《食品科学》：张现龙教授、张微副研究员等：基于CRISPR/Cas12a的荧光传感器构建及其乳品中阪崎克罗诺杆菌的高灵敏检测应用|crispr|克罗诺|张微(西晋)|杆菌|特异性|荧光|食品科学

乳及乳制品营养丰富，是人体优质蛋白质、维生素等营养物质的重要膳食来源。然而，牛乳的营养组成和适宜pH值使其成为微生物生长的理想培养基。从原奶采集到加工完成，微生物污染风险贯穿整个生产流程，甚至可能引入致病性威胁。乳品中食源性致病菌污染是挑战乳品安全性的一大难题。食源性致病菌污染不仅可能导致乳品腐败变质，更可能引发严重食源性疾病，威胁消费者生命健康。阪崎克罗诺杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等是引发乳品安全事件和潜在公共卫生风险的主要致病菌。其中，阪崎克罗诺杆菌因其高耐热性和耐干燥性备受关注。阪崎克罗诺杆菌不仅能长期存活于乳品加工设备，还对巴氏杀菌具有较强抗性，从而显著提升了乳制品的污染风险。研究显示，该菌的致病风险主要集中于新生儿、早产儿以及免疫力较弱群体。尚未发育完全的婴儿感染该菌可能诱发败血症、坏死性小肠结肠炎、脑膜炎等严重病症。值得注意的是，阪崎克罗诺杆菌污染在婴幼儿奶粉中尤为突出。鉴于其严重的健康威胁，世界卫生组织已将其定性为婴幼儿配方奶粉中的A类病原体。高效、灵敏、特异性强的检测方法能显著提升乳品中阪崎克罗诺杆菌的检测效率和准确性，是保障乳品安全和防止阪崎克罗诺杆菌感染的关键。

目前对阪崎克罗诺杆菌的检测主要采用生理生化检测、免疫检测及核酸分析3类方法。其中，菌落平板计数法被视为检测食源性致病菌的“金标准”，但其检测周期长且重复性差，无法实现现场快速检测。免疫检测技术（如酶联免疫吸附测定（ELISA）和胶体金免疫层析试纸条）是一种以抗原与抗体之间的特异性作用为基础建立起来的检测方法，具有灵敏度高、特异性强等优点。但ELISA技术存在交叉反应不均一且成本过高等局限性。以核酸为基础的检测手段，如聚合酶链式反应（PCR）与环介导等温扩增（LAMP）等，借助核酸分子的独特属性，通过捕获特定的DNA/RNA序列鉴别食源性致病菌，在灵敏度方面表现出色，但这类方法需要依靠专业人员的规范操作才能避免检测过程中潜在的交叉污染风险。因此，亟待开发具备快速响应能力和简化操作流程的新型检测技术以克服上述方法的局限性。

成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白（CRISPR/Cas）是一种免疫防御系统，该系统通过CRISPR RNA（crRNA）及CRISPR相关蛋白对噬菌体等外来核酸序列进行高特异性干扰。作为基因组编辑的关键工具，Cas9、Cas12、Cas13和Cas14蛋白是CRISPR/Cas系统中用于核酸检测的主要效应蛋白。凭借其可由单个蛋白形成功能复合物的特性，为基因操作提供了强大支持。在食源性致病菌的检测中，Cas12a因其操作简易和结果准确的特性，得到了广泛的应用。在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA可以利用碱基互补配对原则特异性地识别目标致病菌的DNA，Cas12a在crRNA的引导下识别富含T的原间隔序列毗邻基序（PAM）区域，一旦检测到PAM位点后，Cas12a实现对靶双链DNA（dsDNA）的顺向切割，从而在PAM序列邻近区域形成黏性末端。此外，致病菌靶DNA被crRNA结合后，Cas12a蛋白的空间构象发生改变，诱导出反式切割活性，该活性可对体系内的单链DNA进行非特异性切割。尽管CRISPR/Cas12a系统具备诸多优势，但在灵敏度和特异性方面还存在一定的局限性。因此，研究人员将CRISPR/Cas12a系统与信号放大技术相结合，例如PCR。PCR扩增技术能将极微量的目标DNA/RNA在数小时内扩增数百万至数十亿倍，这解决了在复杂样本中目标分子浓度过低而无法被直接检测到的问题。PCR技术与CRISPR/Cas12a系统联用的检测方法先通过PCR对目标序列进行预扩增，再将扩增产物提供给CRISPR/Cas12a系统进行检测，可以将检测灵敏度提升到单分子级别，对于早期感染诊断、微量病原体筛查至关重要。PCR过程具备较高的特异性，Cas12a对扩增产物的特异性识别有利于进一步提高检测特异性，PCR与CRISPR/Cas12a集成的双重特异性识别机制极大地降低了假阳性的概率，能够有效区分高度相似的序列。目前，CRISPR/Cas12a系统与PCR技术结合已经较广泛地应用于沙门氏菌、大肠杆菌等病原菌的快速检测，但是在阪崎克罗诺杆菌的检测中鲜有报道。

