短链脂肪酸（SCFAs）主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是肠道微生物群通过厌氧发酵膳食纤维等底物产生的关键代谢产物，约占结肠中阴离子总量的60%～70%。这些分子在宿主生理活动中发挥着复杂而核心的调控作用：它们不仅是结肠上皮细胞（尤其是丁酸）的主要能量来源，还作为重要的信号分子，通过激活G蛋白偶联受体（如游离脂肪酸受体（FFAR）2、FFAR3）和抑制组蛋白去乙酰化酶等多重机制，系统性调控肠道屏障完整性、局部与全身免疫稳态、能量代谢及神经内分泌功能。其生理效应已超越肠道局部，通过循环系统作用于肝脏、脂肪组织、心血管乃至中枢神经系统，构成了“肠-器官轴”通信的化学语言基础，在炎症性肠病（IBD）、代谢综合征、神经退行性疾病等多种慢性疾病的病理过程中发挥着双重调节作用。
然而，将SCFAs巨大的健康潜能转化为稳定、有效的临床或营养干预手段，仍面临传统递送与调控范式的根本性挑战。直接口服SCFAs盐类或酯类前体存在上消化道吸收过快、难以靶向结肠且高浓度可能引起胃肠道不适等问题。依赖益生元（如菊粉、低聚果糖）刺激内源性菌群生产的策略，则因其效果高度依赖个体固有且高度异质性的微生物组构成，导致干预响应难以预测、标准化和精准量化。传统益生菌虽具安全性，但其天然SCFAs生产能力有限、缺乏可控性，且在复杂肠道环境中的定植效率与功能稳定性常不理想。因此，开发能够克服生物利用度、靶向性、个体异质性及可控性这四大瓶颈的新型SCFAs干预平台，已成为营养科学与合成生物学交叉领域的前沿需求。
近年来，合成生物学技术的快速发展为突破上述局限提供了全新思路。通过将食品级益生菌（如乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌（Escherichia coli）Nissle 1917（以下简称EcN））工程化为智能的“活体生物工厂”，使其能够在肠道内原位、高效并按需生产SCFAs，有望实现从“补充分子”到“编程细胞”的范式转变。这类工程益生菌可被设计为感知肠道微环境信号（如炎症标志物、特定代谢物浓度），并动态调节SCFAs的合成与释放，从而为实现个性化营养干预和疾病管理提供前所未有的精准工具。
南京工业大学食品与轻工学院的江凌*、朱政明*，南京工业大学生物与制药工程学院的刘振磊旨在探讨以工程化食品微生物（特别是益生菌）作为智能“活体工厂”，实现SCFAs在肠道内高效、原位及精准合成的前沿策略。这一策略的核心在于通过合成生物学手段，对益生菌等食品级微生物进行理性设计，使其从被动的补充剂转变为能够感知肠道环境信号并据此动态调控SCFAs生物合成平台。本文将对以下内容依次进行讨论：1）理想工程菌株的筛选与构建标准；2）强化SCFAs静态合成通路的代谢工程策略；3）构建动态智能调控系统实现按需合成的生物学方法；4）最终展望该技术在个性化营养与功能性食品开发中的应用前景与面临的挑战。需要指出的是，工程化微生物合成SCFAs的研究可划分为两个技术成熟度与应用场景迥异的方向：其一为体外生物制造，即利用工程菌株在可控的发酵条件下高效生产SCFAs，作为功能性食品配料或食品添加剂，该路径继承了成熟的工业发酵技术体系，监管路径相对明确；其二为体内活菌干预，即通过口服工程益生菌，使其在肠道内原位合成SCFAs，实现靶向递送与动态调控，该路径代表了活体生物治疗的前沿方向，但其在菌株遗传稳定性、宿主互作安全性、长期定植风险及监管审批等方面仍面临重大挑战。
1 工程化微生物作为智能的SCFAs“活体工厂”
随着合成生物学技术的快速发展，工程化微生物能够作为原位、智能的SCFAs“活体工厂”，在肠道局部持续生产SCFAs，实现精准、可控的递送，为代谢性和炎症性肠道疾病提供全新的平台范式。通过合成生物学方法对益生菌和人类微生物群落成员进行工程改造，可以创建具有预防和诊断功能的生物制剂。特别是乳酸菌、双歧杆菌和拟杆菌等已被成功改造为能够感知环境信号并作出响应的智能系统。这些工程微生物不仅能恢复受干扰的微生物群落稳态，还能实现靶向药物递送，在维持肠道屏障功能、调节免疫平衡方面展现出独特优势。在IBD预防领域，工程化微生物显示出特别的应用前景。例如，益生菌EcN不仅能显著缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎，还能恢复紧密连接蛋白闭锁小带蛋白-1的表达分布，并提高肠道内丁酸盐和戊酸盐的浓度。这种多方面的保护作用凸显了工程微生物作为SCFAs“活体工厂”的预防潜力，既能直接增强结肠上皮屏障，又能促进炎症消退，同时调节肠道菌群和SCFAs水平。
成功的工程微生物需要具备感知特定环境信号的能力，并据此调节SCFAs的生物合成。在预防策略方面，工程微生物不仅可以直接产生SCFAs，还能通过调节微生物衍生代谢物如色氨酸分解代谢物影响宿主生理。这些代谢物与SCFAs协同作用，通过结合芳香烃受体等途径增强肠道上皮屏障功能并调节免疫反应。此外，工程微生物还可以被设计为“基石联合体”，通过多个菌株的相互支持和协作，更有效地调节微生物组失衡。这种联合体方法比单一菌株操作更具优势，因为它能更好地模拟自然微生物系统的复杂性和稳定性。
尽管工程化微生物作为SCFA“活体工厂”的应用前景十分广阔，但其临床转化仍面临诸多挑战。安全性是首要考虑因素，包括工程菌株在复杂肠道环境中的定植能力、基因稳定性以及对宿主微生物组的长期 影响。工程微生物作为活体生物产品（LBPs），其临床应用的稳定性、有效性和安全性评价是未来研究面临的主要挑战。监管机构对LBPs的审批标准尚未完全明确，这需要学术界、产业界和监管部门的密切合作。另一个关键挑战是如何实现工程微生物的精确调控。理想系统应能根据疾病状态动态调整SCFAs的产生，这需要开发更复杂的遗传电路和传感机制。此外，个体间微生物组组成的差异可能影响工程菌株的定植和功能，因此个性化策略的设计是必要的。未来研究方向应包括开发更精确的调控系统，提高工程菌株在复杂肠道环境中的适应性，以及进行更全面的临床前和临床评估。
基于对现有成果的整合分析，本研究提出了一条从基础研究到临床转化的完整技术路线（图1），系统展示了工程益生菌从底盘构建到疾病治疗的过程。该路线图分为3 个层级：底层为底盘菌株构建，包括安全性、鲁棒性、遗传可操作性三大筛选标准，以及天然菌强化与模式菌重构两条构建路径；中层为合成能力强化，涵盖限速酶挖掘、酶工程改造、AI辅助设计及模块化组装等静态代谢网络优化策略；顶层为智能调控与应用，整合生物传感器、干扰型成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRi）和激活型CRISPR（CRISPRa）的动态调控及安全回路，最终实现肠道炎症、代谢性疾病等靶向治疗。首先，在技术创新层面，应重点发展下一代益生菌和LBPs，这些新型生物制剂不仅包括传统益生菌，还应涵盖更广泛的微生物种类，特别是那些具有特殊代谢功能的菌株。工程化微生物技术应致力于开发更精确的调控系统，如基于生物传感器的反馈控制系统，实现SCFA产量的动态调节。在临床转化方面，需要建立完善的安全性评价体系和监管框架，特别是针对工程益生菌产品的长期安全性和生态影响进行评估。最后，个性化预防策略的开发至关重要，应基于患者的微生物组特征、代谢表型和遗传背景，制定精准的SCFA干预方案。这条研究路线不仅整合了从基础机制到临床应用的各个环节，还强调了多学科交叉和技术创新的重要性，可为SCFA相关研究的未来发展提供清晰的方向指引。
2 SCFAs合成的理想底盘菌株的筛选与构建策略
2.1 底盘菌株的核心筛选标准
随着合成生物学与微生物组研究的深度融合，工程化微生物已成为开发LBPs、实现精准治疗及预防的关键工具。这些被设计的微生物不再仅仅是被动补充的益生菌，而是能够主动感知疾病信号、在病灶部位定植并精确释放有益分子的“智能”药物。然而，将这一宏伟蓝图转化为临床现实，其首要且核心的挑战在于选择合适的底盘菌株。一个理想的底盘菌株必须同时满足3 个关键标准：卓越的安全性、在宿主复杂环境中强大的鲁棒性（稳健性）以及高效、便捷的遗传可操作性。
