phe363 等残基表现出显著能量贡献（图 7F），提示 OCA 通过疏水相互作用、氢键和静电作用稳定复合物。Arg328 的显著能量贡献（−2.18 ± 0.99 kcal/mol）主要来自其侧链与 OCA 羧基之间的静电相互作用。相比之下，FXR-27 复合物中 Met262、Thr267、Leu284、Met287、Ala288、Met325、Ser329、Ile332、Leu345、Ile349、Tyr358、Met362、Phe363、His444 和 Met447 表现出明显能量贡献（图 7F）。然而，Arg328 的贡献降低（−1.49 ± 0.68 kcal/mol），说明化合物 27 通过去除羧酸基团降低了对精氨酸的依赖。同时，其与 Met262、Met287、Phe363、Ile332 和 Met447 的疏水相互作用显著增强。
研究者还构建了 OCA 和化合物 27 与 MRGPRX4 的结合模式，并进行 100 ns MD 模拟，以表征其结合特征。在 MRGPRX4-OCA 复合物中，甾体核心插入由 Val99、Trp158、Ile239、Tyr240、Leu246、Glu247 和 Leu249 形成的受体结合口袋（图 7H）。OCA 的 7α-OH 与 Lys96 形成氢键，而其羧基与 Arg82、Arg95、Tyr250 和 Tyr254 形成多残基氢键网络。此外，羧基与 Arg82 和 Arg95 之间形成的盐桥相互作用显著增强复合物稳定性。轨迹分析显示，在 20—90 ns 时间范围内，该复合物 RMSD 稳定在 0.35—0.40 nm（图 7D），提示 OCA 在 MRGPRX4-OCA 复合物中具有稳定结合构象。相比之下，在化合物 27 中以噁二唑部分替代羧基会诱导侧链构象变化（图 7G），从而阻止其与 Arg82 或 Arg95 形成盐桥相互作用。噁二唑环仅与 Arg82 的胍基形成阳离子—π 相互作用。在 MD 模拟过程中，MRGPRX4-27 复合物 RMSD 轨迹表现出显著不稳定性（图 7C 和表 S5），说明配体结合姿势发生较大动态波动，导致其无法与受体形成稳定复合物。
研究者采用 MM/PBSA 方法计算 OCA 结合和化合物 27 结合复合物的结合自由能，为基于结构的药物设计提供关键能量学信息。如表 10 所示，与 FXR-OCA 复合物（ΔE_TOTAL = −53.57 ± 4.00 kcal/mol）相比，FXR-27 复合物具有更低的总结合自由能（ΔE_TOTAL = −60.61 ± 6.69 kcal/mol），表明化合物 27 与 FXR 的结合稳定性更强。化合物 27 对 FXR 的高亲和力主要来源于优化后的疏水互补性（ΔE_VDWAALS = −64.36 ± 1.10 kcal/mol），这与其在细胞荧光素酶报告基因实验中增强的功能效力相一致（化合物 27：EC₅₀ = 128 ± 9 nM；OCA：EC₅₀ = 668 ± 10 nM）。相比之下，MRGPRX4-27 复合物的 ΔE_TOTAL（−21.71 ± 7.02 kcal/mol）高于 MRGPRX4-OCA 复合物（−32.64 ± 13.80 kcal/mol），提示化合物 27 与 MRGPRX4 的结合亲和力较弱，这与其较低的受体激活效力一致。此外，OCA 的羧基与 MRGPRX4 结合口袋中带正电的静电势表面发生强静电相互作用（ΔE_EL = −24.86 ± 8.63 kcal/mol）。相比之下，化合物 27 的静电稳定作用显著较弱（ΔE_EL = −10.14 ± 0.77 kcal/mol），这与其在该受体上的激动活性降低一致。
图 7. 化合物 27 和 OCA 与 FXR（PDB ID：1OSV）及 MRGPRX4（PDB ID：7S8P）结合稳定性和相互作用特征的分子动力学模拟分析：（A—D）FXR-27（A）、FXR-OCA（B）、MRGPRX4-27（C）和 MRGPRX4-OCA（D）复合物在三次独立 100 ns MD 模拟中的 RMSD 曲线；（E）化合物 27 与 FXR 关键残基的相互作用；（F）FXR-OCA 和 FXR-27 复合物结合自由能分解；（G）化合物 27 与 MRGPRX4 关键残基的相互作用；（H）MRGPRX4-OCA 和 MRGPRX4-27 复合物结合自由能分解。数据以均值 ± SD 表示，n = 3。
2.15. 局限性与未来展望
本研究目前的范围尚未允许对 FXR 和 TGR5 信号通路之间潜在协同作用进行详细探索。双重激动剂活性背后的整合药理学机制仍有待全面阐明，这也是未来研究的重要方向。此外，研究者明确承认，尽管体外选择性特征强烈提示瘙痒风险降低，但最终仍需通过体内实验加以确认，这是后续研究的关键目标。因此，MRGPRX4 活性的降低应被视为一种可能拓宽治疗窗口的特征，而其最终验证将是该化合物继续开发路径中的必要下一步。
【Citation】:Zhang Z, Zheng X, Dong C, et al. Discovery of Non-Carboxylic Steroidal FXR Agonist as a Promising Preclinical Candidate for Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis.J Med Chem. Published online May 8,2026.
【贡献】★★★★★
本研究通过基于结构的药物设计（SBDD）策略开发了一系列非羧酸甾体类 FXR 激动剂，并系统探索了其构效关系。在合成的 50 个化合物中，化合物 27 是细胞荧光素酶报告基因实验中最有效的 FXR 激动剂（EC₅₀ = 128 ± 9 nM）。其较有前景的开发价值还得到药代动力学特征支持，包括较高口服生物利用度（F = 70.30%）。值得注意的是，化合物 27 对 MRGPRX4 的非期望激活作用很低，其选择性指数（SI = 201）比 OCA（SI = 8）高 25 倍。在 WD + CCl₄ 共诱导的 MASH 模型中，化合物 27 显著改善组织病理学指标和纤维化指标，效果优于 OCA。总体而言，化合物 27 通过优化有益的 FXR/TGR5 活性与 MRGPRX4 相关安全风险之间的平衡，兼顾疗效和安全性，为代谢性肝病提供了一种具有明确机制优势、具备临床转化潜力的候选化合物。
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