Mol Cell | +1核小体不只是转录“路障”：詹宇萌等揭示其主动调控RNA聚合酶II转录起始的新机制|atp|dna|rna聚合酶|亚基|解离|詹宇萌

真核生物的基因组并不是以裸露 DNA 的形式存在，而是缠绕在组蛋白八聚体上，形成核小体。长期以来，核小体通常被视为 RNA 聚合酶 II （ RNA polymerase II ， Pol II ）转录过程中的物理障碍：为了读取遗传信息，转录机器必须克服 DNA 与组蛋白之间稳定的相互作用。

然而，核小体是否只是转录过程中等待被清除的 “ 路障 ” ？

近日，德国马克斯·普朗克多学科科学研究所Patrick Cramer和Christian Dienemann团队在Molecular Cell在线发表题为 The +1 nucleosome functions in RNA Pol II transcription initiation and the transition to elongation 的研究论文。通过结合生化实验与冷冻电子显微镜结构分析，研究人员解析了+1核小体存在时多个转录起始及起始—延伸转换中间体，从而揭示了+1核小体调控Pol II转录起始的分子机制。该研究发现位于转录起始位点下游的第一个核小体——+1核小体——并不是被动等待Pol II到来的障碍物，而是能够主动参与转录起始，调控通用转录因子的释放，并促进转录复合物从起始阶段向延伸阶段转换。

Pol II 如何从启动子出发？

RNA Pol II 负责转录真核细胞中所有蛋白质编码基因以及部分非编码基因。在转录开始前，共激活因子 Mediator 、 TFIID 以及 TFIIA 、 TFIIB 、 TFIIE 、 TFIIF 和 TFIIH 等通用转录因子需要共同将 Pol II 招募至基因启动子，组装形成转录预起始复合物（ pre-initiation complex ，PIC）。

PIC 组装完成后， TFIIH 中的 XPB 亚基利用 ATP 水解产生的能量沿下游 DNA 转位，促使启动子 DNA 解链并形成开放复合物。随后， Pol II 开始合成 RNA ，进入初始转录阶段。这一过程并不是简单、连续的直线运动。当 RNA 链较短时，转录复合物稳定性较低，容易产生短 RNA 并发生流产转录（ abortive initiation ）。随着 RNA 逐渐延长，下游 DNA 被不断拉入 Pol II 内部，引发 “DNA 皱缩 ” （ DNA scrunching ）。当 RNA 长度达到约 10—14 个核苷酸后，转录泡上游区域重新退火，部分通用转录因子释放， Pol II 由初始转录复合物转变为延伸复合物，并最终完成启动子逃逸（ PMID: 38127763 和 PMID: 38604172 ）。

尽管这一经典模型已经得到大量结构和生化研究的支持，但此前多数研究均使用线性、无核小体的启动子 DNA 模板。因此，在更接近真实染色质环境的条件下， Pol II 如何完成转录起始并向延伸阶段转换，仍缺乏清晰的机制解释。

启动子下游的 +1 核小体

真核基因启动子的转录起始位点下游通常存在一个定位相对明确的核小体，即 +1 核小体。 +1 核小体的位置与基因活性密切相关。在部分不活跃基因中， +1 核小体靠近转录起始位点，阻碍 TFIIH 与启动子 DNA 结合；而在活跃的哺乳动物基因中， +1 核小体的上游边缘通常位于转录起始位点下游约 40—60 bp 处。此前研究发现，位于这一位置的 +1 核小体能够与 Mediator 和 TFIIH 发生相互作用，并可能协助 PIC 组装。然而，在 PIC 形成之后， +1 核小体是否还会继续参与启动子打开、初始 RNA 合成和启动子逃逸，此前尚不清楚。

为回答这一问题，研究人员在启动子 DNA 上重构了一个上游边缘位于转录起始位点下游 40 bp 处的核小体，并利用纯化的 Pol II 、 TFIID 、 TFIIH 及其他通用转录因子，在体外组装了含 +1 核小体的完整转录复合物。进一步结合核苷酸类似物、限制性转录模板、生化活性检测和冷冻电镜分析，研究人员捕获了从 PIC 到初始转录复合物，再到早期延伸复合物的多个中间状态。

+1 核小体促进 TFIID 从启动子释放

PIC 组装完成后， TFIIH 亚基 XPB 通过 ATP 依赖的 DNA 转位酶活性打开启动子 DNA 。为了研究 +1 核小体在这一过程中的作用，研究人员首先利用 ADP-BeF 3 将 XPB 锁定在 ATP 水解前的核苷酸结合状态。

在未加入 ADP-BeF 3 时，冷冻电镜结构中可以观察到包括 TFIID 在内的全部通用转录因子；而加入 ADP-BeF 3 后，研究人员未观察到 T FIID 的密度，说明+1核小体的存在会让TFIID与PIC的结合更不稳定。进一步的生化实验表明，在TFIIH结合 ADP-BeF 3 后，与线性 DNA 模板相比， +1 核小体显著促进 TFIID 从PIC的解离。

结构分析揭示了 +1 核小体促进 TFIID 解离的可能机制。在不存在 ADP-BeF3 时， TBP 相关因子 TAF1 和 TAF7 与启动子下游的 DPE 基序结合。然而，当 ADP-BeF 3 与 TFIIH 结合后， +1 核小体朝 TFIIH 方向旋转，同时 DPE 基序远离 TAF1/7 。这一构象变化使 TFIID 难以继续结合 DPE 基序：如果 TFIID 仍保持原有位置， TFIIH 的 p52/p8 亚基将与 TAF2 产生空间冲突。与此同时， +1 核小体的旋转还使 TFIIH 亚基 p52 与核小体建立接触。这一相互作用可能降低下游 DNA 的柔性，使 DPE 基序难以重新靠近 TAF1/7 ，从而阻止 TFIID 再次结合。

