2026年7月30日，中山大学药学院刘培庆、邹永 教授团队，联合南方医科大学药学院、 中山大学附属第一医院心脏外科等单位，在Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1区，IF=14.6）发表题为 “BD2-selective BRD4 inhibitor ZX29 mitigates myocardial ischemia–reperfusion injury via BRD4–YY1–NCOA4 axis disruption and ferroptosis inhibition” 的研究论文。该文于2025年9月19日投稿，2026年3月15日修回，2026年3月18日接收。
心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）是限制缺血性心脏病治疗效果的重要障碍。本文围绕表观遗传调控因子溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）展开，针对传统泛BRD4抑制剂可能因干扰BD1基础功能而产生脱靶毒性的问题，开发了一种BD2选择性BRD4抑制剂 ZX29。研究显示，ZX29可通过结合BRD4 BD2结构域，破坏BRD4与转录因子阴阳1（Yin Yang 1，YY1）之间的相互作用，下调核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4），进而抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬、FTH1降解、铁离子释放和心肌铁死亡，同时维持线粒体稳态。
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【摘 要】
心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）仍是缺血性心脏病治疗中的重要障碍，因为再灌注治疗虽然能够恢复血流，却常常进一步加重心脏损伤。溴结构域蛋白4（BRD4）是心血管疾病中的关键表观遗传靶点，但泛BRD4抑制剂会因破坏溴结构域1（bromodomain 1，BD1）的基础功能而引发严重脱靶毒性，因此亟需开发BD2选择性药物。本研究旨在开发一种BD2选择性BRD4抑制剂，并阐明其作用机制。
研究者通过对100,000个化合物进行虚拟筛选，并结合基于结构的优化，开发出ZX29。ZX29表现出较强BRD4结合能力，IC50为0.27 ± 0.03 μmol/L，Kd为1.68 μmol/L，优于临床药物RVX-208。ZX29通过H437/V439残基特异性结合BRD4 BD2。
在小鼠MI/RI模型中，口服ZX29显著改善心脏收缩和舒张功能，缩小心肌梗死面积，并减轻脂质过氧化。机制上，ZX29破坏BRD4–YY1相互作用，并抑制NCOA4–铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）降解轴，从而抑制溶酶体二价铁释放和铁死亡。此外，ZX29还通过维持线粒体膜电位并增强ATP产生，保护线粒体功能。最终，本研究验证了选择性抑制BRD4 BD2是一种安全且有效的MI/RI治疗策略，并确立ZX29作为具有临床开发潜力的候选化合物。
01
研究背景及科学问题
溴结构域和超末端结构域蛋白（bromodomain and extra-terminal，BET）家族包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT四个成员。其中，BRD4已成为多种疾病的潜在治疗靶点，包括癌症、炎症、纤维化、心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）和病毒感染。BRD4高度富集于超级增强子区域，这些调控性基因组区域可驱动CVD中关键致病因子的表达，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。因此，靶向BET家族蛋白在CVD治疗中具有重要潜力。
目前已有多种BRD4抑制剂被开发。例如，JQ1和OTX015通过模拟乙酰化赖氨酸与BRD4溴结构域结合；嘌呤衍生物CPI-0610具有较高BRD4选择性；萘啶并吡啶类化合物TEN-010具有较好的口服生物利用度。然而，泛BRD4抑制剂会同时阻断BRD4两类不同功能：BD1维持细胞增殖等基础功能，而BD2则调控炎症、纤维化和细胞应激等疾病相关功能。因此，这类抑制剂在临床前研究和早期临床试验中表现出靶点相关毒性、非特异性治疗效应和患者耐受性不足，导致JQ1、OTX015等药物主要局限于肿瘤临床试验，目前尚无BRD4抑制剂获批用于CVD治疗。相比之下，BD2选择性抑制剂可更精准地靶向疾病相关通路，同时避免干扰正常细胞的基础生理活动，因而具有较大的研究和临床应用前景。
BD2选择性抑制剂的开发基础在于BD1和BD2结构域之间存在序列和结构差异，尤其是ZA环和BC环的氨基酸组成差异。近年来，针对BRD4 BD1或BD2结构域的特异性抑制剂开发取得了明显进展。例如，apabetalone（RVX-208）和ABBV-744对BRD4 BD2具有较高选择性；其中RVX-208是目前研究最充分的BD2特异性抑制剂，并已进入CVD治疗的III期临床试验。然而，用于CVD治疗的高特异性BRD4抑制剂仍然不足，尤其需要具有不同理化性质、药代动力学和药效学特征的新型候选药物。
缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）仍是导致心源性猝死的主要原因。为了恢复缺血心肌的血液供应，临床上可采用溶栓治疗、血管成形术、冠状动脉旁路移植术（CABG）和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）等冠状动脉血运重建策略，实现心肌再灌注。然而，氧供应的突然恢复可能诱发严重缺血/再灌注（I/R）损伤，并触发致命性心律失常。致死性再灌注损伤是当前再灌注治疗疗效的重要限制因素。因此，临床上仍迫切需要开发安全有效的治疗药物，以增强IHD患者心脏对MI/RI的耐受能力。
既往研究已经开展了多项BRD4抑制剂心脏保护作用的临床前评估。早期研究显示，JQ1可减轻链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病小鼠模型中的心脏纤维化并改善心功能；另有研究表明，JQ1可逆转横主动脉缩窄（TAC）诱导的病理性心脏重构。新型喹啉酮类BRD4抑制剂C-34能够在体外有效抑制成纤维细胞活化，并在体内减轻心脏纤维化，这与BRD4表达降低有关。在急性冠脉综合征（ACS）合并2型糖尿病（T2DM）患者中，apabetalone治疗显示出降低主要不良心血管事件（MACE）的趋势。此外，评价RVX-208在射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）和射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）中的疗效的III期临床试验也正在进行。
尽管BRD4抑制剂的心脏保护作用已有较多证据支持，但其在MI/RI中的作用仍研究不足。因此，开发更高效且具有良好成药性的新型BRD4抑制剂成为迫切需求。这类抑制剂不仅可拓展BRD4抑制剂的化学结构多样性、补充现有化合物库空白，也可为深入探索BRD4在CVD发生发展中的功能机制提供新的研究工具。
本研究通过针对BRD4开展高通量虚拟筛选，最终鉴定出具有较强活性的化合物25，其IC50为6.95 μmol/L。随后，研究者基于结构优化和生物学评价，获得一系列新型香豆素-6-甲酰胺衍生物作为BRD4抑制剂，并最终开发出ZX29。ZX29在心肌缺血再灌注损伤中表现出显著疗效。机制上，ZX29可直接与长亚型BRD4的BD2结合口袋发生广泛相互作用，从而抑制BRD4–YY1相互作用介导的NCOA4–FTH1通路激活，抑制心肌细胞铁死亡，并缓解铁死亡诱导的线粒体功能障碍。总体而言，本文为BD2特异性BRD4抑制剂治疗心肌缺血性疾病提供了新的机制认识和治疗策略。
02
重要发现及亮点
筛选具有较强活性的BRD4抑制剂候选物
在既往研究中，作者将BRD4确定为心肌疾病中的潜在致病靶点，因此进一步开展小分子BRD4抑制剂的高通量筛选。研究者首先利用基于MOE的分子对接，从ChemDiv数据库中约100,000个小分子中进行虚拟筛选，并为每个分子生成5种独立构象。根据最佳构象的London dG评分排序后，获得前2000个候选分子。随后，这些分子经过ADMET筛选，以排除存在药代动力学或毒理学问题的化合物，最终得到500个分子。研究者进一步对这500个分子进行层次聚类分析，基于Tanimoto相似性系数评估结构多样性，并通过活性位点构象叠合评估结合模式独特性。综合结构多样性和结合模式后，最终筛选出100个具有不同化学骨架的候选抑制剂。
随后，作者合成这些候选化合物，并通过单浓度和多浓度表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）筛选技术，在5 μmol/L浓度下检测其与BRD4的结合信号。共鉴定出20个命中化合物，其中化合物25与BRD4的解离常数（Kd）为13.2 μmol/L。进一步构效关系（structure–activity relationship，SAR）研究显示，R1位点对取代基高度敏感。化合物42在简化结构并直接连接香豆素核心后，IC50达到2.1 μmol/L。随后通过芳香环取代基和空间构型优化，获得ZX29，即分子44。ZX29显示出较强BRD4抑制作用，IC50为0.27 ± 0.03 μmol/L，相较化合物25活性提升约26倍。新生小鼠心肌细胞（neonatal mouse cardiomyocytes，NMCMs）经5 μmol/L受试化合物处理24 h后，细胞活力保持在80%以上，提示其细胞毒性较低。最终，ZX29被选为后续细胞实验和体内实验的先导候选物。
图1：发现新型BRD4抑制剂ZX29。（A）化合物筛选流程示意图。（B）在5 μmol/L浓度下，化合物与重组BRD4蛋白的结合信号值。（C）发现香豆素-6-甲酰胺衍生物作为BRD4抑制剂。（D）NMCMs分别用指定化合物（5 μmol/L）处理24 h。采用CCK-8实验检测细胞活力。数据以均值 ± SEM表示，n = 3。
ZX29的化学合成与结构确认
作者进一步展示了新型化合物3-(4-羟基-3,5-二甲基苯基)-6,8-二甲氧基-2H-色烯-2-酮的合成路线。ZX29的化学结构通过¹H NMR和¹³C NMR波谱得到确认。合成过程中，商业可得的3,5-二甲氧基苯甲醛与NBS经取代反应首先获得中间体2，产率为95%；商业可得的2,6-二甲基苯酚与乙醛酸经加成和还原反应获得中间体4，产率为87%。随后，中间体2和4通过Perkin反应得到化合物5，产率为74%。最终，在N₂气氛下，经CuI催化环化反应得到目标化合物6，产率为45%。
