Nat Biotechnol | 汪凌波/张锋团队开发供体互补型先导编辑DoPE实现无疤痕千碱基级和文库级DNA精准插入|dna|供体|先导编辑|张锋|文库|显子|汪凌波|细胞

精准的靶向DNA插入是基因功能分析、疾病模型构建、细胞治疗与基因治疗开发的核心技术。传统同源定向修复（HDR）依赖Cas9诱导的DNA双链断裂（DSB）启动重组，不仅编辑效率低，还易引发染色体重排、p53介导的DNA损伤应答，在干细胞、免疫细胞等治疗级细胞中应用风险显著。先导编辑（Prime editing）是一种DSB-free编辑技术，可精准实现小片段的插入、替换与缺失，但标准系统仅能高效编辑～50 bp以内的序列；双 pegRNA先导编辑系统虽拓展了插入范围，但仍局限于亚千碱基级别。依赖重组酶/转座酶的两步法（如 PASSIGE、PASTE）虽可实现千碱基级插入，但会留attL/attR等外源连接疤痕，且需要额外表达重组酶，操作繁琐、递送负担重。更关键的是，如何实现文库规模的多样化序列原位插入/替换还存在重要挑战。

2026年8月28日，复旦大学汪凌波团队在Nature Biotechnology期刊发表题为Donor-complementary prime editing enables precise kilobase and library-compatible DNA insertions的研究论文，开发出供体互补型先导编辑技术（Donor-complementary prime editing,DoPE）。该技术无需DSB、无需外源重组酶/转座酶，仅通过一步反应即可实现长达12.5 kb的DNA序列精准插入，同时兼容文库级原位饱和诱变，为功能基因组筛选、基因治疗、合成细胞工程等领域提供了强有力的工具。

汪凌波团队提出“供体-基因组互补退火” 设计思路，对双pegRNA先导编辑系统进行了两大改造：1. 引入3’突出端双链DNA供体（3’-overhang double-stranded DNA, odsDNA），作为插入片段的载体，两端带有单链3’突出端；2. 设计一对突出端互补型 pegRNA（opegRNA），其逆转录模板（oRTT）区域可转录出与odsDNA突出端完全互补的基因组3’单链 flaps。搭配经核定位信号优化的PE2*先导编辑器，三者共同构成DoPE系统：编辑器在靶位点切割DNA，由opegRNA模板逆转录出基因组3’ flaps，与odsDNA供体两端的3’突出端互补退火，最终完成序列的精准插入。全程不产生 DSB，也无需任何外源重组酶或转座酶，插入位点无外源序列疤痕。

图1 DoPE示意图

研究团队首先在ACTB-EGFP荧光报告系统中完成测试：通过测试10~42 nt不同长度的供体突出端，发现约 30 nt 的突出端可实现最高的精准插入效率（13.00%）。一系列对照实验证实，缺失 opegRNA、odsDNA 或逆转录酶活性均无法实现靶向插入，验证了DoPE的作用机制严格依赖三者的协同作用。随后，研究团队在VEGFA、AAVS1、TP53、DMD、EMX1、HEK3等不同基因组位点独立测试，均检测到了正确的DNA靶向插入。在细胞类型覆盖上DoPE不仅在HEK293T细胞中有效工作，还成功在人胚胎干细胞（hESC）、诱导多能干细胞（hiPSC）、骨髓间充质干细胞（hBMSC）、HeLa 细胞中实现精准插入。特别值得关注的是，DoPE可通过“mRNA +化学合成ssDNA”的全RNA/单链DNA格式递送，规避了双链 DNA 引发的细胞天然免疫反应，为体内治疗与临床级细胞编辑提供了可能的递送方案。

DoPE 最重要的特性之一，是仅需一对opegRNA，即可通过更换供体序列，在同一位点实现任意多样化的序列插入，兼容文库级高通量筛选应用。研究团队构建了包含 278 种氨基酸替换的供体文库，仅用一次转染，就在靶位点成功回收了 96%~100% 的目标变异，实现了氨基酸分辨率的原位饱和诱变；进一步构建单核苷酸分辨率文库（849 种变异），插入覆盖率可达 85.87%~99.41%。结合FACS分选，可直接富集功能缺失与中性突变，为原位功能基因组筛选提供了无DSB干扰的全新平台，尤其适用于对DNA损伤高度敏感的干细胞体系。

针对基因大小片段的插入需求，团队通过 PCR 扩增结合λ核酸外切酶消化制备长片段 odsDNA 供体，成功实现了从0.33 kb到12.5 kb不同长度片段的精准插入。研究同时发现，同时抑制NHEJ和微同源介导的末端连接（MMEJ）通路，可将 DoPE 编辑效率提升1.47~1.65倍。

为探索 DoPE 的临床治疗潜力，团队以多囊肝致病基因PRKCSH为模型，验证了突变不依赖型基因矫正方法：无需针对每种突变单独设计编辑工具，而是通过替换整个突变外显子区域，统一矫正不同类型、不同位置的致病突变。结果显示，无论是单外显子替换还是双外显子同时替换，DoPE 均可成功修复携带不同突变的细胞系，稳定恢复PRKCSH蛋白的表达；单外显子矫正效率可达 16%~19%。全基因组脱靶分析表明，插入事件高度富集于靶位点，无明显脱靶整合，证明了技术的安全性。

DoPE技术实现了一步法、无DSB、无重组酶、文库兼容的千碱基级DNA精准插入，该技术不仅为功能基因组学研究提供了原位饱和诱变的新工具，更为单基因病的基因治疗提供了通用型思路。此外，DoPE在CAR-T细胞定点整合、干细胞工程、农作物基因组改良等领域也具有应用前景。

复旦大学汪凌波研究员为本文通讯作者，张锋教授为共同通讯作者。博士生方允正和博士后唐敬尧为共同第一作者，博士生席佳玮、硕士生杨斌锋为共同作者，本科生曾炜英为研究提供了帮助。

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汪凌波为复旦大学研究员、博士生导师，国家优青。因课题组发展需要，欢迎青年才俊加入课题组从事博士后研究，也欢迎优秀学子报考本课题组攻读复旦大学博士学位。联系人：汪老师（邮箱wanglingbo@fudan.edu.cn）。实验室地址：复旦大学江湾校区。

https://www.nature.com/articles/s41587-026-03296-w

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（*排名不分先后）