东北农业大学食品学院的曲欣雨、张微*、张现龙*等结合PCR扩增技术和CRISPR/Cas12a系统，构建基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法并应用于阪崎克罗诺杆菌的快速检测。首先根据阪崎克罗诺杆菌的ompA基因设计PCR引物并进行特异性验证，随后设计crRNA并筛选，进而构建荧光检测体系并进行可行性验证，优化检测体系条件后评估该方法的灵敏度、特异性等性能，最后利用qPCR方法检测乳品中的阪崎克罗诺杆菌。本研究旨在建立一种基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法，解决传统检测方法周期长、成本高、操作复杂、交叉污染风险高等难题，为乳品中阪崎克罗诺杆菌快速检测技术的开发提供参考并为其他食源性病原菌的检测提供案例。

1 实验原理分析

如图1所示，本实验首先培养阪崎克罗诺杆菌并提取基因组，随后对阪崎克罗诺杆菌ompA基因进行PCR扩增，设计并筛选crRNA后利用CRISPR/Cas12a系统进行检测。当阪崎克罗诺杆菌存在时，Cas12a在crRNA的引导下与靶DNA特异性结合，Cas12a的反式切割活性被激活，从而非特异性切割系统中的单链DNA（包括ssDNA-FQ），引发荧光信号显著增强。当靶标不存在时，Cas12a的反式切割活性无法激活，荧光信号也不会呈增强趋势。

2 PCR扩增阪崎克罗诺杆菌ompA基因

针对阪崎克罗诺杆菌的ompA基因设计了PCR引物，并验证了引物的可行性和特异性。如图2所示，相较于空白组（泳道2），使用ompA-F和ompA-R得到了纯度较高的PCR扩增产物（泳道1），且得到的DNA条带符合预期，没有杂带，表明设计的引物可以成功扩增阪崎克罗诺杆菌的ompA基因，具有特异性。

3 基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法的可行性分析

针对PCR扩增产物设计了两条crRNA（两条crRNA的序列和靶标位点不同）以引导Cas12a反式切割ssDNA，并对crRNA的引导效果进行筛选。只有当Cas12a、crRNA、靶DNA和ssDNA-FQ 4种反应成分都存在时，Cas12a才会被激活从而剪切荧光探针。为此通过设计不同的反应体系验证基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法的可行性。其中，实验组包含CRISPR/Cas12a荧光检测体系所有成分，对照组设置为无crRNA组、无靶DNA组。如图3所示，当Cas12a、crRNA和靶DNA同时存在时，反应体系产生了较强的荧光信号。此外，crRNA1与crRNA2参与的反应体系均产生了荧光信号，说明两条crRNA都能引导Cas12a与靶DNA结合。其中，crRNA1参与的检测体系所产生荧光信号高于crRNA2，因此选择crRNA1进行后续研究。

4 基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法的条件优化

4.1 Cas12a浓度

如图4所示，当Cas12a的浓度由0 μmol/L增加至3 μmol/L时，反应系统的荧光强度逐渐升高，3 μmol/L时荧光强度达到峰值。然而，当Cas12a的浓度超过3 μmol/L时，反应体系的荧光强度随着Cas12a浓度的增加而逐渐降低。因此，CRISPR/Cas12a系统检测阪崎克罗诺杆菌的最适Cas12a浓度为3 μmol/L。Cas12a浓度较低时，荧光信号随特异性三元复合物（Cas12a-crRNA-靶DNA）增多而增强，但过量的Cas12a会显著增强其非特异性ssDNA切割活性，导致检测灵敏度在最佳浓度后下降。

4.2 crRNA浓度

如图5所示，crRNA的浓度从0 nmol/L增加至400 nmol/L时，反应体系的荧光强度随着crRNA浓度上升而逐渐增强，直至浓度达到400 nmol/L时，荧光强度达到最高值。浓度超过400 nmol/L后荧光强度又呈下降趋势。因此，CRISPR/Cas12a系统检测阪崎克罗诺杆菌的最适crRNA浓度为400 nmol/L。

4.3 反应时间

如图6所示，随着反应时间的延长（0～40 min），反应体系的荧光强度逐渐增强，40 min时荧光强度达到峰值，超过40 min后趋于平稳。因此，CRISPR/Cas12a系统检测阪崎克罗诺杆菌的最适反应时间为40 min。反应时间过短会导致反应不充分，激活的Cas12a过少或激活的Cas12a未来得及充分剪切ssDNA-FQ荧光探针产生足够的荧光信号。当反应时间为40 min时，荧光强度趋于平稳，没有明显增加的趋势，表明此时反应体系趋于完成，进一步延长反应时间不会导致荧光强度明显升高。

