Mol Cell | 朱广李等揭示尤文肉瘤中EWS-FLI1通过双重机制摧毁POLQ剪接与功能，导致MMEJ缺陷|dna|尤文|新适应症|显子|朱广李|特异性|细胞|肉瘤|蛋白

尤文肉瘤（Ewing sarcoma）是好发于儿童和青少年的高侵袭性骨与软组织肿瘤，其标志性分子事件是染色体t(11;22)易位产生融合致癌基因 EWS-FLI1 ，并导致一个野生型 EWSR1 等位基因的缺失。尤文肉瘤患者对放疗和化疗最初往往反应良好，但复发或难治性患者5年生存率仅约10%左右。有趣的是，尤文肉瘤肿瘤基因组的体细胞突变负荷极低，但该肿瘤却表现出对DNA损伤修复抑制剂（如ATR抑制剂）等十分敏感，提示尤文肉瘤存在一种特殊的 DNA修复通路缺陷。

哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所Alan D’Andrea教授团队近年来系统性地在多种肿瘤中追踪微同源介导末端连接（Microhomology-Mediated End-Joining,MMEJ）这一由DNA聚合酶 θ （Pol θ ，由 POLQ 基因编码）驱动的低保真、易错修复通路。该团队此前已证实Pol θ 抑制剂可选择性靶向HR缺陷型肿瘤【1】，并在套细胞淋巴瘤【2】和HPV16阳性肿瘤【3】中揭示癌基因与复制压力及 MMEJ依赖性的关联；此外，该团队近期还在横纹肌样瘤中发现 SMARCB1 缺失通过阻断 POLQ mRNA核质转运造成MMEJ缺陷【4】。这一系列工作为解决尤文肉瘤中的这一谜题奠定了基础。

近日，Alan D’Andrea教授（通讯作者）与Shuhei Asada博士（共同第一作者）、朱广李（Guangli Zhu，共同第一作者）等在Molecular Cell上在线发表了题为Disruption of Microhomology-mediated End-joining in Ewing Sarcoma的研究论文【5】。该研究首次证实尤文肉瘤是一种存在明确MMEJ通路缺陷的人类肿瘤，并且完整地回答了“为什么会缺陷”这一问题。研究团队发现了两层紧密关联又彼此独立的分子机制。其一，剪接因子EWSR1与FUBP1、KHSRP组装成复合体，通过直接结合 POLQ 第25号外显子内一个此前未知的顺式调控元件，保障该外显子被正常保留、使得 Pol θ 蛋白得以完整翻译；其二，尤文肉瘤特异性表达的融合致癌蛋白EWS-FLI1，通过与野生型EWSR1直接结合形成异源二聚体，显性抑制了这一剪接保护机制，同时还独立破坏了Pol θ 在有丝分裂期DNA断裂位点的foci组装。

研究首先发现，在多项CRISPR筛选中，EWSR1敲除所产生的细胞表型与POLQ、XRCC1、APEX2等一批已知MMEJ基因的敲除高度相似，提示EWSR1可能是一个新的MMEJ通路成员。功能验证显示， EWSR1 敲除对同源重组活性影响很小，却显著降低MMEJ活性，其细胞表型（对放疗、拓扑异构酶抑制剂、ATR抑制剂敏感，以及与 BRCA1/2 缺陷之间的合成致死关系）与 POLQ 敲除高度重合。更直接的线索来自Pol θ 本身， EWSR1缺失细胞中Pol θ 蛋白显著减少，而蛋白稳定性实验以及蛋白酶体、自噬抑制剂处理均无法解释这一减少，提示问题出在翻译前的环节。顺着EWSR1的剪接因子身份，研究团队对野生型与 EWSR1 敲除细胞进行了深度RNA-seq分析，发现 POLQ 前体mRNA第25号外显子的跳读显著增加，这一跳读会引入提前终止密码子，使Pol θ 蛋白截短失活。

由于 EWSR1 缺失会引发大量剪接改变，为了明确 POLQ exon 25跳读与尤文肉瘤细胞的M MEJ缺陷的直接因果关系，研究团队设计了一个巧妙的内源基因编辑策略。研究团队利用CRISPR/Cas9技术，分别在 EWSR1 缺失的RPE1细胞和尤文肉瘤细胞系A673细胞的基因组中，将两个 POLQ 等位基因exon 24位点下游整段基因组序列替换为不含内含子的exon 24–30 cDNA片段外加3’UTR，使得 POLQ exon 25无法跳读，同时完整保留基因其余的调控环境不受干扰。结果显示，这一cDNA敲入策略不仅精准恢复了 POLQ exon 25的正常剪接、Pol θ 蛋白表达和MMEJ活性，还逆转了两个细胞系一系列下游的对DNA损伤修复抑制剂的高敏感表型。这一系列实验从内源基因组层面提供了最直接的因果证据，证明 POLQ exon 25跳读本身就是是连接 EWSR1 缺失与MMEJ缺陷、乃至下游治疗脆弱性之间的关键分子枢纽，而不只是一个伴随现象。相比常规的敲低-回补实验，这种直接在内源基因组纠正单一外显子剪接缺陷的策略，为整条因果链条提供了干净、扎实的遗传学证据。

为了进一步解析EWSR1调控 POLQ exon 25跳读的具体分子机制，研究团队借助定制的dCasRx tiling筛选和mini‑gene剪接报告系统，进一步在exon 25内锁定了一个仅6个碱基（GAGCTG）的外显子剪接增强子（ESE），并利用邻近标记技术（CARPID）直接证实EWSR1-FUBP1-KHSRP复合体在细胞内定位于这一元件之上；无论是破坏该元件，还是敲除复合体中任一成员，均导致 POLQ exon 25跳读、Pol θ 丢失和MMEJ功能障碍。这一发现首次揭示，MMEJ通路的活性可以受到POLQ单一外显子层面的精细剪接调控，提示Polθ的表达受到精密的调控。

