《食品科学》：中国农业大学车会莲教授等：应用噬菌体展示随机七肽库筛选花生Ara h 5蛋白的模拟表位|噬菌体|抗体|抗原|蛋白|表位|食品科学

花生过敏是一种常见且严重影响患者生活的疾病，往往是终生的，仅有少数患者能够摆脱其困扰。在西方国家中花生过敏的患病率最高，据报道，在过去10 年，美国儿童花生过敏症的患病率增加了3.5 倍。在亚洲国家也发现患病率在逐渐上升。花生过敏是引起致命性过敏反应的主要原因之一。美国过敏、哮喘和免疫学学会早期一项针对32 例因食物引发致命性过敏反应的病例调查显示，其中存在多个共同特征：大多数是青少年或年轻人，几乎所有人都有对相关食物的反应史（通常不会危及生命），几乎所有病人都患有哮喘，且其中20 例死亡与花生过敏相关。这些病例强烈提示花生过敏、哮喘与致命性过敏反应之间存在密切联系。此外，一项回顾性队列研究发现，与无花生过敏的患者比，4～17 岁的花生过敏患者中患有哮喘呼吸性疾病比率更高。研究还指出，花生过敏可能是学龄儿童哮喘发病率增加的危险因素，由于儿童在幼儿期经常出现食物过敏，因此花生过敏也被作为哮喘发病的早期标志。

前期研究发现，相比于牛奶、鸡蛋和大豆过敏原，花生过敏原可能是通过丝裂原活化蛋白激酶途径诱发过敏性哮喘，进而表现出更严重的过敏反应。除了花生中的过敏原直接引起花生过敏反应，花生过敏诱发的过敏性哮喘还可能由其他食品中的蛋白质或来自其他物种的吸入性过敏原之间的免疫球蛋白E（IgE）交叉反应引起。花生（Arachis hypogaea）过敏原 Ara h 5展现了profilin蛋白家族典型的折叠方式，主要由一个中央的β-折叠片层和两侧的α-螺旋组成。研究报道显示，Ara h 5与引起呼吸道哮喘反应的常见花粉过敏原proﬁlin蛋白具有交叉反应性，特别是与桦树花粉的Bet v 2、蒿草的Art v 4和豚草花粉的Phl p 12，这意味着对上述花粉过敏的患者，其体内产生的针对花粉profilin的IgE抗体可能结合食物中的Ara h 5，从而在食用花生后触发过敏症状，这种交叉反应机制显著提高了由Ara h 5介导的过敏发病率，使其与高发的花粉过敏发病率相关。因此，过敏原Ara h 5已被作为花生中引发过敏性哮喘的重要过敏原。

IgE表位，也称为抗原决定簇或被抗体识别的分子的一部分，通常分为线性表位和构象表位。在花生致敏过程中，B细胞产生花生过敏原特异性IgE，它与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力FcεRI受体结合。再次接触花生过敏原后，花生过敏原会与表面结合的IgE交联，引发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒。脱颗粒会导致组胺和类胰蛋白酶等预制物质的释放以及脂质介质和细胞因子的快速合成，从而引起过敏反应。因此，花生过敏原特异的IgE结合表位是花生过敏的先决条件。表征花生过敏原蛋白的IgE结合表位对花生过敏的治疗具有重要意义。目前，已有多种技术被应用于花生过敏原IgE结合表位的鉴定，包括生物信息学分析、重叠肽段扫描、肽微阵列、噬菌体展示等。其中，生物信息学方法因其低成本、高通量的特点，常被用于预测潜在的过敏原表位。构象表位的预测主要依赖于抗原的三维结构信息，而线性表位的预测则更多依据氨基酸的理化性质，如亲水性、电荷、表面可及性以及蛋白质二级结构等。在实验验证方面，Shreffler等采用微阵列免疫印迹技术对77 位过敏患者的血清进行筛选，成功绘制出针对花生过敏原Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的抗体表位谱。进一步拓展构象表位的研究，Chen Xueni等通过噬菌体展示技术从花生过敏患者血清中筛选出41 个模拟Ara h 2和Ara h 6构象表位的肽段，其中8 个被超过90%的患者血清识别，提示其免疫优势性。序列比对与三维结构映射证实这些模拟表位代表构象表位。然而，目前关于花生过敏原Ara h 5的IgE表位研究仍较为欠缺。

