含氟化合物是医药、 农业 和材料领域的关键结构单元 ，然而 在温和条件下实现 偕 二氟 基团 的高选择性 、 可持续 引入仍 是一大挑战。近年来，光酶催化融合了光催化和生物催化的优势，为不对称合成提供了强有力的平台， 其中 黄素单核苷酸（ FMN ）依赖 型 “ 烯 ” 还原酶（ EREDs ） 备受关注 。酶在长期的自然进化中形成了固有的底物特异性，直接用于非天然转化时效率较低。传统的定向进化方法 通常 需筛选 数 千 至 上万 个 突变体， 耗 时费力；而基于蛋白质语言模型（ PLMs ）的 “ 零样本 ” 预测在面对非天然自由基反应时，往往因缺乏特定的训练数据，难以准确建立序列与催化活性 / 选择性 之间的映射 关系 。
针对 上述 挑战，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所客座研究员 / 南京师范大学教授周佳海与 团队副研究员古阳等 提出了一种将活性口袋理性设计与机器学习模型相结合的小样本、 加速 进化策略， 该成果以Machine-Learning-Enabled Rapid Evolution ofPhotoenzymesfor the Asymmetric Synthesis ofgem-Difluorophosphonates为题，作为 VIP 论文发表于 《德国应用化学》（ Angewandte Chemie International Edition ）。研究团队通过结构导向的热点识别与主动学习，仅在三轮进化中筛选了40个突变体，便成功获得了兼具高活性和高对映选择性的光酶突变株，整体工作量较穷举筛选减少了65%。该工作为非天然光酶催化体系的高效开发提供了一种“轻量级”的机器学习框架。
破局：光酶催化“驯服”高活性烷基自由基反应
烷基自由基因活性高、寿命短，如何“驾驭”其可控、定向、非对称合成，一直是有机催化领域的难题 。研究团队以 溴二氟甲基膦 酸二乙酯 为自由基前体、 α- 甲基苯乙烯为 自由基受体，首先开展了 反应体系 的 构建。在初步筛选中，来自 Gluconobacter 的 “ 烯 ” 还原酶（ GluER ）突变体 T36A 展现出独特潜力 —— 尽管初始产率仅为 5% ， 却 表现出极高的对映选择性（ 94:6 e.r . ）。为进一步提升反应效率， 团队 系统优化了反应参数 ，成功将野生型酶 的产率由 5 % 提升至 58% ，且选择性保持优异。控制实验 表明 ：酶、 NADPH 再生系统、光照和厌氧环境对于反应的发生缺一不可。
图 1. 反应设计及 初始酶库筛选
创新：从传统定向进化到AI指导设计
为进一步突破产率和选择性瓶颈，研究团队 开发 了 AI 指导的智能文库 设计方法 。他们通过 AutoDock Vina 构建 了底物、辅因子与酶的四元复合物结构，将距离底物和辅因子 5Å 范围内的 38 个氨基酸残基 作 为潜在突变位点。随后，采用聚焦理性迭代位点特异性诱变（ FRISM ）策略，将这些位点分别突变为空间位阻不同的三种氨基酸（ A 、 L 、 F ），构建了一个包含 114 个候选突变体的精简 “ 智能文库 ” 。利用 蛋白质 大语言模型 ESM2 对序列进行特征嵌入，并改进了 EVOLVEpro 模型，通过对产率和对映选择性进行加权复合评分， 协同 指导主动学习。
图 2 . AI 指导的 FRISM 策略 加速 光酶定向进化
高维的 ESM2 嵌入特征需要匹配合适的顶层模型 ， 才能将从进化信息中提取的适应性景观 （ fitness landscape ） 微调至特定的活性 / 选择性景观（ activity/selectivity landscape ）。研究团队利用基线数据集 对比了 9 种机器学习算法， 确定 随机森林（ Random Forest ）为最稳健的 顶端 预测器。在随后的 3 轮迭代进化中，模型仅推荐并测试了 40 个突变体，便锁定了 4 个关键单突变。通过进一步的 双位点组合突变 ，成功挖掘出两个性能卓越的组合突变体： ER1 实现了 几乎完全转化 的产率（ 95% yield, 95:5 e.r . ） ； ER2 实现了最优的 对映选择性（ 75% yield, 97:3 e.r . ）。
