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一
Introduction
桃金娘科芳香植物岗松分布于澳大利亚至东南亚，除了用作观赏，还是食品和香料工业的重要原料。现代研究表明，岗松中含有挥发油、间苯三酚类、色原酮类和黄酮类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性；在民间常用于治疗炎症相关疾病，如高热、黄疸型肝炎、肠胃炎、膀胱炎和类风湿关节炎（RA）等。
RA是一种累及多关节滑膜炎病变为特征的全身性、自身免疫性疾病，其病程漫长、迁延反复、难以根治，在临床上常以西药维持治疗，但长期用药往往引起严重不良反应。天然植物或化合物在干预RA中独具优势，具有多靶点和多途径整合作用的特点，且毒性小成本低。据报道，岗松中化合物baeckein E在25~100 mg/kg的剂量范围内能显著抑制CIA小鼠的足趾肿胀，并缓解关节软骨基质的降解和炎症细胞浸润。
在中国南方常采集岗松叶制成“岗松茶”饮用，急性经口毒性实验表明，其甲醇、乙醇和水提取物均没有观察到死亡和不良反应，提示其作为人类食用的安全性。郑州大学药学院贾贝西副教授课题组，依托现有的抗RA天然药物研发平台，将网络药理学分析、分子对接与体内外实验验证相结合，探讨岗松抗RA活性成分及作用机制，为“岗松茶”在功能食品领域其保健价值开发提供科学依据。
二
Results and discussion
Part I基于CIA大鼠模型的岗松（BFL）抗RA药效学评价
采用牛Ⅱ型胶原和不完全弗氏佐剂混合乳化剂构建CIA大鼠模型，连续灌胃给药20天后，与模型组相比，各给药组对CIA大鼠的足趾肿胀度（图1B）、AI指数（图1E）、滑膜组织增生（图1F）、骨侵蚀（图1G）等病理情况有不同程度的改善作用；与阳性药TPT组相比，岗松（BF）治疗组的脾、胸腺指数显著降低（图1D），说明BFL对CIA大鼠免疫器官具有一定的保护作用；此外，BFL能显著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，同时增加IL-10含量（图1H-J），表明BFL对CIA大鼠具有良好的治疗作用。
图1 BFL对CIA大鼠的治疗作用。（A）体重变化；（B）足趾肿胀度变化；（C）足趾肿胀形态特征；（D）AI评分；（E）胸腺和脾脏指数；（F）组织病理学（H&E，箭头指示滑膜增生）；（G）关节影像学（X射线）；血清炎症因子水平：（H）TNF-α、（I）IL-6和（J）IL-10（J）。与空白组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01。
Part II BFL中抗炎活性成分筛选
BFL提取物经HPLC色谱分析可知，其中化合物杨梅素-3-O-α-L-鼠李糖苷（峰1）和5-羟基-7-甲氧基-2-异丙基色原酮（Chro，峰2）含量最为丰富，分别为8.4%和9.1%（图2）；采用LPS诱导的RAW264.7细胞模型，测定2 种化合物的抗炎活性，IC50值表明化合物Chro在减少NO、IL-6和TNF-α的分泌方面优于阳性药物地塞米松（表2），具有潜在的抗炎特性；因此，本文以化合物Chro为突破口来探索BFL抗RA的作用机制。
图2 BFL提取物HPLC分析及主要活性成分含量
表2 BFL中主要成分的抗炎活性
Part III Chro抗RA的网络药理学分析
通过SwissTargetPrediction、SEA、和TargetNet数据库，检索化合物Chro靶点136 个，从NCBI-Gene、GeneCards和DisGeNET数据库获得RA疾病相关基因1 489 个，二者取交集得到54 个共同靶点（图3A），作为化合物Chro抗RA的相关靶标。将这54 个共同靶点进行PPI网络分析可知，PTGS2、ESR1、CREB1、RELA（P65）、IL-2、PPARG、APP和AHR为化合物Chro抗RA的关键靶标（图3B）。对54 个交集靶点进行GO和KEGG富集分析，确定50 个GO条目，其中生物过程（BP）20 个，分子功能（MF）25 个和细胞组分（CC）5 个，将每个类别排名前20 条目绘成直方图（图3C）；KEGG分析出30 条相关通路（P-value < 0.1, FDR < 0.4），在排名前20的通路中，PI3K-Akt、Ras、破骨细胞分化、NF-κB、TNF等信号通路与RA疾病密切相关（图3D）。将54 个交集靶点与排名前20通路导入Cytoscape构建“化合物-关键靶点-作用通路”网络，进一步分析表明Chro主要通过PI3K-Akt信号通路调控关键靶标MAPK10、RELA、RAC1、CREB1和NOS2，在干预RA中发挥重要作用（图3E）；由于网络药理学预测的作用机制存在一定局限性，后续将优先考虑Count计数和Degree值最大的PI3K-Akt通路及其节点蛋白PI3K、PDK1、Akt和RELA作进一步的实验验证。
图3 化合物Chro抗RA的网络药理分析。（A）Chro和RA靶点的维恩图；（B）Chro抗RA的PPI网络图；（C）GO功能富集分析（Top 20）；（D）KEGG通路富集分析（Top 20）；（E）“化合物Chro-关键靶标-作通通路”网络图。
PartIV化合物Chro与关键通路蛋白的分子对接
分子对接用于评价化合物Chro与关键通路蛋白PI3K、PDK1、AKT和RELA之间的相互作用（图4），所有结合能均低于-5.0 kcal/mol，表明化合物Chro与这4 种蛋白具有良好的结合亲和力，可以自发结合形成复合物，Chro分子主要通过4-羰基、5-羟基和2-异丙基与相应的氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用。