北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所的王俊娟、秦培友和中国农业大学食品科学与营养工程学院的车会莲*等采用原核表达体系重组花生中重要过敏原Ara h 5蛋白，制备抗Ara h 5蛋白的抗体，利用噬菌体展示技术鉴定出Ara h 5蛋白的IgE表位，以期为开发针对花生过敏的阻断抗体或表位特异性免疫疗法奠定基础。

1 Ara h 5蛋白的表达与纯化

1.1 重组质粒鉴定

从转化后的BL21 (DE3)菌株中提取质粒，通过使用限制性内切酶XhoI和EcoRI切割pET-28a (+) Ara h 5，双酶切结果如图2所示，Ara h 5质粒有两条明显的条带，证明重组质粒构建时并未插入其他杂质基因。其中 5 369 bp的条带为pET-28a载体，另外Ara h 5的目标条带为429 bp，证明目的基因成功构建到pET-28a载体中。

1.2 重组蛋白表达条件的优化

在原核表达体系中，已有实验发现IPTG的浓度并不是越高越好。这是由于IPTG对菌体具有一定的毒性，超过一定浓度影响细胞活性；并且IPTG浓度太高会导致菌体生长太快，形成大量包涵体，而可溶性蛋白的量反而减少。因此，在含有卡那霉素的100 mL LB液体培养基中，以1%的接种量加入Ara h 5转化子菌液，37 ℃培养2～3 h。取1 mL混合后的菌液测量其OD600为0.6时，其余菌液分别加入0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L IPTG后在22 ℃、180 r/min诱导22 h。SDS-PAGE和Western blot结果发现，Ara h 5的可溶性蛋白在0.3 mmol/L IPTG条件下诱导的蛋白含量最高。另外，温度有时对蛋白表达起着决定性的作用，低温时细菌代谢缓慢，不容易形成包涵体，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围可能很窄，只有2～4 ℃。将3 瓶含有100 mL的菌液中加入优化剂量的IPTG后分别在16、19、22 ℃中培养，如图3所示，Ara h 5的可溶性蛋白在22 ℃条件下诱导的蛋白含量最高。

1.3 重组蛋白的纯化

通过镍柱亲和色谱以及强阴离子交换色谱一步纯化确定的洗杂蛋白以及洗脱目的蛋白的合适缓冲液浓度，最终选定镍柱亲和色谱洗杂蛋白的浓度为10、40 mmol/L咪唑，洗脱目的蛋白选用250、500 mmol/L咪唑；选定强阴离子交换色谱的缓冲液为20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）上样缓冲液，洗涤液中NaCl梯度为50、100、200、400 mmol/L到1 000 mmol/L。超声破碎获得目的蛋白上清液，过完镍柱纯化蛋白后，收集250、500 mmol/L咪唑洗脱样品并进行SDS验证，将有目的蛋白的样品在20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液中透析，然后过强阴离子交换柱，收集各洗脱液进行SDS-PAGE验证，结果发现Ara h 5蛋白在流穿液、20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）以及50 mmol/L NaCl中有单一条带（图4）。

1.4 重组蛋白的灰度及质谱分析

SDS-PAGE结果显示在分子质量14.6 kDa处有单一的条带（图5），与Ara h 5蛋白的理论分子质量一致。进一步用Gel Analysis软件分析Ara h 5蛋白的电泳条带，泳道的条带灰度值结果显示目标Ara h 5条带占92%。进一步，对Ara h 5进行蛋白质质谱测序，用胰蛋白酶酶切后测序，结果发现Ara h 5蛋白肽段的覆盖率为45%。结果证明获得了较纯的目的蛋白，蛋白质量浓度为1.5 mg/mL。