第一，安全性是工程化底盘菌株不可妥协的底线。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等传统食品微生物具有长期安全使用历史，已被纳入欧盟安全合格推定（Qualified Presumption of Safety，QPS）和美国公认安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）名单，适合开发为功能性食品或膳食补充剂。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）同样具有良好的安全性，已广泛应用于食品发酵和酶制剂生产。值得注意的是，EcN虽非传统食品菌株，但作为益生菌已有百年应用历史，在LBP开发中具有优势；然而，其监管路径更为严格，需遵循药物审批程序。
第二，鲁棒性决定了工程化底盘菌株在复杂且动态的宿主环境中能否存活、定植并有效执行其功能。宿主胃肠道是一个极端环境，工程菌需要应对胃部强酸性及胆汁盐等多种胁迫压力。不同菌株对SCFAs的耐受性差异显著。丁酸梭菌作为天然丁酸生产者，进化出高效的产物外排系统和细胞膜修饰机制，可耐受的丁酸质量浓度达15 g/L以上；而EcN在丁酸质量浓度超过5 g/L时生长显著受抑，需通过工程化改造MdtEF-TolC外排泵系统增强耐受性。EcN作为兼性厌氧菌，在肠道微氧环境中可维持丁酸合成途径活性；而丁酸梭菌等严格厌氧菌虽合成效率更高，但在有氧环境中其活性迅速丧失，限制了其作为口服制剂的稳定性。酿酒酵母作为真核微生物，对丁酸等SCFAs的耐受性介于两者之间，且其真核细胞器可提供厌氧代谢所需的亚细胞区室化环境。值得注意的是，在体外生物制造场景中，底盘菌株的鲁棒性主要体现在发酵罐环境下的代谢稳定性与产物耐受性；而在体内活菌治疗场景中，鲁棒性则需进一步涵盖胃酸耐受、胆汁盐耐受、肠道定植能力等复杂生理条件。两者对底盘菌株的性能要求存在显著差异，需根据应用场景进行针对性设计。
第三，遗传可操作性是实现底盘菌株功能定制化的核心技术保障。在EcN中遗传工具最为成熟，CRISPR-Cas9介导的基因编辑效率可达90%以上，且可用质粒种类丰富，支持复杂的多基因调控回路构建。枯草芽孢杆菌作为模式革兰氏阳性菌，其遗传操作体系完善，已成功用于模块化组装和动态调控系统的构建。相比之下，乳酸乳球菌等乳酸菌的遗传操作工具虽日益完善，但编辑效率（约30%～50%）和可用的遗传元件仍不及大肠杆菌，且部分菌株存在限制性修饰系统，增加了外源DNA导入的难度。丁酸梭菌等严格厌氧菌遗传改造难度最大，目前仍以同源重组为主，存在改造周期长、效率低的问题，限制了其在合成生物学研究中的广泛应用。
筛选和构建理想的工程化底盘菌株是一个多目标优化的系统工程。安全性是贯穿全过程的红线；鲁棒性决定了菌株在目标环境中的存活与功能发挥；遗传可操作性则为赋予菌株复杂、精准功能提供了技术引擎。对于SCFAs合成而言，底盘菌株的筛选还需重点关注其与合成途径的兼容性，包括厌氧代谢能力、产物外排效率及对目标SCFAs的耐受性。基于上述综合考量，EcN、枯草芽孢杆菌因遗传可操作性和鲁棒性的良好平衡，成为异源重构SCFAs合成途径的首选底盘；而丁酸梭菌、乳酸乳球菌则适用于利用其天然合成能力的强化改造。
2.2 工程化微生物底盘菌株的多元构建路径
工程化微生物生产SCFAs主要遵循两大技术路径：一是对天然高产菌株进行代谢工程强化，提升其固有合成能力；二是在遗传背景清晰的模式益生菌中重构异源合成途径。本节将系统阐述这两类策略的具体分子机制、工程改造方法及其在疾病干预中的应用验证（表1）。
2.2.1强化天然高产菌的SCFAs高效合成能力
天然高产SCFAs的微生物（如丁酸梭菌、丙酸杆菌、解淀粉芽孢杆菌、粪杆菌等）具备完整且高效的SCFAs合成酶系，是开发工程益生菌的理想底盘。通过合成生物学手段对这些菌株进行代谢工程改造，强化其固有合成能力，已成为突破天然菌株产量瓶颈、开发下一代工程益生菌的关键路径。
代谢通路的精准强化是提升SCFAs产量的核心策略。天然菌株在生产过程中常面临终产物抑制、代谢通量不足等问题，通过过表达限速酶编码基因或敲除竞争途径，可直接增强目标产物的合成效率。例如，枯草芽孢杆菌SCK6（Bacillus subtilis SCK6）通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑，增强内源丁醇脱氢酶（bdhA）与磷酸转丁酰酶（ptb）基因的表达，强化了丁酸合成途径。工程菌株BsS-RS06550在动物实验中展现出显著的抗肥胖效果，能有效降低高脂饮食小鼠的体质量增长、改善血糖稳态和胰岛素抵抗。这种代谢强化的工程化策略为开发高效预防性微生物制剂提供了直接依据。丁酸梭菌作为肠道核心丁酸产生菌，其内源丁酸合成依赖丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶（But）途径，关键酶包括丁酰辅酶A脱氢酶（Bcd）、电子转移黄素蛋白（EtfAB）及But。研究表明，通过强启动子替换策略过表达bcd基因，可使丁酸梭菌的丁酸产量提升2.3 倍。此外，敲除乳酸脱氢酶（ldh）基因以阻断乳酸竞争途径，可进一步将碳通量导向丁酸合成，使丁酸/乙酸比例提高1.8 倍。 丙酸杆菌是丙酸的主要天然生产者，依赖琥珀酸途径合成丙酸（葡萄糖→琥珀酸→丙酸）。通过过表达丙酰辅酶A羧化酶（Pcc）及甲基丙二酰辅酶A变位酶（Mcm）等限速酶，可显著提升丙酸合成通量。同时，敲除副产物合成途径（如乙酸激酶（ack）基因）可减少乙酸积累，使丙酸产量提高至42.3 g/L（优化发酵条件下）。粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）是人体肠道中重要的丁酸生产者，因其强大的抗炎作用被视为IBD的潜在治疗菌。虽然该菌难以培养，但研究人员已成功从其基因组中克隆出丁酸合成关键基因簇（bcd/but），并将其导入可培养的底盘菌株中表达，为利用其高效酶元件提供了技术基础。乳酸球菌CF11作为另一类天然SCFAs生产菌，通过增加乙酸和丙酸产量、富集有益菌属，展现了改善肠道菌群结构的潜力。该菌株可作为进一步工程化的优质底盘，例如通过过表达磷酸转乙酰酶（pta）和ackA强化乙酸合成途径，或导入异源丁酸合成途径拓展其产物谱。
2.2.2重构模式益生菌的异源合成途径
随着合成生物学技术的飞速发展，通过对模式益生菌进行异源途径重构，使其获得SCFAs生产能力，已成为开发下一代工程益生菌的前沿领域。这种精准的工程化策略不仅突破了天然菌株的代谢限制，更为实现复杂疾病的预防与治疗提供了全新解决方案。对于遗传工具成熟但缺乏SCFAs合成能力的模式益生菌，如EcN、乳酸乳球菌和酿酒酵母，引入完整的异源途径是赋予其新功能的关键策略。
Park等成功将来自F. prausnitzii的完整丁酸合成基因簇导入大肠杆菌。该基因簇包含bcd和but基因，分别由组成型强启动子控制表达。研究人员通过质粒拷贝数优化和核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）工程，使Bcd和But蛋白的表达水平达到最佳平衡。为提高异源途径效率，Jawed等在大肠杆菌中实施了系统的宿主改造：1）敲除脂肪酸β-氧化基因fadD和fadE，阻断了丁酸的分解代谢途径；2）过表达全局调控因子fadR，激活了脂肪酸生物合成相关基因的表达；3）从多形拟杆菌中筛选并表达了高活性的TesBT，该酶能特异性水解C4酰基-载体蛋白（ACP），直接产生丁酸。经过多轮优化，最终菌株在摇瓶发酵中丁酸滴度达到2.3 g/L。基于上述策略构建的工程菌EcN-Bcd-But在疾病模型中显示出明确疗效。在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，该工程菌显著降低了疾病活动指数（降低62%），改善了结肠长度的缩短情况，组织病理学评分降低了58%。更重要的是，工程菌处理使结肠内容物中丁酸浓度从对照组的12.3 μmol/L提高至89.7 μmol/L，证实了其“原位生产”的治疗模式。