图4 化合物Chro与关键蛋白（A）PI3K、（B）PDK1、（C）AKT和（D）RELA的结合位点及相互作用模式
PartV化合物Chro对RA滑膜成纤维细胞（RA-FLS）的作用及机制Chro对RA-FLS细胞活力、迁移和侵袭能力的影响
RA-FLS在RA的发病机制中起着关键作用，本文以此作为细胞模型开展实验。Chro的化学结构如图5A所示，药物作用24 h后，CCK-8检测结果显示，RA-FLS细胞的存活率以剂量依赖的方式受到抑制（图5B），0~50 μg/mL为Chro的无毒浓度、0~0.45 μg/mL为阳性药MTX的低毒浓度（细胞存活率 ≥ 60%），并以此设置后续实验浓度。RA-FLS可以迁移并侵入关节软骨和骨，导致软骨和骨的破坏以及关节损伤，通过Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力，结果显示，与对照组相比，Chro能显著抑制RA-FLS细胞的迁移和侵袭能力（P < 0.001，图5C-F）。
图5 Chro化学结构（A）。化合物Chro对RA-FLS（B）细胞活力、（C）迁移及（D）侵袭能力的影响。与对照组相比，***P < 0.001，****P < 0.000 1。
Chro诱导RA-FLS细胞凋亡和对细胞周期的阻滞作用
促进RA-FLS凋亡是RA的治疗策略，如图6A-B所示，化合物Chro可显著诱导细胞凋亡，抑制RA-FLS的过度增殖，并将其阻滞在G2/M期（4N）（P < 0.001）；此外，Western blot检测结果显示，Chro显著下调RA-FLS细胞中凋亡相关蛋白Cyclin B1、CDK1、CDK2、Mcl-1和Bcl-2的表达，而使G2/M期特征蛋白cleaved-Caspase 3表达增加（图6C）。
图6 化合物Chro对RA-FLS细胞（A）凋亡、（B）周期及（C）相关标志蛋白表达的影响。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，无显著性（P > 0.05）。
Chro抑制RA-FLS细胞中IL-6、IL-8、IL-1β、MMP-1、MMP-3和MMP-9的分泌
RA-FLS产生各种细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs），以促进炎症和关节破坏。以TNF-α（400 ng/mL）诱导RA-FLS细胞造模，ELISA试验表明，化合物Chro以浓度依赖的方式降低了细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8和MMP-3的水平（P < 0.05，图7A）；RT-qPCR结果显示，与模型组相比，Chro组IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3和MMP-9的mRNA表达显著降低（P < 0.001，图7B）。
图7 化合物Chro对RA-FLS细胞炎症因子及MMPs（A）分泌及（B）mRNA表达的影响。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，无显著性（P > 0.05）。
Chro抑制RA-FLS细胞中PI3K-Akt信号通路
在网络药理学分析和分子对接基础上，对化合物Chro通过PI3K-Akt通路抗RA的潜在机制，做进一步的体外实验验证。Western blot检测显示，Chro显著下调PI3K、PDK1、p-Akt/Akt和p-NF-κBp65/NF-κBb65的表达（P < 0.001，图8A）；进而设计PI3K激活剂（740Y-P）实验，当Chro与740Y-P联用时，740Y-P对PI3K-Akt通路的激活作用被Chro部分逆转（P < 0.01，图8B），提示化合物Chro通过抑制PI3K-Akt通路对RA-FLS细胞发挥干预作用。
图8 化合物Chro对RA-FLS细胞中（A）PI3K-AKT通路的影响及对（B）740Y-P激活PI3K的抑制作用。与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，无显著性（P > 0.05）。
三
Conclusion
本文通过整合网络药理学、分子对接与实验验证，对岗松叶（BFL）抗类风湿性关节炎（RA）进行系统性深入研究。首先进行体内药效评价，结果表明BFL提取物可以通过抑制关节肿胀、降低免疫器官指数、改善踝关节病理以及调节CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平来有效改善RA；进而以BFL中高含量活性成分5-羟基-7-甲氧基-2-异丙基色酮（Chro）为突破口，经网络药理学预测和分子对接计算，提示PI3K-Akt信号通路是化合物Chro抗RA的一个关键因素；进一步体外细胞验证表明，化合物Chro可抑制RA-FLS细胞迁移、侵袭，诱导细胞凋亡、使其停滞于G2/M期，并通过抑制PI3K-Akt通路减少炎性细胞因子的分泌。由此可知，BFL中化合物Chro是其改善RA症状的主要活性成分，相关实验数据为功能食品“岗松茶”的开发提供理论依据。
作者简介
第一作者
郭雪扬，女，郑州大学药学硕士研究生，主要研究方向为中药活性成分及作用机制，参与国家自然基金1 项，河南省自然基金1 项，《河南省中药材标准》（2023年版）及《河南省中药饮片炮制规范》（2022年版）的修订。
通信作者
