诺奖得主Doudna团队用AI发明新型“基因剪刀”，比天然的更好用|dna|rna|序列|核酸|珍妮弗|蛋白

2020 年，珍妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）与埃玛纽埃勒·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）因共同开发 CRISPR-Cas9 基因编辑技术共获诺贝尔化学奖。

随着 AI 与大语言模型的爆发，近几年，珍妮弗的实验室逐渐将研究重心转向一个新方向：用人工智能（AI）创造自然界不存在的基因编辑工具。

7 月 16 日，珍妮弗团队在《科学》（Science）发文，介绍了一类名为 SynTnpB 的 AI 设计基因编辑蛋白。SynTnpB 蛋白在细菌类、动物和植物细胞中均表现出编辑活性，部分变体活性甚至超过天然酶。研究者还用冷冻电镜（cryo-EM）解析了其中一种变体的三维结构，并首次从原子层面剖析 AI 设计核酸酶的分子逻辑。

蛋白质通常由氨基酸序列折叠成不同三维结构得到。在 AI 蛋白质设计领域，AlphaFold 解决了结构预测问题，已有一些模型在结合蛋白、动态开关等相对简单的设计任务上达成目标，但对于具有多个功能结构域、多种构象状态的复杂酶，AI 一直难以设计出令人满意的结构。

尤其是 CRISPR-Cas 系统中的核酸酶，它们需要同时识别 RNA 和 DNA，并在不同催化状态间切换，才能精准剪切 DNA。

但用 AI 设计基因编辑蛋白不是此次团队的首创。2024 年，由前谷歌研究员创立的 AI 蛋白设计公司 Profluent 发布了 OpenCRISPR-1，声称是首个完全由 AI 生成的 CRISPR 编辑器。该蛋白与 SpCas9（当前应用最广泛的天然 Cas 核酸酶）有 400 余处突变差异，与最接近的天然同源物也有约 180 处差异，在人类细胞中显示出与 SpCas9 相当的编辑活性和更低的脱靶率。

新研究指出，尽管这些基于序列语言模型（LM）生成的蛋白，整体与天然序列存在数百处差异，其 DNA 结合结构域与天然同源物的序列一致性仍超过 99%，AI 做到的更接近"重排"而非"创造"。

AI 真正自主设计出的复杂酶，应在功能核心区域与天然酶发生大幅度的序列偏离，活性至少保持不变，甚至要做到更优。

为此，团队选择 TnpB（转座酶 B）作为验证对象。TnpB 因最初在转座子中发现而得名，被认为是 CRISPR-Cas12 的演化祖先。TnpB 仅有 408 个氨基酸，约为 SpCas9 的三分之一，但保留了 RNA 引导 DNA 切割的完整功能，识别和切割机制也与 Cas9 相似。TnpB 家族在细菌、古菌乃至真核生物中广泛存在，多样性丰富。

蛋白质的三维结构决定其功能，但不同的氨基酸序列可以折叠成相同的结构。研究团队使用了 Meta 于 2022 年发布并开源的逆向折叠模型 ESM-IF1，该模型基于 AlphaFold2 预测的 1,200 万个蛋白结构训练而成。在模型中给定一个蛋白骨架的三维坐标，即可生成与之相容的新氨基酸序列。研究者输入 TnpB 的结构，让 ESM-IF1 反推出全新的序列。

一开始，团队只用初始模型，得到的序列不够理想。ESM-IF1 能正确恢复 TnpB 的整体折叠和催化三联体结构，但在蛋白与核酸接触的界面上引入了错误突变。这代表 ESM-IF1 只能看懂蛋白的静态骨架，却并不了解 TnpB 的具体功能。

解决方案是为 AI 引入演化约束。研究者对天然 TnpB 进行多序列比对，最终提取出两类信号，一类是位置保守性，反映某个位置在自然选择中改变的频率；另一类是共进化耦合强度，反映蛋白残基与核酸碱基之间的共同演化关系。

两类信号条件都满足的残基被锁定为野生型序列，其余位置交给 ESM-IF1 自由生成。通过调节保守性和耦合强度，研究人员还能精确控制 AI 设计蛋白质的自由度：阈值越高，被锁定的残基越少，生成序列的差异化程度越大。

另一个关键的实验设计是分域策略。TnpB 由负责 DNA 识别的 REC 域和负责 RNA 结合与催化的 NUC 域构成。研究者将两个域分别设计并进行测试。结果发现，NUC 域对序列变化的兼容度远高于 REC 域。这一发现暗示，设计多结构域蛋白时，不能统一处理，需要对不同功能域独立优化。

研究人员让 AI 分别独立生成两个域的变体，再进行两两组合，最终得到 1,980 种全新的 TnpB 类蛋白，评估筛选后发现，其中 466 种具有可检测的切割活性，占测试总数的 24%，约 8% 的活性超过野生型 ISDra2 TnpB。研究者从中选出 9 个综合表现最佳的变体（v1 至 v9）进入真核细胞测试。

在人类胚胎肾细胞（HEK293T）敲除实验中，野生型 TnpB 的编辑效率为 28%，v1 和 v5 分别达到 46% 和 50%；在内源基因位点上，v1 在 EMX1 位点的编辑效率甚至是野生型的 3.8 倍；特异性方面，v1 与野生型相当；在拟南芥的基因编辑实验中，v1 在几乎所有测试靶点上都优于野生型。

AI 生成变体中，离天然蛋白“最远”的是 v7，其与野生型 ISDra2 TnpB 的一致性仅为 77%，偏离程度远超此前序列语言模型设计出的蛋白。

为探究原因，研究者对 v7 在两个催化状态下的三元复合物（蛋白-RNA-DNA）分别进行冷冻电镜解析，并通过实验验证功能。

结果发现，在 RNA-蛋白界面，AI 引入的残基突变构建了一个正电荷富集区，与保留下来的野生型残基协同稳定 RNA 骨架。在 REC 域，生成的残基与 RNA-DNA 异源双链形成新的接触。而在催化裂缝上方，AI 还直接设计出了野生型 TnpB 中不存在的分子接触。