酿酒酵母作为真核微生物底盘，为SCFAs生产提供了独特的优势，特别是对复杂酶复合物的表达能力。Wu Jiahao等将途径工程与个性化医疗理念相结合，构建了具有不同丁酸生产能力的酿酒酵母工程菌库。研究人员导入了科氏梭菌的乙酰-CoA乙酰转移酶（AtoB）与BdhA，通过启动子强度梯度（Ptef＞Ppgk1＞Padh1）进行调控，获得了产量梯度（0.1～2.3 g/L）的系列菌株。在DSS结肠炎小鼠模型中，发现存在一个“倒U型”疗效曲线——产量适中的菌株（约1.2 g/L）缓解效果最佳，而非产量最高的菌株。这一发现强调了精确剂量控制在活体预防中的重要性。
Wang Lina等以食品安全级枯草芽孢杆菌为底盘，构建了高效生产丁酸的工程菌BsS-RS06551。该团队采用了模块化组装策略：1）丁酸合成模块：将来自不同来源的bcd和but基因进行密码子优化，并置于梯度强度的启动子控制下；2）辅因子平衡模块：过表达NADH氧化酶以维持氧化还原平衡；3）产物转运模块：工程化MdtEF-TolC外排泵系统以增强丁酸外排，减轻产物抑制。最终菌株在5 L发酵罐中的丁酸产量达到18.5 g/L，生产强度为0.77 g/（L·h）。在肥胖小鼠模型中，该工程菌显示出与BsS-RS06550类似的代谢改善效果，但作用更持久，停药后2 周仍能维持疗效。尽管乳酸菌天然合成SCFAs的能力有限，但其作为传统益生菌的安全性优势使其成为有吸引力的底盘候选。Tavares等在乳酸乳球菌中初步尝试了乙酸合成途径的强化，通过过表达pta和ackA，使乙酸产量提高了4.5 倍。然而，将完整丁酸或丙酸途径导入乳酸菌仍面临挑战，主要障碍是这些严格厌氧途径与乳酸菌微好氧代谢的不兼容性，以及外源基因在乳酸菌中表达效率低下。未来需要开发针对乳酸菌的专用基因表达系统和辅因子工程策略。
EcN作为模式益生菌，遗传操作工具成熟、生长速度快、发酵工艺完善，是异源重构SCFAs合成途径的常用底盘。然而，EcN并非天然SCFAs高产菌，需导入完整的异源合成基因簇（如bcd/but）方可获得生产能力，且其所导入的严格厌氧途径在肠道微氧环境中的活性维持是主要挑战。相比之下，天然益生菌（如乳酸乳球菌、丁酸梭菌）虽具备较好的安全性且本身具备SCFAs合成能力，但遗传操作工具相对有限，产量较低。乳酸乳球菌作为传统食品级微生物，其优势在于食品安全性高、可在肠道短暂定植，但严格厌氧途径与其微好氧代谢的不兼容性是导入丁酸/丙酸途径的主要障碍。从应用场景看，EcN更适合作为“活体生物药”的底盘，用于体内靶向递送；而乳酸乳球菌等传统益生菌更适合开发为功能性食品或膳食补充剂。两者在SCFAs合成设计中的共性在于均需解决辅因子平衡、产物毒性及途径通量匹配问题，差异则主要体现在遗传可操作性、厌氧适应性及监管路径上。
2.3 提升底盘菌株的肠道定植与适应性进化能力
工程益生菌的益生功能从根本上依赖于其在复杂肠道环境中的存活与定植能力。然而，口服益生菌面临胃肠道生理环境（如胃酸、胆汁）以及病理微环境（如活性氧、黏液层耗竭）的严峻挑战，严重限制了其定植效率与缓解效果。因此，深入理解并工程化改造底盘菌株的肠道定植与适应性进化策略，是推动LBPs发展的核心环节。
增强肠道定植能力是工程益生菌发挥功能的首要前提，目前已有多种有效的工程化与生态化策略。定植的第1步是耐受消化道的生理环境并成功黏附于肠道黏膜。受生理条件下益生菌在黏液层定植和生长的启发，一种仿生涂层策略被开发出来：通过层层自组装技术，用单宁酸和黏蛋白包裹EcN，构建了超级益生菌 EcN@TA-Ca2+@Mucin。该涂层不仅赋予工程菌卓越的胃肠道环境耐受能力，还通过黏蛋白与肠道黏液层的相互作用，使其具备强大的肠道黏附性，从而无需移除涂层即可显著增强其在黏液层的定植与生长。此外，该涂层还能清除活性氧、减轻炎症反应，为益生菌定植创造了更有利的微环境。除了被动防护，主动形成生物膜是另一种强大的定植增强策略。研究表明，益生菌EcN能够在硅胶基底上形成稳定的生物膜，特别是在经过甘露糖苷衍生物修饰的表面上。这种活体、保护性的生物膜屏障，能够长期（如11 d）有效地抵御致病性粪肠球菌的定植。在肿瘤治疗这一特殊场景中，EcN展现出另一种独特的定植能力——它能够归巢并选择性定植于肿瘤组织，这被认为是由于肿瘤提供了低氧、营养丰富且具有免疫豁免特性的生态位。从更广泛的生态学视角看，细菌在肠道内的定植是其与宿主黏膜免疫系统进行“交叉对话”的基础，这对于正常黏膜免疫功能的建立至关重要，也是益生菌能够预防胃肠道疾病的先决条件。
适应性进化是益生菌在宿主体内长期存续并发挥稳态调节作用的内在驱动力，对工程菌设计具有重要启示。自然选择在包括人类肠道在内的所有环境中塑造着细菌的进化。对脆弱拟杆菌的群体基因组学研究表明，个体内的细菌种群蕴藏着丰富的自发核苷酸变异和可移动遗传元件多样性，这些多样性记录了数年内的个体内进化历史。有研究发现，在个体微生物组内，存在大量适应性进化的特征，包括16 个基因中的平行进化，这些基因大多与细胞包膜生物合成和多糖利用有关，直接指向促进长期肠道定植的适应性机制。这种在宿主体内的快速适应性进化具有显著的趋同性。对候选益生菌——植物乳植杆菌HNU082的研究发现，无论是在人类、小鼠还是斑马鱼肠道中，该菌都能通过获得高度一致的单核苷酸突变适应肠道环境，这些突变主要影响碳水化合物的利用和酸耐受性。对这些突变体的分离培养证实，其在体外至少能稳定遗传3 个月，并提高了菌株的适应度。这种进化不仅发生在益生菌本身，还会引发土著肠道微生物群的生态和进化响应。研究发现，在益生菌定植后，与之竞争的土著菌株（如拟杆菌属和双歧杆菌属）会积累比平时多10～70 倍的进化改变，这表明益生菌的引入触发了整个微生物群落的进化动态。病原体同样利用进化策略维持其在肠道中的存在。例如，艰难梭菌通过形成生物膜实现在肠道中持续存在并导致感染复发，这被普遍认为是其重要机制。从宏观的共进化视角来看，肠道微生物群与宿主之间存在多层级的共进化模型。该模型借鉴细菌基因组结构，区分出宿主适应的核心微生物群以及一个灵活、受环境调节的微生物库，它们在维持机制和对宿主适应的贡献上有所不同，这为理解益生菌如何整合进这个复杂的生态系统提供了理论框架。
底盘菌株的肠道定植与适应性进化是一个多层次的动态过程。通过仿生材料增强环境耐受性与黏附能力、利用生物膜形成生态位以及挖掘肿瘤特异性定植等工程策略，能够主动提升益生菌的初始定植效率。同时，认识到益生菌及其所处的微生物群落具有强大的体内适应性进化能力，要求在设计下一代工程菌时，必须充分考虑其遗传稳定性、进化轨迹以及对整个微生态系统的潜在影响。值得注意的是，上述策略根据最终应用场景不同，其工程化侧重点存在显著差异。体外生物制造侧重于发酵滴度、生产强度及下游分离纯化的经济性，技术成熟度较高，主要遵循食品添加剂法规；而体内活菌治疗则更侧重于菌株的肠道定植能力、环境响应性及生物安全性，属于LBP范畴，目前仍处于临床前或早期临床阶段，监管门槛明显更高。
3SCFAs合成的静态代谢网络的系统性强化
3.1 挖掘与强化限速酶以优化合成途径
微生物合成SCFAs的能力为其作为LBP奠定了基础，而合成途径中关键限速酶的挖掘与过表达，已成为强化SCFAs生产、提升疾病缓解效果的核心策略。通过精准识别并优化这些关键酶，研究人员能够显著提高底盘菌株的SCFAs产量，从而在代谢性疾病、肠道炎症等多种疾病模型中实现有效的干预与预防。微生物合成SCFAs主要经由3 条代谢途径（表2）：1）乙酰辅酶A途径：以乙酰辅酶A为底物，经Tes催化直接生成乙酸，或经AtoB、羟基丁酰辅酶A脱氢酶（Hbd）、巴豆酸酶（Crt）、Bcd及Ptb/丁酸激酶（Buk）生成丁酸；2）琥珀酸途径：以磷酸烯醇式丙酮酸为起点，经草酰乙酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸，最终由Pcc等催化生成丙酸；3）丙二醇途径：由脱氧己糖经丙二醇代谢生成丙酸。这3 类途径在底物竞争、辅因子需求及厌氧适应性上存在显著差异，需根据目标产物选择适配的途径组合。