在阐明正常细胞中的剪接保护机制后，研究进一步聚焦尤文肉瘤特异性的致病环节。t(11;22)易位在导致一个野生型 EWSR1 等位基因缺失的同时，产生了EWS-FLI1融合蛋白，而后者可与残余的野生型EWSR1直接结合形成异源二聚体。研究显示，仅 EWS-FLI1的表达本身就足以在报告系统和尤文肉瘤细胞系中显著降低 POLQ exon 25的正确剪接和MMEJ活性，而敲低EWS-FLI1或使用其丧失形成凝聚体能力的37YS突变体，均可逆转这一效应。利用CARPID技术，研究团队进一步证实EWS-FLI1并非通过竞争性结合ESE的RNA序列发挥作用，而是通过蛋白-蛋白相互作用直接“劫持”EWSR1，使EWSR1-FUBP1-KHSRP复合体无法正常定位到exon 25的ESE位点，这是一种典型的显性负性抑制机制。此外，研究还发现EWS-FLI1存在独立于剪接调控之外的第二机制。 Pol θ 在有丝分裂期DNA断裂位点组装成的功能性foci在EWS-FLI1表达细胞中被显著破坏。两条彼此独立又相互协同的机制共同将尤文肉瘤细胞的MMEJ修复能力压制到极低水平。

研究团队进一步在患者来源的原发肿瘤样本中验证了上述发现的临床相关性：与骨肉瘤、神经母细胞瘤、Wilms瘤、横纹肌肉瘤等其他儿童实体瘤相比，尤文肉瘤肿瘤样本表现出更高频率的 POLQ exon 25跳读，全基因组测序中微同源缺失和模板化插入等MMEJ修复“疤痕”特征也显著减少，而经典HR缺陷标志物（ID-6、SBS3印记）却基本缺失，从基因组层面独立确证尤文肉瘤是一种HR功能正常、但MMEJ特异性缺陷的肿瘤类型。

研究团队验证了基于尤文肉瘤细胞对FA、HR、NHEJ通路的合成致死依赖的靶向干预策略：首先，靶向抑制FA通路的 RBM39降解剂（E7820、 I ndisulam）或靶向HR通路的 CDK12抑制剂（THZ531、MFH290）可特异性诱导尤文肉瘤细胞死亡，并在体内异种移植模型中展现出显著抗肿瘤活性；其次，抑制NHEJ通路的 DNA-PK抑制剂Peposertib与化疗药物依托泊苷产生协同杀伤效应。纠正 POLQ exon 25跳读或敲低EWS-FLI1均可逆转这一敏感性，提示 POLQ exon 25跳读有望成为预测尤文肉瘤患者对FA/HR/NHEJ通路抑制剂敏感性的生物标志物。

图1尤文肉瘤MMEJ缺陷机制的模型图。生理状态下，EWSR1与FUBP1、KHSRP组装的剪接复合体结合POLQ exon 25内的顺式调控元件（ESE），保障该外显子被正常保留，Pol θ 蛋白得以完整表达并支持MMEJ修复。在尤文肉瘤细胞中，融合致癌蛋白EWS-FLI1通过蛋白互作显性抑制EWSR1复合体在ESE位点的定位，导致exon 25大量跳读、Pol θ 蛋白丢失。尤文肉瘤细胞的MMEJ修复能力被严重压制，转而高度依赖FA、HR、NHEJ通路维持基因组稳定，为靶向这些通路的药物（RBM39降解剂、CDK12抑制剂、DNA-PK抑制剂）提供了明确的治疗窗口。

本研究由哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所Alan D’Andrea教授（通讯作者）、Shuhei Asada博士（共同第一作者）与朱广李博士（共同第一作者）等领衔完成。朱广李曾任 Dana-Farber癌症研究所/哈佛医学院博士后研究员，现任中山大学附属第一医院放射治疗科医师、助理研究员，长期致力于DNA损伤修复、基因组稳定性与肿瘤精准治疗领域的基础及转化研究。

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(26)00451-X

制版人：十一

参考文献

1. Zhou J, Gelot C, Pantelidou C, et al. A first-in-class Polymerase Theta Inhibitor selectively targets Homologous-Recombination-Deficient Tumors.Nature Cancer.2021;2(6):598-610. doi:10.1038/s43018-021-00203-x

2. Abeykoon JP, Asada S, Zhu G, et al. Cyclin D1 overexpression induces replication stress and microhomology-mediated end-joining dependence in mantle cell lymphoma.J Clin Invest.2025;135(17):e193006. doi:10.1172/JCI193006

3. Zhu G, Asada S, Abeykoon JP, Sun L, Mukkavalli S, D’Andrea AD. HPV16 E6 oncoprotein promotes microhomology-mediated viral integration by increasing Pol θ protein expression.Proc Natl Acad Sci.2026;123(10):e2532479123. doi:10.1073/pnas.2532479123

4. Zhu G, Asada S, Nguyen H, et al. Defective microhomology-mediated end joining in SMARCB1-deficient tumors.Sci Adv.2026;12(33):eaed7743. doi:10.1126/sciadv.aed7743

5. Asada S, Zhu G, Abeykoon JP, et al. Disruption of microhomology-mediated end joining in ewing sarcoma.Mol Cell.Published online July 2026:S109727652600451X. doi:10.1016/j.molcel.2026.06.038

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