总体而言，这些结构表明， ATP 与 XPB 结合后，会改变启动子 DNA 的路径以及 +1 核小体相对于 PIC 的取向，从而促使 TFIID 脱离 DPE 基序。同时，重新定位后的 TFIIH p52/p8 亚基又会在空间上阻止 TFIID 重新结合。因此，在+1核小体存在的背景下，ATP与XPB结合能够推动TFIID从PIC中解离。

+1 核小体持续跟随 TFIIH 参与初始转录

为了观察 RNA 合成开始后 +1 核小体的行为，研究人员设计了能够使 Pol II 分别停滞在合成 2 nt 和 6 nt RNA 状态的启动子模板，并解析了相应的初始转录复合物结构。

在这两个结构中， TFIID 均已从复合物中消失，但 TFIIH 和 +1 核小体仍然存在。随着 RNA 从 2 nt 延长至 6 nt ，下游 DNA 不断被拉入 Pol II ，核小体也随之发生约 150° 的旋转。值得注意的是，尽管核小体的位置和取向发生了大幅变化，它始终与 TFIIH 保持接触。多体精修分析进一步显示， TFIIH 与核小体虽然可以相对于核心 PIC 共同旋转和平移，但二者之间的相互作用始终没有中断。

这说明，在 ATP 结合 TFIIH 后， +1 核小体会与 TFIIH 建立稳定联系。在第一个磷酸二酯键形成以及随后的初始 RNA 合成过程中，核小体始终伴随 TFIIH 运动。当 RNA 延长至 6 nt 时，核小体虽然已经发生显著旋转，但仍同时接触 TFIIH 的 XPB 和 p52 亚基。因此，至少在RNA长度达到6 nt之前，+1核小体都会在初始转录过程中持续与TFIIH保持相互作用。

+1 核小体增强 TFIIH 活性和初始 RNA 合成

+1 核小体与 TFIIH 的持续接触是否具有功能意义？

TFIIH 中的 XPB 是一种 ATP 依赖的 DNA 转位酶，其活性受到 p52 亚基调控。由于 +1 核小体能够同时接触 XPB 和 p52 ，研究人员推测，它可能直接影响 TFIIH 的酶活性。 ATPase 实验结果显示，与线性启动子 DNA 相比，当 +1 核小体位于转录起始位点下游 40 bp 处时， TFIIH 的最大 ATP 水解速率提高了约 1.3 倍。研究人员进一步利用三链 DNA 置换实验检测 XPB 的 DNA 转位活性。结果表明，在 +1 核小体存在时，三链 DNA 的置换量增加了约两倍，说明 TFIIH 沿 DNA 转位的能力显著增强。与此一致，初始转录实验显示， +1 核小体能够促进 6 nt RNA 产物的形成，而且这种促进作用在反应开始后 1 分钟内便已出现。值得注意的是，当核小体被放置在转录起始位点下游 70 bp 处时，其促进作用消失。这说明，+1核小体必须位于PIC附近，并与TFIIH建立直接或间接接触，才能增强初始转录

研究人员提出， +1 核小体与 p52 结合后，可能稳定 p52 与 XPB 之间的相互作用，从而增强 XPB 的 ATPase 活性。与此同时，核小体还可能限制下游 DNA 的摆动，降低 DNA 的构象自由度，使容易从 DNA 上解离的 XPB 能够更加持续、高效地向前转位。因此，在这一阶段， +1 核小体可能类似于一个 “ 支架 ” 或 “ 锚点 ” ，帮助 TFIIH 更有效地打开并拉动启动子 DNA ，为 Pol II 合成最初几个核苷酸提供动力。

+1 核小体推动 TFIIH 释放和启动子逃逸

当转录泡上游区域重新退火后， Pol II 需要摆脱残留的通用转录因子，转变为稳定的延伸复合物。此前，在不含核小体的线性 DNA 模板上解析的早期延伸复合物中，即使 RNA 已经延长至 14 nt ，研究人员仍然能够观察到 TFIIH （ PMID: 38127763 和 PMID: 38604172 ）。

相比之下，在本研究解析的含 +1 核小体的 10 nt 早期延伸复合物中，研究人员能够观察到 Pol II 和 +1 核小体，却没有观察到 TFIIH 。结构叠合显示，在这一复合物中， +1 核小体所占据的位置与此前早期延伸复合物中 TFIIH 的位置大幅重叠。也就是说，随着 Pol II 向下游转录， +1 核小体逐渐靠近转录复合物，并最终与 TFIIH 产生空间冲突，从而促进 TFIIH 离开 Pol II 。

TFIIH 的释放还可能进一步削弱 TFIIE 与复合物的结合，为延伸因子 DSIF 和暂停因子 NELF 的招募腾出空间，进而帮助转录复合物完成启动子逃逸，并进入启动子近端暂停阶段。

因此，+1核小体在转录起始过程中具有阶段特异性的双重作用：在初始转录早期，它与TFIIH相互作用并增强TFIIH活性；而当Pol II完成转录泡重排并继续向下游推进后，它又通过空间排斥促使TFIIH及时离开。

+1 核小体协调转录起始的三个关键步骤

综合结构与生化结果，研究提出了 +1 核小体调控 Pol II 转录起始 — 延伸转换的三步模型。

第一，PIC组装完成后，ATP与XPB结合，引起启动子DNA路径和核小体取向发生变化。+1核小体稳定新的DNA构象，促进TFIID从PIC中解离。