限速酶的挖掘与筛选是构建高效SCFAs生产菌株的首要步骤，直接决定了合成途径的通量。在利用大肠杆菌天然脂肪酸合成途径生产SCFAs的研究中，Tes的选择对产物谱和产量具有决定性影响。一项系统比较研究评估了3 种不同微生物来源的Tes：来自Anaerococcus tetradius的TesAT、来自Bryantella formatexigens的TesBF以及来自Bacteroides thetaiotaomicron的TesBT。结果表明，表达tesBT基因的大肠杆菌产生了最高的丁酸滴度，达到1.46 g/L，远高于其他2 种Tes。Tes的选择对丁酸产量具有决定性影响，其机制在于不同Tes对酰基链长的底物特异性。TesBT对C4酰基-ACP的水解活性较C2酰基-ACP、C6酰基-ACP分别高出12 倍和5 倍；而TesAT则偏好C2底物。这种底物偏好性决定了碳通量在丁酸与乙酸之间的分配比例。因此，精准匹配Tes底物特异性与目标产物链长，是构建高效丁酸合成途径的关键设计原则。这一发现凸显了从庞大微生物资源中精准挖掘高效、特异性强的Tes对于构建高产工程菌的重要性。在模拟人体肠道关键共生菌的功能方面，研究人员从具有重要健康作用但难以培养的F. prausnitzii中克隆并表达了编码Bcd和But的基因。结果表明，Bcd对于在大肠杆菌中产生丁酸是必需的，而But则是非必需的，这为在最简化条件下重构功能性丁酸合成途径提供了关键靶点。Bcd属于酰基辅酶A脱氢酶家族，其催化机制依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子介导的α,β-脱氢反应。晶体结构显示，Bcd的活性口袋包含一个保守的谷氨酸残基，作为催化碱基夺取底物Cα位的质子，随后通过FAD将电子转移至EtfAB。该反应将巴豆酰辅酶A转化为丁酰辅酶A，是丁酸合成途径中的限速步骤。通过对Bcd活性口袋的理性设计，如将底物结合口袋的疏水残基替换为体积更小的丙氨酸，可增加活性口袋的容积，使其能够容纳更长的酰基链底物，从而拓展产物谱。
针对SCFAs合成途径关键酶的改造已取得显著进展。以丁酸合成途径中的限速酶Bcd为例，通过定向进化获得的突变体Bcd-M3，其催化效率（kcat/Km）较野生型提升4.2 倍，在重组大肠杆菌中使丁酸产量提高2.1 倍。结构解析表明，突变位点（L197F、M231I）位于底物结合口袋附近，L197F突变通过引入苯丙氨酸的芳香环与底物丁酰辅酶A的酰基链形成π-烷基疏水相互作用，增加了底物亲和力；M231I突变则通过减小侧链体积缓解了活性口袋的空间位阻，使底物进入通道更加顺畅。这两种突变的协同作用使底物结合常数（Km）从野生型的120 μmol/L降低至28 μmol/L。类似地，丙酸合成途径中的Pcc经理性设计改造后，丙酸产量提升至4.8 g/L，较对照提高165%。Pcc属于生物素依赖性羧化酶家族，其催化机制分为2 步：首先生物素羧化酶结构域以ATP依赖方式将羧基转移至生物素上，随后羧基转移酶结构域将羧基转移至丙酰辅酶A。通过定点突变将底物结合口袋的疏水残基（Val148、Ile202）替换为极性残基（Ser、Thr），可增强对丙酰辅酶A的氢键相互作用，使底物亲和力提高3 倍。
基于关键酶的途径强化在疾病缓解中展现出显著成效，并通过系统优化策略不断提升产量与缓解效果。在肠道炎症领域，表达bcd和but的EcN-Bcd-But工程菌在DSS诱导的结肠炎模型小鼠中表现出明确的预防效果。口服该菌株能显著减轻DSS引起的肠道损伤，其作用机制与丁酸产量的增加直接相关，证明了通过关键酶过表达强化SCFAs生产在IBD缓解中的可行性与有效性。在先天性代谢疾病管理方面，工程益生菌也显示出巨大潜力。针对苯丙酮尿症和高氨血症等疾病，系统综述表明，虽然某些野生菌株（如植物乳植杆菌）具有基础代谢能力，但需要通过基因操作（即引入或强化关键代谢酶）获得所需功能。这再次印证了针对特定疾病靶点，鉴定并强化关键酶是开发工程益生菌的核心逻辑。为了将潜力转化为实际应用，对生产体系进行全方位的工程优化至关重要。这包括遗传层面和工艺层面的双重优化。在遗传层面，除了筛选最佳酶元件，还需考虑质粒拷贝数、宿主菌基因型（如删除fadD和fadE以阻断脂肪酸降解，过表达fadR以激活生物合成）等因素。展望未来，CRISPR-Cas基因编辑技术为SCFAs合成途径的强化提供了更精准、高效的工具。该技术能够直接、便捷地进行基因组修饰，从而实现对关键合成酶的精确过表达或对竞争途径的敲除，这为通过调控肠道菌群来干预代谢开辟了全新、可定制的途径。
通过对SCFAs合成途径中关键限速酶进行系统性挖掘、比较与过表达，并结合遗传回路优化与先进发酵策略，能够显著提升工程微生物生产SCFAs的能力。这些高产菌株在动物模型和初步临床研究中已证实其对IBD和先天性代谢疾病的缓解潜力。
3.2 酶工程的智能化策略：理性设计与定向进化
SCFAs的合成效率直接影响工程益生菌的缓解效果，而合成途径中关键酶的催化效率是决定整个代谢通量的核心因素。通过酶工程技术提升这些关键酶的活性、稳定性和特异性，已成为强化SCFAs合成途径、增强疾病缓解效果的突破性策略。理性设计与定向进化作为酶工程的两大支柱，在优化SCFAs合成途径中展现出强大的应用潜力。
理性设计与定向进化是优化关键酶催化效率的互补策略，共同推动SCFAs高效合成。定向进化通过模拟自然进化过程，在试管中完成基因多样化性与筛选/选择的迭代循环，已成为优化蛋白质功能最强大的工具之一。 在SCFAs生产中，这一策略已被成功应用于提升细胞对毒性产物的耐受性，从而间接提高产量。例如，在酿酒酵母中生产具有细胞毒性的中链脂肪酸时，研究人员通过对膜转运蛋白Tpo1进行定向进化，并结合菌株的适应性实验室进化，使产量分别提升了1.3 倍和1.7 倍。 与定向进化的“盲目”筛选不同，理性设计基于对酶结构和作用机制的理解进行精准改造。在开发肠道原位丁酸生产系统时，研究人员从宏基因组文库中筛选获得2 个能高效水解三丁酸甘油酯为丁酸的酯酶基因。通过BLASTp分析和结构预测，发现这2 个蛋白均含有丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化三联体，这是酯酶家族中高度保守的结构特征。这种基于序列和结构信息的分析为理解酶的功能机制奠定了基础，是理性设计的重要前提。结构解析表明，突变位点（L197F、M231I）位于底物结合口袋附近，通过增加疏水相互作用提高了对丁酰辅酶A的亲和力。这些研究表明，限速酶的催化效率是决定SCFAs合成通量的关键瓶颈，酶工程改造可产生显著的产量增益。
机器学习与多维工程策略正将酶工程推向智能化、系统化的新阶段。随着蛋白质序列数据的爆炸式增长，机器学习已成为辅助酶工程的革命性工具。机器学习模型能够通过已知蛋白质序列的功能注释发现起始点，或生成具有所需功能的新蛋白质序列；更重要的是，它能通过学习蛋白质序列与其适应度值之间的映射关系，在蛋白质适应度景观中导航，实现适应度优化。例如，MODIFY算法通过从天然蛋白质序列中学习，推断进化上合理的突变并预测酶适应度，同时协同优化起始库的预测适应度和序列多样性。该算法成功指导工程化来自热稳定细胞色素c的通用生物催化剂，实现了通过自然界中不存在的卡宾转移机制完成对映选择性C—B和C—Si 的构建。在实际应用中，多维工程策略展现出显著优势。除了对单个酶进行优化外，还需在途径水平和细胞水平进行系统改造。在强化大肠杆菌丁酸合成途径的研究中，研究人员不仅工程化了辅酶A生物合成以缓解CoA介导的抑制，还优化了丁酸转运系统，通过鉴定和优化TolC相关的MdtEF外排泵减轻丁酸再摄取。这些策略的协同实施使丁酸滴度和产量分别提高了11.1 倍和86%。
工程化高效酶在疾病缓解中展现出显著应用价值，特别是通过原位SCFAs生产系统实现精准干预。基于工程酶的SCFAs生产系统在肠道炎症缓解中已取得明确成效。利用从微生物组中鉴定的新型酯酶构建的肠道原位丁酸生产系统，能够在肠道内以受控方式释放丁酸。在急性结肠炎小鼠模型中，给予三丁酸甘油酯和表达这些酯酶基因的大肠杆菌，显著减轻了炎症症状。这种精准的原位生产策略克服了直接摄入丁酸的局限性，为胃肠道疾病的缓解提供了新思路。从更广泛的视角看，代谢工程工具箱的扩展为细胞工程提供了更多选择。蛋白质工程和合成生物学的发展扩大了代谢工程师可用的方法的广度和精度，包括全局转录工程等新方法，已被证明能够引发多基因转录变化，产生比单基因扰动更好的表型。同时，生物催化领域的进步也受益于分子生物学的发展，特别是基因测序和蛋白质工程，使得更多更好的酶被开发出来，拓宽了生物催化的工业应用范围。