贾贝西，女，郑州大学药学院副教授，硕士研究生导师，主要从事中药活性成分及质量评价工作，致力于民族特色壮瑶药研发，主持完成国家自然科学基金2 项，中国博士后科学基金3 项，河南省自然科学基金1 项，以第一及通信作者在Food Chemistry，Food Science and Human Wellness，Journal of Functional Foods，Fitoterapia、中华中医药学刊等发表专业研究论文10余篇。
Combining network pharmacology, molecular docking, and experimental verification to investigate the anti-rheumatoid arthritis effect and mechanism of Baeckea frutescens leaves
Xueyang Guoa, Mengyao Zhanga, Haixia Caib, Xinyue Jianga, Siyuan Zhoua, Wen Gonga, Zijiao Weia, Weili Qiaoa, Beixi Jiaa,*
a Department of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
b Department of Pharmacy, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450003, China
*Corresponding author.
Abstract
The aromatic Baeckea frutescens leaves (BFL) known as “Gang-Song-Cha” is a popular drink (Tea) in South China. To explore the healthcare value, a systematic and in-depth study on BFL alleviating rheumatoid arthritis (RA) was carried out by integrating network pharmacology, molecular docking, and experimental verification. The efficacy was first evaluated, and the BFL extract could ameliorate RA by inhibiting articular swelling, lowering immune organ index, improving the ankle pathologies, and regulating serum levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin (IL)-6, and IL-10 in CIA rats. Then the anti-RA mechanism of BFL was investigated by leveraging the high-content and active component 5-hydroxy-7-methoxy-2-isopropylchromone (Chro), and the potential signaling pathway and related target proteins for Chro acting on RA were analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment and docking simulation. Finally, the experimental validations were conducted on rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS), and compound Chro could inhibit cell invasion and migration, block cell cycle at G2/M phase and induce apoptosis, and reduce the secretion of inflammatory cytokines by suppressing the PI3K-Akt pathway. These results provided pharmacological basis for the folk usage of “Gang-Song-Cha” for intervening RA.
Reference:
GUO X Y, ZHANG M Y, CAI H X, et al., Combining network pharmacology, molecular docking, and experimental verification to investigate the anti-rheumatoid arthritis effect and mechanism of Baeckea frutescens leaves[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250166. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250166.
文章编译由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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