5 基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法的灵敏度和检测限分析

通过设置不同浓度的阪崎克罗诺杆菌样本（浓度梯度为101～108 CFU/mL），评估所构建荧光检测方法的灵敏度。如图7所示，随着阪崎克罗诺杆菌浓度增大，荧光强度也逐渐升高。这是因为在剪切过程中，Cas12a蛋白先与crRNA结合，形成二元复合物，进一步与靶DNA形成稳定的三元复合物，从而激活Cas12a的反式切割活性。此时，Cas12a会无差别地、持续地切割反应体系中的单链DNA（包括ssDNA和ssDNA-FQ）。ssDNA-FQ是带有荧光基团和猝灭基团的单链DNA报告探针，当它被切割时，荧光基团与猝灭基团分离，产生荧光信号。

此外，此方法可以检测到101 CFU/mL的阪崎克罗诺杆菌。以阪崎克罗诺杆菌落数（lg（CFU/mL））为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，拟合得出基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法的线性范围为102～108 CFU/mL，线性方程为y＝148 823.232x+22 299.145（R2＝0.995）。经计算得出该方法的检测限为1 CFU/mL（检测限＝3S/N，其中S为10个空白样本的标准差，N为标准曲线的斜率）。

如表6所示，在阪崎克罗诺杆菌的检测领域，相较于已有的各类检测技术，基于CRISPR/Cas12a的荧光检测技术展现出更突出的性能，不仅拥有更宽的线性范围，还具备更低的检测限。

6 基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法特异性分析

进一步对不同菌种进行检测，以评估该方法的特异性。如图8所示，仅阪崎克罗诺杆菌实验组呈现明显的荧光信号增强，其余菌株实验组未出现明显的荧光强度上升趋势。该结果充分表明，本研究设计的crRNA对阪崎克罗诺杆菌具有高度特异性，能够有效区分其他干扰菌株。基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法特异性较强。

7 真实样品检测结果

如表7所示，用基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法得出加标牛奶和奶粉中阪崎克罗诺杆菌的回收率分别为93.83%～104.71%和89.51%～104.66%，相对标准偏差分别为3.71%～13.67%（n＝3）和1.53%～5.88%（n＝3），最高仅有13.67%，属中等变异。上述结果证明本研究建立的荧光检测方法能够有效检出真实样品中的阪崎克罗诺杆菌，表明该方法具有良好的实用性。且该方法检测阪崎克罗诺杆菌仅需2 h，与传统的微生物检测方法相比，大大缩短了检测时间。

8 qPCR检测结果

通过qPCR方法检测不同浓度的阪崎克罗诺杆菌（100～108 CFU/mL），评估qPCR方法灵敏度。以细菌浓度对数值（lg（CFU/mL））为横坐标，循环阈值（Ct值）为纵坐标，绘制标准曲线，线性范围为102～108 CFU/mL，线性方程为y＝33.805—2.812x（R2＝0.999）。

进一步利用qPCR检测了真实样品中的阪崎克罗诺杆菌，并与建立的基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法比较，评价CRISPR/Cas12a检测方法的准确性。如表8所示，qPCR法检测加标牛奶和婴幼儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的回收率分别为96.60%～105.51%和99.31%～105.68%，与构建的CRISPR/Cas12a荧光检测方法得到的回收率相差不大。上述结果表明构建的基于CRISPR/Cas12a的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法准确性较高。

结论

本研究成功构建了一种基于CRISPR/Cas12a系统的阪崎克罗诺杆菌荧光检测方法，该体系通过耦合PCR的高扩增效率与CRISPR/Cas12a的反式切割活性，实现了对目标致病菌的高效识别与精准检测。检测限低至1 CFU/mL，线性范围为102～108 CFU/mL，显著优于传统培养法与常规分子检测方法。且该方法在真实样品（如牛奶与婴幼儿配方乳粉）中的表现也很优异，回收率为89.51%～104.71%，该方法仅需2 h即可完成从样品到结果的全程检测，大幅缩短了传统微生物检测所需时间，说明其具备良好的抗干扰能力与实际应用潜力。此外，该检测体系还具有一定的通用性，通过设计不同的crRNA序列，该平台可灵活适配于其他食源性致病菌的检测需求。但是该方法仍存在进一步优化的空间，例如，可将其与微流控芯片、便携式荧光读取设备结合，实现更加快速灵敏的现场即时检测。同时，在多重检测能力方面，通过设计多靶标crRNA及多色荧光报告系统，有望实现对多种致病菌的同时筛查，进行高效率多重检测。

引文格式：

曲欣雨, 谢新娜, 邱满艳, 等. 基于CRISPR/Cas12a的荧光传感器构建及其乳品中阪崎克罗诺杆菌的高灵敏检测应用[J]. 食品科学, 2026, 47(4): 296-304. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250910-080.

QU Xinyu, XIE Xinna, QIU Manyan, et al. Development of a CRISPR/Cas12a-based fluorescence sensor for highly sensitive detection of Cronobacter sakazakii in dairy products[J]. Food Science, 2026, 47(4): 296-304. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250910-080 .

实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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