通过理性设计与定向进化相结合的策略优化SCFAs合成途径中的关键酶，并借助机器学习工具和多维工程方法，能够显著提升工程菌的SCFAs生产能力。这些高效工程酶在构建肠道疾病原位预防系统中表现出良好的应用前景，为IBD等疾病的微生态缓解提供了创新解决方案。未来，随着酶工程技术的不断进步，特别是人工智能（AI）辅助设计的深入应用，将有望开发出更具催化效率和特异性的酶元件，进一步推动工程益生菌在疾病缓解中的临床应用。
3.3 AI驱动的SCFAs代谢通路设计与优化
随着AI技术的飞速发展，机器学习与合成生物学的深度融合正在重塑代谢工程领域。在SCFAs合成途径的强化方面，AI技术通过赋能通路设计、酶工程和系统优化等多个环节，为开发高效微生物细胞工厂提供了全新可能，进而推动了基于SCFAs的疾病缓解策略的创新（图2）。
AI技术可在多个层面优化SCFAs合成途径，从酶分子设计到系统代谢网络调控。在酶分子层面，机器学习通过挖掘庞大的序列-功能关系数据，显著加速了高效生物催化剂的发现与设计。传统的酶设计方法面临序列空间巨大的挑战，而基于深度学习的结构预测方法（如AlphaFold2工具）结合分子模拟，极大地扩展了三维结构数据库，实现了基于结构的理性设计。同时，机器学习模型能够学习蛋白质序列与功能之间的复杂映射关系，虚拟筛选大量新型序列，有效指导蛋白质改造。在代谢通路层面，机器学习与多组学数据结合，能够动态预测通路行为并指导优化。传统动力学模型严重依赖领域专业知识且开发耗时，而机器学习方法结合丰富的多组学数据（蛋白质组学、代谢组学）可以自动、有效地预测通路动力学，其性能甚至超越经典动力学模型，能够为生物工程提供定性和定量指导。特别是对于SCFAs中的关键代谢物丁酸，研究人员开发了一种新颖的机器学习方法，利用自动生成的基因组尺度代谢模型信息，成功预测了不同微生物群落组合的丁酸产量，其预测值与观测值之间的Pearson相关系数超过0.75，为大规模筛选高产丁酸的菌群组合提供了强大工具。
在大肠杆菌中生产丁酸的关键是引入具有选择性的高效Tes。Xu Yuting等构建了一个深度学习框架，专门用于预测和设计高活性Tes变体。该研究基于超5 000 个已知活性Tes的序列与生化数据，通过提取多维特征对TesBT进行了虚拟饱和突变，筛选出36 个预测高活性的单点突变体，其中最优突变体的丁酸产量较野生型提高了68%。结果表明，深度学习能有效捕捉序列与功能间的关联，显著加速了酶优化过程。Yang等系统阐述了机器学习辅助酶工程的机遇与挑战，特别强调了生成式模型在创造全新酶序列方面的潜力。以Bcd为例，通过AlphaFold2工具预测了15 个同源蛋白结构，构建了活性口袋构象空间。模拟筛选出50 个潜在高活性设计，最终获得3 个活性超过天然模板的变体，最优设计的丁酸合成通量提高了52%。这表明生成式AI能够突破天然序列限制，创制更优的合成酶元件。
确定SCFAs合成途径中的最优基因表达水平和调控策略是一个高维组合优化问题。机器学习通过学习有限的实验数据能够预测复杂遗传干预对代谢表型的影响，指导最优设计。Kim等开发了一种集成神经网络模型，用于优化大肠杆菌中丁酸合成途径的基因表达组合。该模型基于包含128 种不同基因表达组合的实验数据训练而成，并采用贝叶斯优化进行高效搜索。仅经3 轮设计-构建-测试-学习循环，便发现了使丁酸产量提高82%的最优表达方案，最终工程菌株的丁酸滴度达到31.2 g/L，糖酸转化率为0.41 g/g，证明了机器学习能高效优化复杂代谢通路。Costello等开发了一种基于时间序列多组学数据的机器学习方法，用于预测代谢通路动态行为。应用于丁酸合成途径时，该方法利用发酵过程中的多组学数据训练递归神经网络模型，成功预测了不同条件下的代谢通量，其准确性优于传统模型。模型还识别出ptb的表达时机是关键瓶颈，该发现指导设计了一种动态调控策略，最终使丁酸生产率提高了58%。Rana等提出了整合基因组尺度代谢模型与机器学习的新框架。在优化丙酸杆菌生产丙酸的研究中，他们使用多组学数据训练机器学习模型，以识别并修正代谢模型的偏差。经迭代优化，模型精度显著提升。基于此模型预测了新的改造靶点，最终获得丙酸产量提高2.3 倍的工程菌株，验证了该闭环策略在细胞工厂理性设计中的有效性。AI在SCFAs合成途径设计中的应用已从单一酶优化拓展至全途径协同设计。
在合成微生物群落或多菌株联合疗法中，AI技术能够预测菌间互作及其对SCFAs产量的协同效应，指导高效菌群设计。Silva-Andrade等开发了专门用于预测微生物群落丁酸产量的机器学习方法。该研究基于19 个不同合成菌群的数据，结合代谢模型特征进行建模。梯度提升回归树模型预测效果最佳，成功预测并实验证实了最优菌群组合。该方法为设计高效产丁酸益生菌联合体提供了有力工具。Zhou Kang等的研究表明，机器学习可用于优化代谢途径通量。他们开发了一个深度神经网络模型，基于菌群生长、资源利用与代谢交换等参数，预测菌群稳定性和SCFAs产量。利用合成菌群数据训练后，该模型成功设计出一个高产丁酸且能长期稳定的四菌株群落，其丁酸产量较随机群落提高了3.5 倍，证明了AI在同步优化菌群功能与稳定性方面的能力。
AI技术不仅可用于菌株设计，还可应用于发酵过程的实时监控与动态优化，确保SCFAs生产的高效与稳定。Kong Dechun等综述了AI在微生物细胞工厂中的应用进展，特别强调了智能发酵控制的进展。Lemke等通过进化分析与计算模型，揭示了代谢需求如何在长时间尺度上塑造酶结构。基于这一进化认知，他们开发了一种蛋白质设计算法。当重新设计Buk时，该算法在优化催化效率的同时，确保了新设计符合进化原则。所获得的酶变体不仅活性更高，而且在工程菌中的表达效率和相容性更好，细胞生长速率更快。这说明AI辅助酶设计应融合深层生物学规律。
AI在SCFAs合成途径设计中的应用已从单一酶优化拓展至全途径协同设计。一个完整的AI驱动设计流程包括：1）数据层：整合酶序列-功能数据库、代谢组学数据及发酵过程多组学数据；2）预测层：采用图神经网络预测途径瓶颈，利用深度学习评估酶突变体活性；3）优化层：通过贝叶斯优化或强化学习探索基因表达组合空间，推荐最优设计；4）验证层：设计-构建-测试-学习循环迭代。AI技术通过赋能SCFAs合成途径中从酶分子到系统代谢网络的多层次优化，显著提升了微生物细胞工厂的生产效率。这些AI驱动的设计策略，结合对微生物群落互作的精准预测，为开发基于SCFAs的下一代LBPs奠定了坚实的技术基础，预示着精准微生态医疗新时代的来临。
3.4 合成途径的模块化组装与适配
高效SCFAs合成不仅依赖于单个限速酶的优化，更取决于合成途径各模块间的通量匹配。基于模块化工程思想，可将SCFAs合成途径划分为4 个功能模块。1）底物供给模块：负责将碳源（如葡萄糖、甘油）转化为中心代谢中间体（乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A）。该模块的强度决定了进入SCFAs合成途径的碳通量上限。工程策略包括过表达糖酵解途径关键酶、敲除竞争途径（如乳酸、乙醇合成）等。2）碳链延伸模块：负责将C2单元延伸至C4或C3单元，是丁酸与丙酸合成的核心环节。该模块涉及多酶级联反应，各酶的表达比例需精确平衡。例如，在丁酸合成中，将AtoB、Hbd、Crt、Bcd的活性比优化为1∶2∶1.5∶3时，丁酸产量最高。3）产物释放模块：负责将酰基辅酶A转化为游离SCFAs。Tes或But的选择与表达强度直接影响产物谱与积累效率。研究表明，将TesBT与丁酸合成途径耦联时，其表达强度需与Bcd精确匹配，过高的TesBT表达会导致中间体泄漏及副产物积累。4）辅因子平衡模块：SCFAs合成途径对辅因子（NADH、NADPH、CoA）有特定需求。丁酸合成每分子消耗2分子NADH，而乙酸合成则为净产NADH。因此，在共生产多种SCFAs时需平衡氧化还原状态。工程策略包括过表达NADH氧化酶、引入非天然辅因子循环系统等。各模块的强度需通过启动子工程、拷贝数优化及RBS文库筛选进行系统适配。以枯草芽孢杆菌丁酸合成为例，采用模块化组装策略，可以将丁酸产量从初始的3.2 g/L提升至18.5 g/L。
4SCFAs合成的动态智能调控系统构建
4.1 SCFAs生物合成的智能调控原理与益生功能