图2：试剂和反应条件：（a）NBS，CH3CN，0 °C，6 h；（b）乙醛酸，NaOH，H2O，50 °C，12 h；（c）SnCl2·2H2O，HCl，80 °C，16 h；（d）Ac2O，Et3N，120 °C，12 h；（e）CuI，K2CO3，1,10-菲咯啉，DMF，N2，130 °C，12 h。
ZX29直接靶向BRD4的BD2结构域
为探索ZX29与BRD4之间的结合模式，研究者使用MOE2019进行分子对接。模拟结果显示，ZX29定位于BRD4溴结构域2（bromodomain 2，BD2）的配体结合口袋。BRD4 BD2可通过特异性识别乙酰化赖氨酸（Kac）残基参与表观遗传调控，其中对配体结合至关重要的WPF基序通过关键氨基酸侧链形成疏水平台。值得注意的是，ZX29香豆素核心的芳香环与Val439形成双重H–π相互作用，这种多位点协同作用可能增强BD2选择性并提高结合稳定性。此外，ZX29 R1位点的苯基与BRD4残基Val439、His437和Leu385形成广泛疏水相互作用，支持ZX29具有结合BRD4的潜力。分子动力学模拟进一步确认，ZX29可稳定保留在BRD4 BD2口袋中。
SPR实验显示，ZX29与BRD4之间存在剂量依赖性相互作用，Kd为1.68 μmol/L，低于已报道BRD4抑制剂RVX-208的Kd值6.21 μmol/L。微量热泳动（MicroScale Thermophoresis，MST）进一步验证该相互作用，随着ZX29浓度升高，BRD4热泳动发生变化，得到Kd为1.6 ± 0.3 μmol/L。差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry，DSF）显示，ZX29可显著稳定BRD4-BD2结构域，ΔTm = 8 °C，而对高度保守的BRD4-BD1结构域热展开曲线无影响，ΔTm = 0 °C，提示ZX29对BD2具有优异选择性。
为验证分子对接预测的关键结合残基，作者构建了BRD4-H437E/V439K突变体。SPR分析显示，这些突变几乎完全消除了ZX29的结合亲和力。与体外动力学结果一致，HEK293T细胞中的细胞热转移实验（cellular thermal shift assay，CETSA）显示，ZX29显著增强外源性野生型BRD4的热稳定性，但无法稳定BRD4-H437E/V439K突变体。羧基包被纳米颗粒介导的Co-IP进一步验证了ZX29与BRD4的相互作用：在H9C2、AC16和HL-1细胞裂解液中，ZX29偶联纳米颗粒可有效拉下BRD4。体外竞争和突变pull-down实验进一步显示，ZX29偶联磁珠与野生型BRD4具有强亲和力，但该相互作用可被游离ZX29竞争物或BD2口袋H437E/V439K突变完全消除。总体而言，这些结果表明，ZX29可特异性、竞争性结合BRD4 BD2结构域。
图3：ZX29结合BRD4。（A）ZX29的化学结构。（B）ZX29与BRD4的分子对接结果（PDB ID：6C7Q）。（C）二维图像显示ZX29与BRD4多个氨基酸残基（H437、V439）发生相互作用。蓝色虚线表示氢键。（D）ZX29–BRD4复合物的分子动力学模拟。（E）SPR分析ZX29与BRD4蛋白的结合亲和力。（F）SPR分析RVX-208与BRD4蛋白的结合亲和力。（G）通过MST检测BRD4与ZX29的Kd值。（H–J）CETSA显示BRD4-WT以及BRD4-H437E/V439K质粒突变蛋白经ZX29（40 μmol/L）处理5 h后的热稳定性。（K）来自H9C2、AC-16和HL-1细胞的蛋白裂解液分别为第1–3泳道，与化合物ZX29偶联磁珠或单独磁珠分别为第4–6泳道孵育过夜，并通过Western blot分析。（L）通过体外竞争性pull-down实验验证ZX29与BRD4 BD2口袋之间的特异性结合。重组WT-BRD4或突变体BRD4-H437E/V439K蛋白与未偶联磁珠（Beads）或ZX29偶联磁珠（Beads-ZX29）孵育。在竞争组中，WT BRD4在加入Beads-ZX29前预先与摩尔过量游离ZX29竞争物孵育。数据以均值 ± SEM表示，n = 3。
ZX29在心肌细胞中发挥抗细胞死亡作用并破坏BRD4染色质锚定
BRD4是心血管病理过程中的关键表观遗传驱动因子，但BRD4在MI/RI中的功能作用，以及BD2选择性抑制的治疗潜力，仍未完全明确。作者首先检测人心肌组织中的BRD4表达，发现与健康供体心脏相比，心梗后再灌注患者的衰竭心脏中BRD4蛋白水平显著升高。健康心肌中，BRD4呈较弱、弥散性核定位，核内焦点稀少；而衰竭心脏中BRD4明显上调，且核内焦点形成增强。鉴于泛BRD4抑制剂存在剂量限制性毒性，研究聚焦开发BD2选择性BRD4抑制剂，并以临床药物RVX-208作为阳性对照。
随后，研究者在缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的NMCMs中评价ZX29的抗细胞死亡作用。TUNEL染色、CCK-8实验和流式细胞术结果一致显示，ZX29以剂量依赖方式抑制H/R诱导的心肌细胞死亡，其中1 μmol/L ZX29的效果强于等剂量RVX-208。机制上，ZX29和RVX-208均不改变总BRD4蛋白或Brd4 mRNA水平，提示这些抑制剂并不调控BRD4表达。然而，ZX29显著减少H/R暴露NMCMs中BRD4核内焦点数量，而BRD4核内焦点是染色质锚定转录活性的标志。这提示ZX29主要破坏BRD4的染色质结合，而不是降低其表达。
