气味制备
实验所用四种气味试剂（苯乙酮、正辛醛、蒎烯、柠檬烯）以矿物油为溶剂、临实验前按1%体积比新鲜配制；气味由自研嗅觉仪配合四通阀完成气路调控，常态下洁净空气持续通气、气味管路排空，试次期间阀门切换通入带味气流，试次结束后废气排空并恢复洁净空气供给。
实验开始前，将苯乙酮、正辛醛、蒎烯与柠檬烯四种气味试剂以1%比例溶于矿物油稀释备用。气味经由贯通小鼠鼻部的管路，随恒定气流送入。实验采用自研嗅觉仪控制气路，配备四通阀：单个试次中，阀组可切断排空气流、切换为带气味的供气；试次结束后，阀门切换将气味气体导回排空管路，换回洁净空气。
Fig1 四嗅素嗅觉厌恶条件化范式示意图
整体实验时序
（连续3天，固定顺序：预测试→条件化训练→正式测试）
实验动物全程使用头部固定+虚拟洞穴装置（除第二天训练在电击箱）
Day1：预测试（学习前基线检测）
1. 环境：小鼠固定于虚拟洞穴系统，无电击、无奖惩。
2. 试次结构：总共10个block，每block随机打乱4种气味顺序，单只动物合计40个试次。
3. 单试次参数：气味持续呈现8 s。
4. 刺激分组平衡设计：个体间平衡CS+/CS−分配，例：苯乙酮在A鼠为CS+（后续配对电击），在B鼠为CS−（无电击），消除气味本身先天偏好干扰。
5. 观测指标：记录颤抖、入洞行为；预测试阶段CS+候选气味与CS−候选气味诱发行为无统计学差异，证明气味本身不天然诱发恐惧避险。
Day2：厌恶条件化训练（电击配对建立条件恐惧）
1. 环境：更换Med Associates标准化电击箱体，栅格地板用于足底电击，配套强力真空抽气系统。
2. 刺激规则：4种气味每种重复呈现8次；
2种气味=CS+：气味结束同步施加0.7 mA足底电击；
剩余2种气味=CS−：气味出现全程无电击。
3. 试次间隔：ITI=3 min，真空泵快速抽走箱内残留气味，避免气味残留混淆条件关联。
4. 控制逻辑：Arduino控制气味发放，TTL脉冲信号触发电击控制器精准同步电击。
Day3：正式行为测试（恐惧表达检测）
1. 环境：回到Day1同款虚拟洞穴装置。
2. 试次范式：试次排布、block数量、气味时长（8 s）完全复刻预测试方案，仅此时CS+已通过训练成为厌恶条件刺激、CS−为中性对照。
3. 观测指标：量化CS+/CS−诱发的入洞幅度、入洞频次、颤抖时长/频率等行为差异。
关键控制要点
1. 气味偏置控制：跨小鼠轮换CS+归属，避免气味固有气味偏好干扰实验结果；
2. 残留气味排除：训练日强负压抽气+3 min长间隔，消除残留气味的跨试次污染；
3. 数据同步：气味触发时间、洞穴运动轨迹、气味浓度三者时间戳统一，便于后续行为刺激时序关联分析。
总结
相较于传统恐惧条件范式，本四嗅素模型可同步区分颤抖、入洞两种层级化防御行为，通过气味间CS+/CS−随机平衡消除先天嗅觉偏好干扰；依托头部固定与虚拟洞穴装置精准量化行为指标，还可兼容钙成像、呼吸监测等多模态同步记录，且测试阶段无电击刺激，能在消退环境下客观解析情绪神经编码。
该范式可依托气味诱发的恐惧泛化特点构建焦虑、PTSD动物模型，模拟创伤后恐惧泛化与过度警觉等病理表现以探究发病机制，同时通过CS+与CS−带来的颤抖、入洞行为变化量化药效，实现抗焦虑、抗PTSD候选药物的筛选与药效评估。
文献引用：
O’Neill, PK., Posani, L., Meszaros, J. et al. The representational geometry of emotional states in basolateral amygdala. Nat Neurosci (2026). https://doi.org/10.1038/s41593-026-02315-y
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