在利用工程益生菌进行疾病缓解的过程中，实现有益分子在病灶部位的按需、精准释放是提升疗效与安全性的关键。SCFAs作为一类具有重要生理功能的代谢物，其缓解价值不仅取决于产量，更取决于释放的时空特异性。通过构建智能生物传感器与动态调控回路，工程益生菌能够感知体内病理信号并动态调控SCFAs的合成，为IBD等慢性疾病的缓解带来了革命性前景。
基于传感-响应回路的动态调控是SCFAs精准缓解的核心价值，实现了从“持续给药”到“按需给药”的跨越（图3）。将生物传感器与治疗性基因回路耦合，即可构建能够感知并响应体内环境的智能缓解系统。遗传电路设计的进步，包括新型调控工具和表达“调谐旋钮”，使得构建此类复杂回路成为可能。在IBD缓解中，这种智能响应策略展现出巨大潜力。当前的研究方向是构建能够原位检测特定生物标志物并通过产生有益物质作出响应的益生菌。例如，工程化的智能响应型益生菌可实时监测炎症并动态释放有益分子。这种动态调控的优势在于其高度的时空特异性。与传统的持续表达疗法相比，感应-响应系统能够避免在健康组织中产生不必要的代谢负担或脱靶效应，仅在疾病发作时启动SCFAs等有益分子的合成，从而显著提高治疗的安全性和效率。
SCFAs动态调控系统在神经精神疾病及复杂免疫疾病缓解中展现出跨界调控的潜力。工程益生菌的缓解价值不仅限于肠道局部，其通过肠-脑轴对中枢神经系统产生的远端效应正受到越来越多的关注。一项创新研究通过工程化EcN负载释放CO/H2S的共聚物，实现了气体递质在肠道炎症部位的靶向递送。该策略不仅通过调节炎症、恢复肠道屏障和重塑菌群缓解IBD，而且值得注意的是，靶向递送还提高了神经保护代谢物（如吲哚乙酸和γ-氨基丁酸）的水平，通过肠-脑轴减少了神经炎症，并减轻了IBD小鼠的焦虑和抑郁样行为。这一研究表明，在肠道内进行精准的代谢调控（包括SCFAs的产生及相关的代谢网络变化）能够产生系统的、跨器官的缓解效益。工程益生菌因此被开发为体内药物递送系统、生物传感器和黏膜疫苗，为IBD、代谢紊乱、癌症甚至神经退行性疾病的管理提供了新工具。
本节重点讨论面向体内活菌治疗的动态智能调控系统。与体外发酵中相对稳定的环境不同，肠道微环境复杂多变，因此需要构建能感知炎症信号或代谢物浓度的智能回路，以实现SCFAs的按需合成。这种复杂的遗传电路设计主要服务于精准医疗场景，而非传统的体外生物制造。通过整合高灵敏度的生物传感器与精细调控的遗传电路，工程益生菌能够实现SCFAs在病灶部位的动态、按需合成。这种“感知-响应”的缓解模式，不仅极大提升了IBD缓解的精准性和安全性，而且通过肠-脑轴等途径将缓解效益扩展至神经精神领域，标志着生物制剂从简单的药物递送向智能、自适应系统演进的重要范式转变。
4.2 开发SCFAs特异性生物传感器
SCFAs作为肠道微生物代谢的关键产物，其浓度动态与IBD、代谢综合征及神经精神疾病等多种病理状态密切相关。实现对肠道内SCFAs的实时、原位感知，对于疾病的精准诊断和干预至关重要。得益于合成生物学的进步，基于工程益生菌的全细胞生物传感器为这一挑战提供了革命性的解决方案。这些“智能”微生物能够将特定的SCFAs浓度信号转化为可读的输出信号，从而在诊断、治疗和基础研究中发挥重要作用。
SCFA生物传感器的开发依赖于精密的遗传设计，其核心在于构建高灵敏度与特异性的传感-响应回路。生物传感器的构建通常以特定的转录因子为基础。研究表明，通过采用一种设计原型构件快速测定基因表达设计空间并确定最优遗传设计的方法，可以在临床相关菌株中高效构建代谢物生物传感器。例如，利用大肠杆菌来源的PrpR转录激活子构建的EcN丙酸传感器，具有59 倍的宽动态范围，且灵敏度提升超过500 倍，能够匹配生物相关浓度。除了丙酸，针对其他SCFAs（如丁酸）和肠道代谢物的传感器也在开发中。例如，有研究成功构建了能够感应SCFAs浓度的遗传回路，其报告蛋白（如sfGFP）的表达量与SCFAs浓度成反比，这为测量SCFAs和递送生物活性分子提供了互补的诊断工具。研究人员基于转录调控因子FadR（脂肪酸代谢调控蛋白）构建了丁酸响应型生物传感器。在无丁酸时，FadR结合DNA并抑制下游基因表达；当丁酸存在时，丁酸与FadR结合诱导其构象变化，使其从DNA上解离，从而解除抑制。通过将FadR结合位点置于荧光蛋白（sfGFP）报告基因的上游，可构建丁酸浓度依赖的表达系统。优化后的传感器动态范围达48 倍，检测限低至50 μmol/L，可实现对肠道环境中丁酸水平的实时监测。此外，研究人员还开发了基于转录因子Pip的丁酸传感器，通过定向进化改造Pip的配体结合域，使其对丁酸的响应特异性较野生型提升了10 倍，可有效区分丁酸与丙酸、乙酸等结构类似物。为了提升诊断的特异性，避免单一信号的假阳性，研究人员采用了布尔逻辑门设计。通过构建能够同时感应硫代硫酸盐和硝酸盐两种炎症标志物的生物传感器，显著提高了对肠道炎症诊断的特异性。生物传感器的开发流程也在向自动化和高通量方向演进。例如，利用适配体偶联的核酶库和核酶再生方法，可实现RNA生物传感器的从头快速体外进化（DRIVER）。该平台结合液体处理系统上的高通量表征，能够以可扩展的流程并行发现和表征针对多种小分子的生物传感器。这些先进的工程化手段，使得为特定体内代谢物浓度定制高功能生物传感器成为可能。
优化后的SCFA生物传感器在疾病诊断与监测中展现出极高的应用价值，并催生了新型的诊疗一体化策略。生物传感器最直接的应用是非侵入性地实时监测疾病状态。例如，一种经过优化的钙卫蛋白生物传感器，结合了锌摄取调节因子控制的启动子和一个记忆回路，能够在体内检测并记录肠道炎症。其激活水平与2 种独立结肠炎小鼠模型中结肠的钙卫蛋白水平密切相关。更有研究开发了智能响应诊疗益生菌，可实时监测和记录IBD的发生与进展，并通过响应硫代硫酸盐水平的自我调节机制释放有益分子，在结肠炎小鼠模型中有效改善了疾病。为了克服传统光学报告信号（荧光/生物发光）在体内组织穿透性差的限制，前沿研究已转向更适于临床的成像模式。例如，通过工程化EcN表达声散射蛋白纳米结构（气囊），使其在感应炎症生物标志物后产生超声对比信号，从而实现了对小鼠肠道炎症的非侵入性超声成像。 此外，整合了环境适应力强的生物传感器细菌和微型化电子读出的可摄入微生物电子设备，为胃肠道内生物分子的原位检测提供了硬件平台。研究人员已成功在模式生物秀丽隐杆线虫体内，利用细菌传感器动态报告其肠道环境中乳酸浓度的变化，并首次在体内检测到调控寿命的胆汁酸类似物分子，展示了其在解析宿主-微生物互作中的潜力。针对重度抑郁症等复杂精神疾病，也有研究提出开发基于益生菌的多输入可摄入生物传感器，用于表征与疾病相关的关键肠道代谢物（包括丁酸等），旨在为疾病病理生理学提供定量理解。总之，这些传感器有望为非侵入性诊断提供新途径，并可能转变胃肠道疾病的临床管理方式。
生物传感器的终极价值在于其与治疗回路的耦合，实现按需、自调节的缓解。这要求构建稳健的遗传回路，以整合和处理活细胞中的多个信号，从而实现检测与响应一体化。在IBD治疗中，这一理念已得到验证。例如，将上述钙卫蛋白生物传感器与抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的产生相耦合，证明该传感器能够感知并响应疾病，从而缓解化学诱导的结肠炎。另一个模块化系统集成了可检测炎症标志物一氧化氮的传感器、溶血素分泌系统和人源化抗肿瘤坏死因子α（TNFα）纳米抗体库，成功实现了对一氧化氮的浓度依赖性响应。这一设计逻辑同样适用于SCFAs的动态调控——通过将SCFAs特异性生物传感器与合成途径中的关键酶基因（如bcd、tesBT）耦合，可构建出响应肠道内SCFAs浓度变化并自主调节其产量的闭环控制系统，从而避免代谢物过度积累，实现治疗窗口的精准维持。除了直接生产药物蛋白，生物传感器还可用于动态调控细胞代谢。例如，基于转录因子的丙二酰辅酶A生物传感器已被开发出来，其不仅可用于原位监测细胞内代谢物浓度，还可作为传感器-逆变器用于代谢通量的负反馈调节，或作为代谢开关平衡源途径和汇途径，从而优化微生物细胞工厂的生产效率。尽管目前用于快速检测体液中SCFAs的光学、电化学和细胞传感器在灵敏度和复杂性上仍面临挑战，但基于工程益生菌的全细胞生物传感器因其特异性、对恶劣环境的耐受性等优势，正展现出巨大的应用前景。可以预见，整合了SCFA感知能力的工程益生菌，将成为诊断、监测和缓解肠道及全身性疾病的重要平台工具。