应用：含氟磷酸酯类化合物的高效、高选择性合成
获得了 最优反应条件及 突变体 ER1 和 ER2 后，研究团队对其底物适用范围进行了广泛拓展。结果表明：
该光酶体系 对各类带有 给电子基 或 吸电子基 的间位、对位取代苯乙烯衍生物表现出良好的耐受性。
杂环底物以及具有大位阻的复杂底物均能以最高 >99% 的产率和 98:2 e.r . 高效转化为 相应 的含氟目标产物。
分子对接表明： ER1 的高产率源于更高效的底物 装载 和更便利的氢原子转移过程；而 ER2 的高选择性则受活性口袋内 F269 残基明显的空间位阻效应驱动。
此外，在制备级的 1 mmol 放大实验中， ER1 依然能以 88% 的 分离收率催化 得到 目标 产物，且该产物可 高效 水解为生物活性分子设计中常见的 膦 酸结构单元，彰显了极高的合成应用价值。
机理：光酶催化自由基发生、加成与发散性氢原子转移
为了阐明光酶催化的深层机理，研究团队开展了系列机制探究。研究表明，该循环起始于 GDH 介 导的氢负离子转移，将氧 化态黄 素 FMN ox 还原为氢醌态 FMN hq ；伴随着自由基前体扩散进入酶活性口袋空腔，可见光激发的 FMN hq * 单电子还原自由基前体并促使 溴 负离子离去 产生二氟甲基 自由基；高活性 的二氟甲基 自由基会快速加成到附近的不饱和烯烃上，产生较稳定的苄基自由基中间体；该苄基自由基中间体 会从酶口袋 辅因子或活性氨基酸中攫取一个氢原子以得到最终特定构型的产物。
一系列机理实验揭示了该过程的关键细节：
1. 无 EDA 复合物形成：紫外 - 可见光 光 谱（ UV-Vis ）证实反应体系中不存在底物与酶 / 辅因子 之间的电荷转移复合物，表明自由基前体的还原 直接 由蛋白质骨架内光激发的黄素氢醌态 FMN hq * 通过单电子转移驱动。
2. 自由基中间体验证：自由基钟实验使用 α- 环丙基苯乙烯作为探针，成功捕捉到开环产物，证实了反应中瞬态苄基自由基中间体 的存在 。
3. 氢原子转移路径：同位素标记实验揭示了令人惊奇的现象 —— 在 ER1 中，苄基自由基主要通过黄素半醌态 FMN sq 的 N5H 氢原子 转移 终止；而在 ER2 中， 底物结合 构象改变 使得 FMN sq 氢原子 转移 在空间上不可行 ， 苄基 自由基转而从活性口袋内的关键残基 Y343 上 攫取 氢原子。
有趣的是，当在 ER2 中引入 Y343F 突变关闭 自由基淬灭 路径 后 ，反应的产率和选择性大幅 降低 ，并伴随大量 去饱和 烯烃副产物的生成。这一意外的发现表明 FMN sq 具有将自由基中间体氧化为碳正离子的潜力，为未来开发新型自由基 介 导的烯烃构建反应提供了全新思路。
图 3 . 光酶催化循环与自由基淬灭机制探究
总结与展望
总体而言，本研究 开发了一种 AI 指导的 FRISM 策略，显著提升了非天然转化中 光酶 改造 的进化效率 。通过将结构热点识别与 蛋白质大语言模型 表征、主动学习相结合，实现了产率与选择性的双重同步优化，仅测试 40 个突变体便 得到最优突变位点， 将实验工作量削减了 65% 。这一策略成功 克服了 高活性烷基自由基 加成的不对称控制难题，为绿色合成高价值有机 含 氟化合物开辟了新途径，也极大地促进了人工智能与生物催化领域的深度融合 。
中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所客座研究员 / 南京师范大学教授 周佳海 及 其团队 副研究员 古阳 为本文共同通讯作者，课题组博 士生 王 鸿 奎 为本文第一作者，中国科学院深圳先进技术研究院 与 福建农林大学 联 培 硕士生 许嘉 凡 为本工作做出了重要贡献。中国科学院深圳先进技术研究院为本文 第一 完成单位。
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.1402106
制版人： 十一
学术合作组织
（*排名不分先后）
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