2 抗Ara h 5抗体的纯化与效价分析

纯化的Ara h 5作为免疫抗原免疫小鼠，采用HiTrapTM Protein G HP柱（1.6 cm×2.5 cm，34 μm）纯化血清抗体，进而将IgG和IgE抗体分开，IgG被捕获在柱上，随后通过酸性洗脱获得纯化；而IgE存在于结合较弱的洗涤组分中。IgG单体分子质量为150 kDa，由两个相同的半体在轻链羧基末端附近通过二硫键连接在一起，每个半体都具有1 个约50 kDa的重链和1 个约25 kDa的轻链。IgE的分子质量为190 kDa，由1 个约70 kDa的重链和1 个约25 kDa的轻链组成的2 个单体组成。纯化图谱的结果显示非特异性洗涤以及特异性洗脱处出现明显的特征峰（图6）。SDS-PAGE结果显示，非特异性洗涤液在70 kDa附近有明显的条带，并且在50 kDa处无条带，成功将IgG和IgE抗体分开。可以获得抗目的蛋白的IgE抗体。这与Untersmayr等的报道一致，该团队通过Protein G柱分离小清蛋白特异性IgE和IgG抗体，然后用于限制性十聚体随机肽噬菌体文库的生物淘选。经过4 轮使用小清蛋白特异性IgE的生物淘选，选出5 个被小清蛋白特异性IgE特异性识别的噬菌体克隆体。另外，何伟逸等还利用Protein A亲和层析柱与Ara h 1作为配体的亲和层析柱纯化抗Ara h 1的IgG与IgE。

在以P/N值≥2.1作为阳性阈值的ELISA检测中，表1测得抗Ara h 5蛋白的多克隆IgE抗体效价为1∶320。斑点免疫印迹方法所得效价为1∶1 280（图7）。不同实验方法的抗体效价为后续抗体的基础应用提供了实验方案指导。

3 抗体结合噬菌体随机肽库的富集

通过正常鼠血清进行阴性筛选后排除抗体的非特异性结合，分别以抗Ara h 5蛋白的IgE抗体为靶分子进行阳性筛选，每轮进行筛选前，将噬菌体数量调整为2×1010 PFU/mL，经过3 轮生物淘选后，获得了能与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体结合的噬菌体。如图8所示，3 轮筛选后，测得的洗脱物噬菌体的滴度逐渐增加，说明噬菌体随机肽库中能与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体结合的噬菌体得到了大量的富集。在第3轮筛选后，能特异性结合抗Ara h 5蛋白的IgE抗体的噬菌体回收率大约是第1轮的100 倍（表2）。

4 单克隆噬菌体的测序结果

通过噬菌体随机肽库的生物淘选，筛选得到能与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体特异性结合的阳性单克隆噬菌体，并挑取20 个阳性单克隆噬菌体进行DNA测序。结果获得16 个与抗Ara h 5蛋白IgE抗体结合的多肽序列，一共筛选出3 个结合肽段（表3）。出现频率最高的为FHWWYLK，出现频率为11/16。WETIYSR出现频率为4/16，GPLWNVN出现频率为1/16。