4.3 应用CRISPRi/a技术实现SCFAs代谢通量的精确调控
在工程益生菌的开发中，实现SCFAs等有益分子的动态、按需生产是提升疗效和降低代谢负担的关键。传统的诱导型启动子或静态过表达策略缺乏对体内复杂生理环境的响应能力。CRISPRi和CRISPRa技术利用核酸酶失活的Cas蛋白对基因转录进行精准的抑制或增强，为在复杂代谢网络中实现SCFAs的智能化、可编程调控提供了革命性工具。
CRISPRi与CRISPRa技术构成了精准、可逆的转录调控工具箱，其核心在于对基因表达强度的双向和精细化控制。CRISPRi通过dCas9蛋白与阻遏结构域融合，靶向基因的启动子或编码区，从而物理性阻碍RNA聚合酶的结合或延伸，实现高效的基因敲低，通常可达到90%～99%的抑制效果且脱靶效应最小。这在微生物中尤为可靠，并已用于大规模的功能基因组筛选。与CRISPRi相反，CRISPRa旨在激活基因表达。通过将激活结构域（如ω亚基）连接至可编程的CRISPR-Cas DNA结合结构域上，可实现对目标基因的上调。早期的细菌CRISPRa系统依赖于σ70启动子，灵活性有限，而新一代基于σ54依赖性启动子的真核样细菌CRISPRa系统支持远距离、多输入调控，并具有高动态范围，极大地扩展了其应用潜力。结合化学或光诱导的二聚化系统，可以进一步构建可诱导的复杂基因调控平台，实现在同一细胞内对多个基因进行独立、正交的控制，甚至构建AND、OR、NOT等逻辑门操作。这种正交性和可诱导性，使得研究人员能够构建复杂的转录程序，适用于大规模的转录组工程。CRISPR工具的精髓在于其可编程性，例如，可以通过工程化向导RNA（gRNA），使其在与特定触发RNA相互作用时才激活，从而实现对内源基因的严格逻辑控制，这为响应多重体内信号提供了可能。
在SCFAs代谢工程中，CRISPRi/a技术通过实现代谢通量的时空调控，能够显著提升产量与细胞适应性。生产SCFA等高价值化学品的核心矛盾是宿主生长与产物合成对代谢资源的竞争。一个成功的策略是利用CRISPRi构建动态代谢开关，将菌体生长阶段和产物合成阶段在时间上分离。例如，为生产丁烯酸，研究人员构建了CRISPRi/dCpf1介导的动态代谢开关，通过调控脂肪酸合成途径中的fabI基因表达，在积累足够生物量后，将碳通量从脂肪酸合成转向丁烯酸生产。该无毒开关在补料发酵中将丁烯酸滴度提高了6 倍，并因其对宿主细胞生长抑制更小而优于传统的有毒化学开关。这种动态调控的逻辑可以进一步升级为完全自主的反馈回路。通过将基于CRISPRi的NOT门与途径关键代谢物（如葡糖胺-6-磷酸）的生物传感器相结合，可以构建自主双重控制系统。该系统能够感知中间代谢物的水平，并据此自调节靶基因的表达，从而在无需任何外部诱导物或环境切换的情况下，平衡和优化流向目标产物（如N-乙酰葡糖胺）的代谢通量，在大规模生物反应器中展现出鲁棒性和稳定性。除了时间控制，CRISPR工具还可用于空间正交调控，以平衡复杂代谢网络的分支。例如，通过快速生成由dCas9和LacI双重调控的正交T7-lac启动子变体，可以构建dCas9依赖的“节流阀”，在细菌中用于节流和选择性重定向碳通量，这在多分支的生物合成途径（如紫色杆菌素途径）中至关重要。
CRISPRi技术已被成功应用于动态调控丁酸合成途径中的关键限速酶。在大肠杆菌中，研究人员利用CRISPRi系统对丁酸合成途径的竞争途径进行动态抑制。通过设计靶向ldhA和乙醇脱氢酶基因（adhE）的sgRNA，在菌体生长前期抑制乳酸和乙醇的合成，将碳通量导向丁酸生产；在发酵后期解除抑制，恢复菌体代谢平衡。该动态调控策略使丁酸产量较静态敲除菌株提高1.8 倍，同时避免了因完全敲除竞争途径导致的生长缺陷。此外，CRISPRi还被用于精确调控丁酸合成途径中各酶的表达比例。通过使用不同强度的sgRNA或dCas9变体，可实现对Bcd、Ptb等关键酶的表达进行梯度调控。研究表明，当Ptb表达水平为AtoB的1.5 倍、Bcd表达水平为AtoB的2 倍时，丁酸合成通量达到最优，较未优化菌株提高2.3 倍。CRISPRa技术同样可用于SCFAs合成途径的激活。在丙酸杆菌中，研究人员构建了基于dCas9-VP64的CRISPRa系统，靶向丙酸合成途径中的限速酶基因ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）和pcc的启动子区域。通过同时激活上述2 个基因，丙酸产量提升至4.2 g/L，较对照提高2.1 倍。该策略避免了过表达质粒的代谢负担，且可通过诱导型启动子实现时空特异性调控。
在工程益生菌的开发中，CRISPRi/a技术为构建体内响应的智能缓解系统提供了核心调控元件，并展现出在复杂菌群中编辑的潜力。将CRISPRi/a系统与生物传感器结合，是构建“感知-响应”智能益生菌的关键。这种智能细菌能够感知疾病生物标志物（如炎症信号或特定的SCFAs浓度变化），并通过CRISPRi/a动态调整有益分子（包括SCFAs本身或抗炎因子）的产生。更有趣的是，细菌天然的CRISPR-Cas免疫系统本身就可能受到肠道微环境的调控。研究发现，鼠柠檬酸杆菌的I-E型CRISPR-Cas系统在小鼠肠道缺氧环境中被氧响应转录调节因子Fnr激活，这表明CRISPR系统可能是一种适应肠道环境、受生理信号调控的先天防御机制。这一发现提示，未来或可借鉴这种天然的调控逻辑来设计对肠道环境更敏感的工程系统。在技术递送层面，基于噬菌体的CRISPR相关转座酶递送系统能够实现对目标细菌的高效、特异性基因编辑，这为直接在复杂的肠道微生物群落中对特定成员进行原位工程化改造提供了可能，从而更精准地调控菌群功能和SCFA的产生。
CRISPRi/a技术凭借其可编程性、正交性和可诱导性，已成为在时间和空间维度上动态调控SCFA代谢通量的核心技术。它不仅通过构建智能开关和自主反馈回路大幅提升了微生物细胞工厂的生产效率，更重要的是，为下一代工程益生菌赋予了“智能”内核，使其能够感知体内病理信号，并通过复杂的逻辑运算动态调整输出，最终实现真正意义上的个性化、自适应的精准缓解。
4.4 设计环境触发与负反馈回路保障益生菌安全
在开发用于疾病缓解的工程益生菌时，两个核心设计原则至关重要：一是确保活性在特定病理环境下被精准激活，以最大限度地提高疗效并减少脱靶效应；二是在有益分子（如代谢物）产生后，系统需具备内在的稳态维持能力，以防止其过度积累对宿主或工程菌自身造成毒性。合成生物学通过构建环境触发回路与负反馈回路，为实现这一“精准激活”与“安全约束”的平衡提供了强大的工程化解决方案。
环境触发回路是实现疾病特异性激活的关键，使工程菌能够感知并响应复杂的病理微环境。工程益生菌的缓解功能不应是持续、无差别的，而应像“智能药物”一样，只在疾病部位或疾病活动期被激活。这要求菌株能够精确感知体内特定的生物标志物。在IBD研究中，识别环境因素驱动疾病的机制被列为关键挑战，并通过系统生物学分析和计算机建模整合“暴露组”，旨在识别对暴露物的生物反应特征，这为设计能够感应特定环境或病理信号的生物传感器提供了理论框架和目标。这种感应能力可以建立在菌群与宿主共适应的自然现象之上。研究表明，肠道微生物群及其代谢物在响应环境温度波动时，能够赋予宿主代谢可塑性，某些特定细菌对温度变化敏感并与宿主的动态代谢适应相关联。可以借鉴这种自然的环境感应机制，设计出对疾病相关的局部环境变化（如pH值、氧分压、特定代谢物或炎症分子）高度敏感的工程菌。为了实现对这些信号的实时、自动化响应，可以引入计算机辅助的闭环控制策略。研究表明，模型预测控制等算法能够在活酵母细胞中成功调控基因表达长达数千分钟，无论是维持设定值还是追踪时变的参考信号。尽管目前这多在实验室微流体平台上实现，但其原理为未来设计能够根据体内传感器读数实时、动态调整有益分子输出的智能益生菌控制系统描绘了蓝图。