PLA实验进一步显示，ZX29以剂量依赖方式抑制BRD4与活性染色质标记H3K27ac之间的相互作用，并抑制BRD4靶基因Rela转录。靶点特异性救援实验显示，过表达野生型BRD4可完全逆转ZX29的抗细胞死亡作用，并恢复Rela转录。此外，BRD4的ZX29结合BD2结构域突变可完全消除ZX29的抗细胞死亡活性，而BD1结构域突变则无此影响。综合来看，ZX29通过选择性、靶向性抑制BRD4 BD2结构域发挥抗细胞死亡作用，并破坏心肌细胞中BRD4染色质锚定的转录调控功能。
图4：ZX29通过抑制铁死亡减少心肌细胞死亡。（A）评估正常个体和心力衰竭（HF）患者左心室中BRD4免疫密度（每张盖玻片15个视野，n = 4，比例尺 = 200 μm）。（B）正常个体和HF患者左心室切片中BRD4的荧光检测（每张盖玻片15个视野，n = 4，比例尺 = 20 μm）。（C）正常个体和HF患者左心室中BRD4蛋白水平。（D）NMCMs经ZX29低剂量0.5 μmol/L、高剂量1 μmol/L和RVX-208 1 μmol/L处理后，再进行H/R处理，采用TUNEL实验检测细胞死亡。TUNEL绿色代表细胞死亡（比例尺 = 50 μm）。（E、G）采用流式细胞术分析凋亡细胞百分比（n = 3）。（F）采用CCK-8实验检测不同处理条件下NMCMs的细胞活力（n = 3）。（H、I）采用抗BRD4抗体进行免疫组织荧光染色，BRD4为绿色，并展示包含细胞核的合并图像（每组15个细胞，n = 3，比例尺 = 20 μm）。（J）NMCMs经ZX29低剂量0.5 μmol/L、高剂量1 μmol/L和RVX-208 1 μmol/L处理后再接受H/R处理，检测BRD4蛋白水平。（K）NMCMs用抗BRD4和抗H3K27ac抗体染色，并进行原位PLA检测（比例尺 = 5 μm）。（L）采用qRT-PCR检测细胞中Brd4 mRNA水平（n = 4）。（M）采用qRT-PCR检测经ZX29和RVX-208处理的NMCMs中Rela mRNA水平（n = 4）。（N）转染BRD4-Flag的NMCMs中采用TUNEL实验检测细胞死亡（比例尺 = 50 μm）。（O）采用CCK-8实验检测不同处理条件下NMCMs的细胞活力（n = 4）。（P）采用Western blot检测ZX29处理NMCMs中BRD4、BAX和Bcl2蛋白水平（n = 3）。（Q）采用qRT-PCR检测转染BRD4-Flag的NMCMs中Rela mRNA水平（n = 4）。（R）BRD4-Flag和BRD4-H437E/V439K处理的NMCMs中采用TUNEL实验检测细胞死亡（比例尺 = 50 μm）。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29减轻体内MI/RI并改善心肌功能
剂量递增研究确定20 mg/kg/day为最佳心脏保护剂量，并具有较宽的临床前安全范围。在MI/RI模型和预防性给药方案中，ZX29以剂量依赖方式缩小心肌梗死面积，使梗死面积/左心室面积（IA/LV）比值显著降低；值得注意的是，高剂量ZX29在等剂量条件下疗效优于临床BD2抑制剂RVX-208。超声心动图评估显示，ZX29可保护收缩和舒张功能，表现为左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）升高，左心室收缩末期和舒张末期内径（LVESD和LVEDD）降低，并恢复二尖瓣E/A比值。
在生化水平，ZX29剂量依赖性降低心肌caspase-3活性、血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及循环心肌损伤标志物cTnT、NT-proBNP、CK-MB和LDH。TUNEL实验确认，ZX29显著减少梗死边缘区凋亡心肌细胞，这与Bcl-2/Bax比值升高一致，而总BRD4蛋白水平未发生改变。机制上，ZX29不改变总BRD4蛋白水平，但减少核内BRD4焦点数量，并抑制Rela转录，从而形成明显抗炎表型。免疫组织化学进一步证实，ZX29减轻MI/RI诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6升高，并减少CD68⁺巨噬细胞浸润。
值得注意的是，在再灌注开始时启动的治疗性给药方案中，ZX29同样能够缩小梗死面积并保护心功能，且在这两项指标上优于泛BET抑制剂JQ1。与RVX-208不同，ZX29不影响血清脂质水平，说明其心脏保护作用并不依赖系统性脂质调节。AAV9-cTnT-shBRD4介导的心肌细胞特异性BRD4敲低实验进一步证实，BRD4对ZX29保护作用是必需的，因为BRD4敲低完全消除了ZX29的保护效应。安全性分析显示，ZX29在治疗剂量下耐受性良好，未检测到明显肝毒性、肾毒性或血液学毒性。尤其重要的是，与会引起严重血小板减少的泛BET抑制剂JQ1不同，ZX29可完全维持血小板计数及其他血液学参数。此外，ZX29还减轻MI/RI诱导的白细胞增多，进一步支持其抗炎活性。
