缺血性脑卒中发生后，外周免疫细胞会迅速进入脑损伤区域并参与炎症反应。其中，中性粒细胞是最早被募集到缺血脑组织的外周免疫细胞之一。中性粒细胞在卒中超急性期可快速产生活性氧（ ROS ），进而促进血管内皮损伤、血脑屏障破坏和炎症级联反应。然而，中性粒细胞在卒中早期为何会迅速发生 ROS 爆发，其背后的代谢调控机制仍不清楚。
近日 ， 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所陈乃宏、张钊和楚世峰团队在Cell Death & Differentiation在线发表题为A neutrophil-intrinsic CKLF1–PKM2 axis drives glycolytic flux for de novo DAG synthesis and pro-inflammatory ROS production的研究论文。该研究发现，中性粒细胞内CKLF1通过结合PKM2重塑糖酵解代谢，促进DAG-ROS信号轴激活，从而驱动卒中后中性粒细胞炎症募集和脑损伤。
CKLF1 在卒中超急性期中性粒细胞中迅速上调
研究团队首先检测了缺血性卒中患者外周血免疫细胞中 CKLF1 的表达。结果显示，在卒中发生后 5–8 小时 ，患者中性粒细胞中的 CKLF1 显著升高，约为健康对照的 5 倍 ，而到 24 小时基本恢复至基线水平。相比之下，单核细胞中的 CKLF1 在早期并未明显变化，而是在 24 小时后才出现升高。在小鼠脑缺血再灌注模型和光栓塞模型中，研究者也观察到类似现象。
进一步分析发现，中性粒细胞 CKLF1 水平与 ROS 水平高度相关。 CKLF1 缺失显著降低卒中后中性粒细胞 ROS 生成、 NETosis 以及 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-6 等炎症因子表达。这些结果提示， CKLF1 是卒中超急性期中性粒细胞 ROS 爆发和炎症激活的重要调控因子。
CKLF1 驱动中性粒细胞糖酵解重编程并促进 ROS 生成
为了探究 CKLF1 如何调控 ROS 生成，研究团队构建了特异性 敲除中性粒细胞 Cklf1 小鼠，并对卒中后 6 小时外周中性粒细胞进行了 转录组 和代谢功能分析。 RNA- seq 结果显示， CKLF1 缺失后，中性粒细胞中显著改变的通路主要富集于糖酵解 、 葡萄糖代谢 、 丙酮酸代谢 等通路。
利用 Seahorse 代谢分析实时监测中性粒细胞的糖酵解通量和 ROS 产生。结果显示，卒中后中性粒细胞糖酵解活性显著增强，而 CKLF1 缺失明显削弱糖酵解增强和 ROS 生成。进一步研究发现， CKLF1 并不是简单增加葡萄糖摄取，而是促进糖酵解通量进入 DAG 从头合成途径。 DAG 作为 PKC 内源性激活分子，可促进 p47-phox 磷酸化，驱动 NADPH 氧化酶复合体组装，从而诱导 ROS 产生。
CKLF1 直接结合 PKM2 四 聚体并稳定其糖酵解催化功能
PKM2 是糖酵解末端关键酶，负责催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。 PKM2 不同构象具有不同功能，其中四聚体形式主要负责糖酵解催化活性。研究团队通过 共免疫 沉淀、微量 热泳动 、分子对接和分子动力学模拟等方法发现， CKLF1 可直接结合 PKM2 四 聚体，而并非主要结合 PKM2 单体或二聚体。该相互作用可稳定 PKM2 四 聚体，增强其催化活性，从而维持高糖酵解通量。
在人源 HL-60 诱导分化的中性粒样细胞模型中， CKLF1 敲除显著降低 PKM2 四 聚体水平、 PK 活性、 DAG 生成、 p47-phox 磷酸化和 ROS 产生。重新表达 CKLF1 或激活 PKM2 四 聚体可恢复上述表型，进一步证明 CKLF1-PKM2 轴在中性粒细胞代谢炎症激活中的因果作用。
CKLF1 促进中性粒细胞黏附、募集并加重脑损伤
中性粒细胞 ROS 不仅会造成氧化损伤，还会增强中性粒细胞与血管内皮的黏附。研究团队利用 微流控 系统模拟血流剪切环境，发现卒中后中性粒细胞黏附能力显著增强，且黏附能力与细胞内 ROS 水平正相关。 CKLF1 缺失则显著降低中性粒细胞 ROS 水平和黏附能力。进一步通过 活体双 光子成像动态观察脑缺血半暗带血管中的中性粒细胞行为发现，中性粒细胞特异性敲除 Cklf1 可显著减少中性粒细胞的黏附、爬行和跨内皮迁移。机制上， CKLF1 缺失降低中性粒细胞表面整合素 αMβ2 表达，并减少缺血半暗带血管内皮 ICAM1 表达，从而削弱中性粒细胞与血管内皮的相互作用。更重要的是，中性粒细胞特异性 Cklf1 敲除可显著减小卒中后脑梗死体积、降低脑水肿，并改善运动、感觉和认知功能恢复。该保护作用在雌雄小鼠中均存在，提示其具有较稳定的治疗潜力。
靶向 CKLF1-PKM2 相互作用的纳米治疗策略
基于上述机制，研究团队进一步开发了一种靶向中性粒细胞的纳米治疗策略 CKLF1 的多肽 C19 ，用于竞争性阻断 CKLF1 与 PKM2 四 聚体的结合。为提高其稳定性和细胞内递送效率，进一步筛选获得订书 肽 形式 SP-C19-3 ，并利用工程化大肠杆菌外膜囊泡（ outer membrane vesicles, OMVs ）进行递送，构建了 C19@OMVs 纳米制剂。功能实验显示， C19@OMVs 能够有效打断 CKLF1-PKM2 结合，降低 PKM2 四 聚 体水平 和 PK 活性，抑制 DAG 合成、 p47-phox 磷酸化和 NADPH 氧化酶活化，从而减少 ROS 产生。在卒中模型中， C19@OMVs 治疗显著减少中性粒细胞募集和 αMβ2 表达，降低脑梗死损伤，并促进神经功能恢复。
该研究揭示了 CKLF1 不仅是传统意义上的趋化因子，也可作为中性粒细胞内源性代谢调控因子，直接参与糖酵解重编程 ， 并且 证明 CKLF1-PKM2 蛋白相互作用是抑制中性粒细胞病理性激活的潜在干预靶点 ， 提出利用工程化 OMVs 递送订书肽、靶向中性粒细胞胞内蛋白互作的新型治疗策略，为卒中及其他中性粒细胞驱动的炎症疾病提供了新的干预思路。
中国医学科学院药物研究所 阮元与范平龙博士为论文共同第一作者，楚世峰，张钊，陈乃宏 研究员 为共同通讯作者 。
原文链接： https://www.nature.com/articles/s41418-026-01754-1
制版人：十一
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