在园艺花卉植物的功能基因研究中，研究人员常常面临诸多挑战。农杆菌介导对植物的遗传转化、基因表达及后续分子生化检测等常取决于两个关键因素：转化效率以及目的基因在宿主中的正确表达与翻译。这些方面往往难以准确观察和评估，充分利用报告基因可以在一定程度上解决这些问题，从而提高园艺花卉功能基因研究和分子育种效率。
近日，上海师范大学明凤团队和深圳兰科中心王志才等合作在Plant Physiology在线发表了题为Palette—a system for visualizing the expression levels of target genes in orchids的研究论文，开发了一套利用可视化报告基因RUBY监测兰花靶基因表达水平的“Palette”系统。
近年来，多项研究已报道了甜菜红素报告基因RUBY在多种作物中的成功应用。然而，RUBY在兰科植物中的应用和稳定转化尚未见报道。研究团队将RUBY基因与标签蛋白结合，并选择兰科中最具代表性且商业价值最高的两个属——蝴蝶兰（Phalaenopsis）和石斛兰（Dendrobium）作为研究对象。通过监测RUBY在蝴蝶兰中的表达，研究人员成功实现了蛋白质表达水平的可视化。团队尝试将功能基因PeMADS4与RUBY直接融合（MADS4-R），但在烟草叶片和蝴蝶兰花瓣中均未观察到颜色积累和目的蛋白的表达。为此，他们借鉴了RUBY的设计策略，在蛋白标签和RUBY之间引入P2A自切割肽，构建了MADS4-PR载体（图1A）。结果表明，P2A的引入使得两个基因有效表达，从而促进了颜色积累和蛋白富集（图1BC）。这帮助研究人员精确识别分子实验的最佳取样时机，显著提高采样效率。研究团队进一步选择了参与花青素合成途径正向调控因子PeMYB2作为靶基因。利用这一系统成功在蝴蝶兰花瓣中实现了花青素和甜菜红素的共存，创造出了自然界中不存在的花色组合。通过调整含有PeMYB2和RUBY的农杆菌菌液注射比例，研究人员在花瓣上实现了两种色素的梯度积累，呈现出渐变色彩效果。
图1. 在蝴蝶兰中建立有效的靶基因表达监测系统并创造新型花色
兰花的遗传转化受到多种因素限制。研究团队利用类原球茎及愈伤组织作为遗传转化的受体材料，在蝴蝶兰（Phalaenopsis）中通过RUBY指示获得了阳性转化事件。携带PeARF18（一个潜在的花形态调控因子）的RUBY载体成功生成了多个转基因株系，并验证了靶基因的插入和表达上调。此外，研究人员还在铁皮石斛（Dendrobium catenatum）中成功获得了大量稳定表达RUBY的转基因再生芽和完整植株。由于兰花生长期长、再生困难，研究团队将进一步培育已筛选鉴定的红色阳性植株，让在自然环境条件下成长为多年生壮苗，以评估其各类性状的长期表现。
图2. 富含甜菜红素的铁皮石斛创制
研究人员借助这一系统，在同一组织中合成了自然界中不会同时共存的甜菜红素和花青素。通过混合这两种色素，使得研究人员能够如同艺术家在调色板上调色一样改变花色。因此，他们将这一系统命名为“Palette”（调色板），这也源自蝴蝶兰（P. aphrodite）的缩写（Pa）。
上海师范大学和深圳市兰科植物保护研究中心联培博士生杨振宇为该论文第一作者。上海师范大学明凤教授和深圳市兰科植物保护研究中心王志才副研究员为共同通讯作者。上海师范大学明凤教授实验室倪苏、张栖语、付童、庞深深等，深圳兰科中心孔德敏、王美娜，以及青州亚泰国际花卉公司张延亮、董春燕也参与了该研究。深圳市兰科植物保护研究中心、青州亚泰国际花卉公司为该研究提供了材料与技术支持。该研究得到了国家自然科学基金、山东省重点研发计划、深圳市科技创新委员会等项目的资助。
https://doi.org/10.1093/plphys/kiag281
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