图5：ZX29显著减轻MI/RI导致的心脏损伤。（A）ZX29和RVX-208在小鼠中的给药示意图。ZX29和RVX-208溶解于含10%二甲基亚砜（DMSO）和90%玉米油的溶剂中，并按指定剂量和频率经口服灌胃给药。C57BL/6J小鼠给予ZX29低剂量10 mg/kg/day、高剂量20 mg/kg/day和RVX-208 20 mg/kg/day后，进行左前降支冠状动脉阻断45 min，随后再灌注24 h。（B、C）小鼠接受心脏缺血和24 h再灌注后的心肌梗死面积（n = 3）。展示代表性TTC染色结果。（D）检测小鼠心肌caspase-3活性。（E）血清MDA定量分析（n = 6）。（F–J）进行超声心动图测量LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD（n = 8）。（K–N）实验动物血清NT-proBNP、CK-MB、LDH和cTnT水平（n = 6）。（O）TUNEL染色心脏组织代表性图像及TUNEL阳性细胞定量（比例尺 = 50 μm）。（P）检测并定量心脏中BRD4、BAX和Bcl2表达（n = 4）。（Q）小鼠TNF-α、IL-1β和CD68免疫组织化学染色代表性图像。（R）采用脉冲波多普勒（PWD）评估小鼠舒张功能的代表性超声心动图图像。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29改善MI/RI诱导的病理性心肌重构
MI/RI诱导的心脏重构是关键病理过程，因为不良重构会推动心力衰竭进展。为确定ZX29是否通过靶向并抑制BRD4来改善心肌重构，作者在I/R后2周评估小鼠心肌纤维化和肥大指标。Masson三色染色显示，ZX29和RVX-208均显著减少胶原沉积。为从生化层面验证组织学结果，作者检测心肌羟脯氨酸含量这一组织纤维化金标准指标。结果与形态学观察一致，ZX29剂量依赖性减轻MI/RI诱导的梗死心脏羟脯氨酸积累。相反，麦胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色显示，ZX29和RVX-208均未改善病理性心肌肥大。
与假手术小鼠相比，MI/R小鼠Col3a1、Ctgf、α-Sma和fibronectin表达显著上调；ZX29以剂量依赖方式减弱这些改变。此外，ZX29给药下调Tgfb1及其下游效应因子Smad3的mRNA表达，提示ZX29介导的BRD4抑制限制TGF-β1信号转导。Western blot分析确认，ZX29不影响心肌组织中心肌肥大标志物β-MHC和ANF水平。考虑到心脏成纤维细胞迁移和侵袭会促进MI/R后心肌纤维化，作者使用Ang II建立心脏纤维化模型。CCK-8、划痕和Transwell实验显示，ZX29剂量依赖性抑制新生小鼠心脏成纤维细胞（neonatal mouse cardiac fibroblasts，NMCFs）的增殖、迁移和侵袭。Western blot进一步显示，ZX29剂量依赖性抑制Ang II诱导的纤维化标志物fibronectin和α-SMA上调，但不影响肥大标志物表达。免疫荧光染色显示，BRD4过表达可逆转ZX29对NMCFs中fibronectin表达的抑制作用。Rhodamine–Phalloidin标记F-actin的结果显示，Ang II诱导NMCMs表面积明显增加，而ZX29和RVX-208均不能降低该增大，进一步支持体内结果，即ZX29不减轻病理性心肌细胞肥大。
图6：ZX29减轻心脏纤维化但不影响心脏肥大。（A）MI/RI后2周，采用苏木精-伊红染色显示代表性全心横截面及相应梗死边缘区放大图像（比例尺 = 200 μm），并采用Masson三色染色检测纤维化。Masson三色染色心脏切片用于检测纤维化（比例尺 = 200 μm）。检测WGA染色（比例尺 = 100 μm）。（B、C）不同小鼠组中心脏纤维化和心肌细胞横截面积定量（n = 6）。（I）采用Western blot检测ZX29处理小鼠心脏组织中Fibronectin和SMA蛋白水平（n = 4）。（D–H）采用qPCR检测ZX29处理心脏组织中Col3a1、Ctgf、Sma、Tgfb1和Smad3 mRNA水平（n = 4）。（E）采用Western blot检测si-ATAD3A处理NMCFs中Fibronectin和SMA蛋白水平（n = 3）。（F）WGA染色（比例尺 = 50 μm）。（J）采用Western blot检测ZX29处理小鼠心脏组织中ANF和β-MHC蛋白水平（n = 4）。（K、L）NMCFs在0 h和24 h划痕愈合的代表性图像。定量分析各组迁移率（n = 4）。（M、N）Transwell实验代表性图像，显示结晶紫染色的侵袭细胞（比例尺 = 100 μm；n = 4）。（O、P）新生小鼠心脏成纤维细胞（NMCFs）进行fibronectin免疫染色（比例尺 = 20 μm；n = 4）。（Q、R）测量NMCMs表面积（比例尺 = 20 μm；n = 4）。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29抑制MI/RI诱导的心脏铁死亡
虽然ZX29在体内表现出明确表型获益，但驱动其心脏保护作用的下游分子执行机制仍需明确。为解析ZX29介导心脏保护的分子机制，研究者对Sham、MI/RI和MI/RI + ZX29（20 mg/kg）小鼠心肌组织进行RNA测序。差异表达基因的KEGG富集分析显示，铁死亡通路是ZX29调控最显著的通路，且ZX29明显逆转MI/RI诱导的铁死亡相关基因紊乱。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）进一步验证，MI/RI可诱导强烈促铁死亡基因特征，而ZX29可显著减弱这一特征，提示抑制铁死亡是ZX29保护作用的核心介导机制。