负反馈回路是防止代谢物毒性、维持系统稳健性的内在稳定器，确保了缓解的安全性和可持续性。当工程菌被成功激活并开始产生治疗性代谢物时，如何防止其过度积累成为新的挑战。过量的产物可能抑制工程菌自身的生长，或对宿主肠道造成损伤。此时，负反馈回路发挥着不可或缺的稳态调节作用。从控制理论的角度看，基于反馈的控制机制赋予了生命系统稳态、噪声抑制和高动态性能等优点。在酵母中，对转录因子ROX1的研究为负反馈的稳定性功能提供了实证。ROX1作为直接转录抑制因子作用于自身基因，形成了一个负反馈回路。该回路不仅调控其在环境变化时的快速诱导行为，而且能稳定基因表达，对抗由自然遗传变异引起的扰动。在具有完整ROX1反馈回路的菌株中，不同遗传背景导致的表达水平差异范围更小，显示出负反馈赋予的突变鲁棒性。这一原理可以直接应用于工程益生菌的设计中。例如，可以构建这样的回路：目标代谢物（如丁酸）的积累，能够作为信号反馈抑制其自身合成途径中的关键酶基因表达，或将代谢通量导向其他分支，从而将产物浓度维持在一个安全、有效的“治疗窗口”内。这种内置的自我调节机制，减少了对不可预测的体内环境或菌群密度的依赖，使缓解输出更加可控和可靠。
环境触发回路与负反馈回路是构建下一代安全、高效工程益生菌的相辅相成的两大核心设计模块。触发回路赋予其“智能靶向”能力，确保缓解动作在正确的时间和地点发生；而负反馈回路则扮演着“安全阀”和“稳定器”的角色，防止系统过载，确保缓解的长期安全性和生物系统的鲁棒性。将二者整合入统一的遗传回路中，将有望构建出能够真正模拟自然生物调控精度与稳健性的活体系统，为应对IBD等复杂慢性疾病提供全新的动态缓解范式。
结 语
本综述系统阐述了利用合成生物学技术构建工程益生菌以实现SCFAs在肠道内高效、精准合成的前沿策略与完整路径。SCFAs作为维系肠道稳态、调节免疫与代谢的关键微生物代谢物，其传统补充方式面临靶向性差、个体响应异质性大等瓶颈。合成生物学的发展使得将益生菌改造为智能“活体生物工厂”成为可能，为实现SCFAs的原位、按需递送提供了变革性方案。
实现这一目标主要依赖三大核心环节的协同创新。首先，是理想底盘菌株的理性设计与构建。一个合格的工程菌株必须同时具备卓越的安全性、在复杂肠道环境中的强大鲁棒性以及高效的遗传可操作性。这要求从具有长期安全应用历史的食品微生物（如乳酸菌、EcN）中筛选宿主，并利用先进的CRISPR基因编辑工具进行精确遗传改造，同时通过工程化策略增强其耐受胃酸、胆汁及定植肠道黏膜的能力。其次，是对SCFAs合成静态代谢网络的系统性强化。这包括从天然菌株或宏基因组中挖掘高效限速酶，通过理性设计与定向进化提升其催化性能，并运用AI技术整合多组学数据，对合成途径进行智能设计、模拟与优化，从而最大限度地提升菌株固有的SCFAs生产能力。最后，也是最具前瞻性的环节，是构建动态智能调控系统。通过开发能够特异性感应肠道炎症标志物或SCFAs浓度变化的生物传感器，并将其与CRISPRi/a等可编程基因调控工具耦合，可以设计出能够感知体内病理信号、并据此动态启动或调整SCFAs合成的“感知-响应”回路。这种闭环调控实现了有益分子在时间与空间上的按需释放，极大提升了干预的精准性与安全性。
展望未来，工程益生菌作为SCFAs递送平台的研究应向更深化、更融合的方向发展。在科学层面，重点在于推动智能动态系统在复杂动物模型中的功能验证，并探索其通过肠-脑轴等途径产生的系统性疗效；同时，利用AI与个体化多组学数据，实现底盘菌株与调控程序的个性化适配。安全性评估方面，体外生物制造可参照传统食品添加剂的安全性评价体系，重点关注菌株在发酵条件下的遗传稳定性与产物纯度；而体内活菌治疗则需按照活体生物药的监管要求，开展更为严格的遗传稳定性、基因水平转移风险、宿主免疫原性评价及长期定植生态影响研究。在转化应用层面，亟需建立针对工程益生菌作为LBPs的安全性、遗传稳定性及生态风险评估标准，明确其与体外生物制造路径在监管框架上的本质区别。对于体外发酵生产SCFAs作为食品添加剂的应用，可依托现有食品工业法规体系加速转化；而对于体内活菌治疗路径，则需在菌株设计、临床前评价、个体化适应性及长期安全性监测等方面建立更为严格的审评标准。通过合成生物学、微生物组学、AI与食品科学的深度融合，工程益生菌技术有望突破传统营养干预的局限，实现从“补充分子”到“工程益生菌”的范式转变，为个性化营养、肠道疾病管理与健康促进开辟精准可控的新路径。
作者简介
通信作者
江凌，博士，南京工业大学教授、博士生导师，南京工业大学食品与轻工学院院长，国家优青，江苏省杰青。2010年毕业于华南理工大学发酵工程专业工学博士，获全国优秀博士学位论文提名奖。主要研究领域：食品合成生物学。近5年以唯一或共同通信在Nat. Catal., Cell Syst., Cell Rep. Phys. Sci., Trends Biotechnol., J. Agr. Food Chem.等期刊发表论文80余篇，其中19 篇次入选ESI高被引和热点论文，1 篇入选2023年中国食品科学技术领域十大热点论文，连续入选斯坦福大学“全球前2%顶尖科学家”榜单。近5年受邀担任Food Safety and Health共同主编、Food Frontiers、Food Chemistry International和Food Materials Research副主编，《食品科学》《食品与发酵工业》等中文核心期刊编委。近5 年授权国家专利28 件，申请PCT专利3 件，研究成果获中国轻工业联合会科技进步一等奖（1/8）、中国商业联合会科技进步特等奖（1/15）、江苏省轻工协会科技进步一等奖（1/8），荣获新疆“天池英才”特聘专家、江苏“333工程”第二层次培养对象、中国产学研合作促进会科技创新人物奖、中国商业联合会科技创新人物奖。
第一作者
朱政明博士，南京工业大学教授、硕士生导师。江南大学-瑞典查尔姆斯理工大学联合培养博士。瑞典皇家理工学院访问学者。长期从事食品合成生物学研究。主持国家自然科学基金面面上/青年等项目。近5年以独立一作/通信作者在 Trends Biotechnol.、J. Agr. Food Chem.等SCI期刊发表论文15 篇。出版中文著作1 部，并受邀为英文著作撰写章节。担任SCI期刊Front. Bioeng Biotech.的评审编辑。相关工作获省部级成果鉴定2项（国际先进），获中国商业联合会科技进步特等奖1 项（排名2），中国轻工业联合会科技进步一等奖1 项（排名7），江苏省轻工协会科技进步一等奖1 项（排名7）。
引文格式：
江凌, 刘振磊, 朱政明. 工程益生菌短链脂肪酸的合成生物学设计: 从代谢强化到智能调控[J]. 食品科学, 2026, 47(10): 1-18. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260303-027.
JIANG Ling, LIU Zhenlei, ZHU Zhengming. Synthetic biology design of engineered probiotics for short-chain fatty acid production: from metabolic enhancement to smart regulation[J]. Food Science, 2026, 47(10): 1-18. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260303-027.
实习编辑：杨琼；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为对标农业农村部2035年科技规划及“十四五”“十五五”发展方向，推动农产品加工与储运的工程化、智能化、绿色化升级，由湖南省农业科学院、湖南农业大学、北京食品科学研究院、国际食品科技联盟（IUFoST）、中国农业大学、岳麓山工业创新中心主办，湖南大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湖南中医药大学、湘潭大学、岳麓山实验室协办，中国食品杂志社、洞庭实验室、湖南省食品科学技术学会、湖南省农产品加工与质量安全研究所、湖南农业大学食品科学技术学院、Springer Nature-《Agricultural Products Processing and Storage》杂志承办的“第二届农产品加工与食品制造国际学术研讨会—创新引领绿色智造，AI赋能科技进步”，将于2026年9月19-20日（9月18日会议报到）在中国 湖南 长沙召开。
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