5 构象表位定位

有文献报道将噬菌体随机肽库筛选到的与抗抗原的IgE抗体结合的氨基酸序列与其抗原氨基酸序列进行比对，将含有连续重合3 个氨基酸以上的肽序列和非连续重合5 个氨基酸以上的肽序列被定义为线性表位。通过使用DNAman 7.0软件的多序列对比功能将多肽序列FHWWYLK、WETIYSR、GPLWNVN序列与Ara h 5的氨基酸序列进行对比，未发现线性表位。进一步用Pepitope方法分别将用噬菌体随机肽库筛选到的与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体结合的氨基酸序列与Ara h 5蛋白的三维结构进行比对，分析构象模拟表位的定位。结果如表4、图9所示，序列WETIYSR的构象性模拟表位位于Ara h 5的N端α-螺旋，序列FHWWYLK的构象性模拟表位中色氨酸W是IgE结合的关键芳香族残基，GPLWNVN的构象性模拟表位位于Ara h 5的C端α-螺旋-环连接处。并且，序列WETIYSR和序列FHWWYLK在空间结构中的匹配程度最高，并且在空间结构中处于聚合的一簇中（红色表示匹配程度最高的簇，其次为蓝色、紫色簇）。

讨论与结论

近年来，为了开发新的诊断工具和特定疗法，人们进行了大量研究表征食物过敏原上的表位。由于高过敏风险，使用食物过敏原提取物进行免疫治疗不可行，因此有关IgE反应位点的确定对于设计安全免疫疗法至关重要。在许多研究中，各种过敏原来源的合成肽已经产生并被鉴定为患者血清的IgE反应性表位。然而，由于大多数抗体表位被描述为构象，通过顺序方法鉴定的肽提供的信息有限，并且可能表现出较低的抗体结合亲和力。近年来，噬菌体展示技术已成为筛选肽段的有用工具，这些肽模拟蛋白质抗原（如过敏原、毒素和肿瘤）上的线性甚至构象抗体结合表位。从具有大量可能配体的随机肽噬菌体文库中，通过生物淘选选择与抗体结合的特异性肽。由于这些原因，本研究的目标是使用噬菌体展示技术生成肽模拟物，从而表征重要花生过敏原Ara h 5蛋白的IgE表位。

近年来，Cui Yubao等针对Der f 5的3 种单克隆抗体，用噬菌体展示十二肽文库的噬菌体表面衣壳蛋白筛选序列，鉴定出7 个模拟表位。Yang Yang等利用十二肽噬菌体展示文库筛选获得了克氏原螯虾变应原MLC1的模拟表位。抗原表位仅要求在一个短短的区域内有几个结合位点，七肽的长度更接近天然构象表位中直接与抗体互补决定区接触的关键残基簇的大小。同时避免因序列过长而引入过多无关的氨基酸，从而更精确地定位到抗体识别的关键残基，所以噬菌体展示七肽文库是一个更好的选择。因为十二肽文库提供了更大的随机区域，反而会选择到多个较弱的结合位点。因此，本研究通过原核表达体系获得Ara h 5蛋白，并通过固定Ni2+-琼脂糖树脂亲和层析和强阴离子交换Q琼脂糖树脂层析分离纯化Ara h 5蛋白。经质谱测序发现Ara h 5蛋白肽段的覆盖率为45%，与其酶切肽段的长度分布不佳有关。序列中K/R残基稀疏，产生了大量超出检测上限的长肽段；另外，会出现“K”（AA 86～87）样的极短肽段，其信号因低于质量采集下限而无法被捕获。经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色灰度分析Ara h 5蛋白纯度为92%。将纯化的重组过敏原Ara h 5蛋白作为免疫原，利用小鼠动物模型制备抗Ara h 5蛋白的抗体，并通过亲和层析纯化血清IgE抗体。以抗Ara h 5蛋白多克隆IgE抗体为靶点，采用噬菌体展示七肽文库筛选与其抗体结合的序列，结果获得3 个与抗Ara h 5蛋白IgE抗体结合的多肽序列，分别为FHWWYLK、WETIYSR、GPLWNVN，采用Pepitope方法将测序得到目的序列与Ara h 5蛋白的三维结构进行比对，得到花生重要Ara h 5蛋白的构象表位。WETIYSR和FHWWYLK序列为Ara h 5蛋白的匹配程度最高的构象表位，另外，GPLWNVN在与抗Ara h 5蛋白多克隆IgE结合的筛选中只有1 个阳性克隆，可作为Ara h 5蛋白的潜在表位。Ara h 5的构象表位位于N端区域AA 2～6、中间AA 32～35与C端区域AA 112～121。这些表位与免疫表位数据库预测的Ara h 5表位AA MSWQTYVDNHLLCEIEGDHL、AA SSAAILGQDGGVWAQ和AA LIIGIYDKPMTPGQCNMIVE部分吻合。其中，位于N端的序列W3Q4S2T5Y6与其他Profilin家族成员中已报道的表位序列SWQTYVDDHQYQGL具有同源区域，提示该区段可能在交叉识别中发挥作用。已有研究指出，Profilin家族中引起交叉反应的关键区域为N端螺旋区及30～50号残基构成的双链片段。本研究也发现了Ara h 5的模拟表位位于N端区域AA 2～6和中间AA 32～35，这也进一步说明了Ara h 5与其他Profilin家族过敏原的交叉反应性。因此，序列WETIYSR和FHWWYLK可能是识别Profilin家族的共同构象表位，存在交叉反应风险；而GPLWNVN靶向的C端区域可能是花生特异性表位，交叉反应风险较低。虽然噬菌体展示技术可以识别线性表位和构象表位，但是模拟表位的识别存在脱靶的可能性，模拟表位仍需通过进一步实验验证其与天然Ara h 5蛋白竞争性结合特异性IgE的能力以及模拟表位的过敏原特异性免疫原性。