随后，作者从分子和功能层面验证转录组结果。ZX29剂量依赖性纠正MI/RI诱导的经典铁死亡标志基因Ptgs2、Slc7a11和Ncoa4在受损心肌中的表达紊乱。与转录变化一致，免疫荧光和Western blot显示，MI/RI上调促铁死亡蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4），并下调铁死亡抑制蛋白GPX4和FTH1，而ZX29可以剂量依赖方式完全逆转这些效应。功能上，生化定量显示，ZX29剂量依赖性减轻MI/RI诱导的心肌脂质过氧化，表现为MDA含量显著降低。DHE和普鲁士蓝染色进一步显示，ZX29剂量依赖性消除MI/RI诱导的心肌活性氧（reactive oxygen species，ROS）和总铁水平升高。此外，ZX29显著恢复MI/RI损伤导致的心肌还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）耗竭。总体而言，这些结果表明，ZX29可在小鼠MI/RI模型中抑制心脏铁死亡。
图7：ZX29改善MI/RI诱导的心脏组织铁死亡。（A）RNA-seq分析揭示三组小鼠心脏中的差异表达基因：sham（n = 3）、MI/RI（n = 3）和MI/RI + ZX29（20 mg/kg，灌胃；n = 3）。（B）热图显示小鼠心脏组织RNA-seq分析中检测到的铁死亡相关基因。基因表达采用行Z-score进行标准化。（C）ZX29（20 mg/kg）处理小鼠心脏相较MI/RI小鼠心脏的调控基因GSEA分析。（D）检测小鼠心脏MDA水平（n = 4）。（E–G）采用qPCR检测ZX29处理心脏组织中Ptgs2、Ncoa4和Slc7a11 mRNA水平（n = 6）。（H–J）采用Western blot检测心脏组织中NCOA4和FTH1蛋白水平（n = 4）。（K–N）小鼠中cTnT与GPX4、ACSL4和FTH1共荧光免疫组织化学染色的代表性图像及定量（n = 6）。（O、P）DAB增强普鲁士蓝染色的代表性图像和阳性面积百分比（比例尺 = 100 μm）。（O、Q）DHE荧光免疫组织化学染色代表性图像及定量（比例尺 = 20 μm）。（R）检测心脏GSH水平（n = 6）。统计学显著性采用单因素方差分析并进行Tukey多重比较检验。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29通过BRD4抑制NCOA4–FTH1通路以减轻心肌细胞铁死亡
NCOA4介导的铁蛋白自噬及随后的FTH1降解是铁死亡的核心驱动因素。鉴于体内结果显示，ZX29诱导的BRD4抑制可反向调节NCOA4和FTH1表达，作者首先界定BRD4与NCOA4–FTH1轴在心肌细胞铁死亡中的功能联系。Western blot显示，在H/R损伤过程中，NMCMs中BRD4和NCOA4随时间同步上调，而FTH1逐渐下调，提示BRD4可能调控NCOA4–FTH1轴。功能获得和缺失实验进一步验证，BRD4是心肌细胞铁死亡的正调节因子：铁死亡抑制剂Fer-1可部分逆转BRD4过表达诱导的心肌细胞死亡，而BRD4敲低显著增强细胞活力并减少LDH释放。
在H/R损伤的NMCMs中，ZX29剂量依赖性纠正H/R诱导的经典铁死亡标志物紊乱，包括使Ptgs2表达正常化，恢复铁死亡抑制因子FTH1和GPX4水平，并下调铁蛋白自噬介导因子NCOA4。ZX29还减轻H/R诱导的细胞内Fe²⁺过载、ROS产生、脂质过氧化和MDA积累，细胞计数定量也确认其可剂量依赖性减少铁死亡细胞数量，同时补充耗竭的细胞内GSH水平。这些数据证实，ZX29可在体外保护心肌细胞免受H/R诱导的铁死亡。BRD4过表达则完全消除ZX29对铁死亡的保护作用，并逆转ZX29对NCOA4–FTH1通路的抑制。综合而言，ZX29通过BRD4依赖性抑制NCOA4–FTH1轴，减轻心肌细胞铁死亡。
图8：ZX29对NCOA4–FTH1通路的抑制作用。（A）Western blot分析缺血后不同时间点（0、3、6、12和24 h）NMCMs中BRD4、NCOA4和FTH1蛋白水平。相对蛋白水平以GAPDH归一化进行定量分析（n = 3）。（B、C）在指定条件下，采用CCK-8实验检测NMCMs细胞活力，包括EV、BRD4-Flag、siNC、siBRD4，伴或不伴H/R和Fer-1处理（n = 4）。（D）检测小鼠心脏LDH含量（n = 4）。（E）采用Western blot检测ZX29处理NMCMs中GPX4、NCOA4和FTH1蛋白水平（n = 4）。（F）在指定条件下，采用C11-BODIPY染色并通过流式细胞术分析NMCMs中脂质活性氧，包括DMSO、H/R、不同剂量H/R + ZX29；n = 3。（G）qPCR分析Ptgs2 mRNA水平（n = 3）。（H、I）在指定条件下，采用生化实验检测NMCMs中MDA和GSH水平，包括DMSO、H/R、H/R + ZX29。（J、K、Q）FerroOrange染色胞质Fe²⁺的代表性荧光图像及定量分析（比例尺 = 20 μm）。（N、L）DHE染色ROS的代表性荧光图像及定量分析（比例尺 = 20 μm）。（M）指定处理条件下NMCMs细胞计数定量（n = 4）。（O）在指定条件下，采用C11-BODIPY染色并通过流式细胞术分析细胞中脂质活性氧，包括DMSO、H/R、不同剂量H/R + ZX29；n = 3。（P）NMCMs中MDA活性定量分析（n = 6）。（R）采用Western blot检测ZX29处理NMCMs中NCOA4和FTH1蛋白水平（n = 4）。（S）检测NMCMs中GSH/GSSG比值（n = 4）。（T）FerroOrange染色胞质Fe²⁺的定量分析（n = 4）。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29通过抑制BRD4–YY1相互作用缓解MI/RI诱导的铁死亡
为评估ZX29对NMCMs中BRD4染色质结合动态的影响，作者进行了荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）实验。结果显示，ZX29可剂量依赖性加速BRD4-GFP漂白后的荧光恢复，说明ZX29促进BRD4从染色质上解离，并削弱其招募下游转录调节因子的能力。进一步，非偏倚IP–MS互作组筛选显示，ZX29处理后BRD4互作组发生显著重塑。研究者重点关注YY1，原因包括：BRD4–YY1相互作用对ZX29最敏感，处理后解离最明显；同时JASPAR数据库生物信息学分析预测，YY1在Ncoa4启动子区域具有高亲和力结合位点，而Ncoa4是研究中的核心铁死亡靶点。因此，作者提出ZX29可能通过破坏BRD4–YY1轴调控Ncoa4转录。
公共人心肌单细胞RNA测序数据分析显示，BRD4和YY1具有几乎相同的细胞分布模式，主要在心肌细胞和心脏成纤维细胞中共表达。GEPIA 2.0数据库相关分析进一步确认，在人左心室样本中BRD4与YY1表达呈强正相关。随后，作者在体外和体内验证BRD4–YY1相互作用及其被ZX29调控的情况。小鼠心肌切片原位PLA显示，MI/RI显著增强BRD4–YY1相互作用，而ZX29可剂量依赖性抑制该相互作用。Co-IP和免疫荧光共染色证实，人衰竭心脏和小鼠心脏中BRD4–YY1相互作用显著上调；ZX29通过直接结合BRD4 BD2结构域抑制这一相互作用，而BRD4过表达可逆转该效应。计算对接和体外GST pull-down进一步确认BRD4与YY1之间存在直接物理结合。与这些调控结果一致，免疫组织化学定量显示，ZX29剂量依赖性降低MI/RI诱导的心肌NCOA4蛋白上调。
为了明确BRD4–YY1相互作用与铁死亡之间的功能联系，作者进一步研究Yy1是否转录调控关键铁蛋白自噬介导因子Ncoa4。ChIP–qPCR证实，Yy1特异性且排他性结合Ncoa4启动子中第一个预测核心基序TCCATC。双荧光素酶报告实验进一步验证，Yy1可通过该基序直接驱动Ncoa4转录：Yy1敲低显著抑制野生型Ncoa4启动子活性，而核心结合基序突变完全消除启动子活性。Yy1过表达或敲低还可双向调节NMCMs中Ncoa4 mRNA和蛋白水平。关键的是，ZX29可抑制表达野生型BRD4或BRD4-BD1突变体的细胞中H/R诱导的Ncoa4上调，但当ZX29结合BD2结构域发生H437E/V439K突变时，该作用完全消失。
作者进一步确认，ZX29通过BRD4–YY1–NCOA4轴抑制铁蛋白自噬和铁死亡。Co-IP实验显示，ZX29破坏缺血心肌中NCOA4–FTH1相互作用；在H/R挑战的NMCMs中，Co-IP同样证实ZX29剂量依赖性削弱细胞内NCOA4–FTH1蛋白相互作用。共聚焦显微镜显示，ZX29减少H/R诱导的溶酶体Fe²⁺积累及FTH1–溶酶体共定位。救援实验进一步表明，Ncoa4过表达可完全逆转ZX29的抗铁死亡作用，包括消除ZX29对脂质ROS产生、细胞内Fe²⁺过载和铁死亡细胞死亡的抑制作用，也逆转其对Ptgs2表达、GSH/GSSG比值和脂质过氧化的影响。总体而言，这些数据证明，ZX29通过破坏BRD4–YY1相互作用，抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬，从而在MI/RI过程中抑制心肌细胞铁死亡。
图9：ZX29抑制心肌缺血再灌注中的BRD4–YY1相互作用。（A）指定条件下NMCMs中BRD4-GFP的FRAP分析。代表性图像显示漂白前0 s、漂白后即刻和漂白后120 s的荧光恢复（比例尺 = 10 μm；n = 4）。（B）公共单细胞RNA-seq数据集通过单细胞RNA测序显示人心脏组织中BRD4和YY1在不同细胞类型中的表达。（C）通过GEPIA2.0分析人心脏组织中BRD4和YY1表达的相关性。散点图显示二者呈正相关（R = 0.85，P = 1.5e-57）。（D）小鼠接受MI/RI及指定处理后，代表性图像和定量分析显示心肌切片中原位PLA检测BRD4–YY1相互作用。白色矩形框表示下排高倍放大显示区域。数据以均值 ± SEM表示（n = 4）。（E）Co-IP分析健康和衰竭人心脏临床样本中BRD4与YY1的内源性相互作用。数据以均值 ± SEM表示（n = 3）。（F）YY1与BRD4染色的代表性荧光图像（比例尺 = 20 μm；n = 3）。（G）心肌组织中BRD4与YY1相互作用的IP分析。左侧为代表性Western blot条带；右侧为相对条带密度定量分析（n = 3）。（H）通过GST pull-down鉴定YY1与BRD4之间的相互作用。GST单独蛋白和GST融合蛋白在pull-down实验前经亲和纯化。（I）评估正常个体和HF患者左心室中NCOA4免疫密度（每张盖玻片15个视野，n = 4，比例尺 = 200 μm）。（J）JASPAR网站预测YY1在NCOA4启动子序列中具有结合位点。ChIP实验评估YY1与NCOA4之间的结合（n = 3）。（K）ChIP–qPCR分析验证YY1与AC16细胞中NCOA4启动子预测位点之间的物理结合。正常兔IgG作为阴性同型对照（n = 3）。（L）细胞共转染野生型（NCOA4-WT-Luc）或突变型（NCOA4-MUT-Luc）启动子报告质粒，以及siNC或siYY1后，进行双荧光素酶报告实验（n = 3）。（M）Western blot分析ZX29处理NMCMs中YY1、NCOA4和BRD4蛋白水平（n = 3）。（N）在指定条件下，采用C11-BODIPY染色并通过流式细胞术分析细胞中脂质活性氧（n = 3）。（O）左：IP实验检测指定条件下FTH1与NCOA4的相互作用；右：FTH1条带密度经IgG归一化后的定量分析。（P）FerroOrange染色胞质Fe²⁺的代表性荧光图像及定量分析（比例尺 = 20 μm；n = 4）。（Q）指定处理条件下NMCMs细胞计数定量（n = 4）。数据以均值 ± SEM表示。