综上，本实验初步表征了Ara h 5过敏原的模拟构象表位为FHWWYLK、WETIYSR、GPLWNVN，后续需要通过血清学、肥大细胞脱颗粒以及动物实验验证表位的免疫结合性以及免疫原性，本研究结果将为花生过敏的诊断与治疗提供理论依据。

第一作者：

王俊娟助理研究员

北京市农林科学院农产品加工与食品营养研究所

主要从事食品中潜在风险因子评价与食品加工中基质的相互作用的研究。重点开展杂粮中内源性危害因子过敏原的致敏性机制与表位序列鉴定的研究；食品加工对基质组分的相互作用以及这些相互作用如何影响食品的功能性和营养价值；控糖、降脂以及抗过敏食品研发。主持国家自然科学青年基金、北京市农林科学院青年基金、改革发展专项基金。担任中国作物学会藜麦专业委员会第三届委员会副秘书长。在国内外期刊上发表论文9 篇，其中SCI索引论文6 篇，EI文章3 篇，参与编写著作1 本。

通信作者：

车会莲教授

中国农业大学食品科学与营养工程学院

长期致力于食品营养与安全、食物过敏及特殊食品领域的教学与科研工作，“十一五”以来主持国家自然科学基金项目7 项、国家重点研发计划项目、国家科技重大专项课题4 项。在食物致敏原精准鉴定、致敏性评估体系构建及过敏发生机理等方面取得系统性创新成果，为我国食物过敏风险防控体系的建立提供了重要科学支撑。获国家发明专利授权9 项，在国内外重要学术期刊发表论文248 篇，其中SCI收录112 篇。主编《食源性病原学》《营养与健康》《现代食品安全学》《食品免疫学》《最佳食物搭配方案》《家庭饮食健康方案》《食品毒理学》《食品卫生与安全》等。曾荣获四川省“峨眉学者”称号、中国农学会青年科技奖、中国食品科学技术学会科技创新奖-杰出青年奖、中国农业大学优秀教师等荣誉。

引文格式：

王俊娟, 秦培友, 王丹, 等. 应用噬菌体展示随机七肽库筛选花生Ara h 5蛋白的模拟表位[J]. 食品科学, 2026, 47(7): 101-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251018-096.

WANG Junjuan, QIN Peiyou, WANG Dan, et al. Screening for mimotopes for the peanut allergen Ara h 5 using a phage display random heptapeptide library[J]. Food Science, 2026, 47(7): 101-108. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251018-096.

实习编辑：魏雨诺；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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