ZX29通过抑制BRD4维持线粒体结构和功能稳态
在确认ZX29可破坏BRD4–YY1–NCOA4轴并抑制铁蛋白自噬后，作者进一步研究其下游亚细胞后果。由于线粒体是铁死亡的重要执行部位，铁过载可驱动灾难性脂质过氧化和代谢崩溃，作者提出ZX29的最终心脏保护效果可能依赖于维持线粒体稳态。体外实验显示，在H/R处理的NMCMs中，ZX29剂量依赖性抑制线粒体铁积累和局部脂质过氧化。因此，ZX29可防止H/R诱导的线粒体碎片化，维持高度互联的线粒体网络。Seahorse细胞外通量分析显示，ZX29显著恢复受损心肌细胞的最大呼吸能力和ATP产生。与抑制铁死亡损伤一致，ZX29还逆转H/R诱导的线粒体DNA（mtDNA）拷贝数耗竭，稳定线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），并抑制线粒体ROS（mtROS）产生。
为提供体内证据，作者采用透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观察小鼠缺血心肌微结构。溶剂处理的MI/RI模型中，心肌细胞出现典型铁死亡形态学特征，包括线粒体显著肿胀、外膜广泛破裂以及嵴严重溶解。相反，ZX29治疗可剂量依赖性保护线粒体超微结构。高剂量ZX29明显逆转缺血诱导的结构损伤，维持完整外线粒体膜和排列良好的致密嵴结构，使其接近健康心肌。线粒体损伤评分定量进一步证实，ZX29可剂量依赖性保护缺血心脏组织免受线粒体超微结构损伤。最后，BRD4过表达完全消除了ZX29维持MMP、抑制mtROS产生和保持线粒体网络完整性的能力。TMRE和NAO流式检测也验证，ZX29对MMP丢失和心磷脂过氧化的改善作用完全以BRD4依赖方式被逆转。
图10：ZX29通过抑制BRD4恢复心脏线粒体稳态。（A）NMCMs线粒体代表性图像（比例尺 = 10 μm）。对指定条件下碎片化线粒体进行定量（n = 4）。（B、C）使用MitoPeDPP检测线粒体脂质过氧化物（LPs）的代表性荧光图像，并通过荧光强度定量分析确定NMCMs中LPs水平（绿色，MitoPeDPP；红色，MitoBright LT Deep Red；比例尺 = 20 μm；n = 4）。（D）HL-1细胞中OCR的Seahorse实验。细胞经ZX29处理。图中显示ATP产生和最大呼吸的计算结果。（E）通过测量D-Loop延伸评估mtDNA复制（n = 4）。（F）指定组小鼠心肌组织中线粒体超微结构的代表性TEM图像（比例尺 = 1.0 μm；n = 3）。（G–I）JC-1染色和mtSOX Deep Red染色的代表性荧光图像及定量分析（比例尺 = 20 μm；n = 4）。（J）再灌注24 h后检测心脏线粒体结构（比例尺 = 2 μm；n = 3）。（K）BRD4-Flag和ZX29处理NMCMs中线粒体的电子共聚焦显微镜图像（比例尺 = 5 μm；n = 3）。（L）采用TMRE测量线粒体膜电位的记录（n = 3）。（M）采用壬基吖啶橙（Nonyl Acridine Orange，NAO）测量线粒体膜结构完整性的记录（n = 3）。数据以均值 ± SEM表示。
【贡献】★★★★★
本研究验证了BD2选择性BRD4抑制是一种安全且有效的MI/RI干预策略，其作用靶向三个相互关联的病理过程，包括纤维化、铁死亡和线粒体功能障碍。ZX29相较RVX-208表现出更强疗效、较好的安全性特征以及潜在口服生物利用度，这些优势提示其具有作为临床候选药物进一步开发的潜力。未来研究应重点优化ZX29的药代动力学，并探索其与标准再灌注治疗之间的协同效应。总体而言，本研究强调BD2选择性抑制剂有望应对MI/RI治疗中尚未满足的临床需求。
机制层面，本文提出ZX29通过特异性结合BRD4 BD2，破坏BRD4与YY1之间的相互作用，进而抑制YY1驱动的Ncoa4转录。NCOA4下调后，NCOA4–FTH1相互作用和铁蛋白自噬受到抑制，溶酶体Fe²⁺释放减少，心肌细胞铁死亡减轻。与此同时，ZX29维持线粒体膜电位、抑制线粒体ROS和局部脂质过氧化，并保护线粒体超微结构，从而改善心肌能量代谢和细胞存活。
作者也指出，本研究仍存在局限。作为表观遗传调节剂，ZX29可能对染色质景观产生多效性影响，但当前研究尚未通过全基因组多组学系统描绘ZX29介导的表观遗传调控范围。未来仍需利用ATAC-seq、ChIP-seq或CUT&Tag等技术，全面解析缺血心肌中ZX29引起的全局染色质变化和全转录组药理学特征。此外，尽管本文基于临床前剂量探索提出20 mg/kg为具有较宽安全边界的有效剂量，但ZX29的进一步药代动力学优化、长期安全性评价以及与临床标准再灌注治疗联合应用的研究仍十分必要。
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