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Introduction
赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一种以肾毒性作用而闻名的真菌次生代谢产物，广泛存在于饲料和食品中，包括谷物、谷物制品、奶制品、肉制品、蛋制品、水果、蔬菜、坚果、葡萄酒、啤酒，甚至配方奶粉等。OTA的主要作用靶点是肾脏近端小管。目前研究表明OTA诱导肾毒性的潜在机制主要涉及多种因素的相互作用，包括诱导内质网应激、刺激氧化应激、破坏代谢酶、干扰转录调控、抑制蛋白质合成、细胞周期阻滞、干扰细胞信号稳态、刺激细胞凋亡、激活自噬、诱导焦亡和铁死亡。
线粒体相关内质网膜（MAMs）是内质网和线粒体之间的物理接触位点，促进双向通信控制细胞死亡信号，例如促进Ca2+、磷脂和胆固醇从内质网到线粒体的运输、蛋白质-蛋白质相互作用、分子易位和脂质代谢等，引发细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬、焦亡和铁死亡等。位于MAMs中的Sigma-1受体（Sig-1R）起着多功能伴侣的作用，监督各种过程，包括离子通道的调节、脂质转运、Ca2+信号传导、线粒体功能、凋亡、自噬和铁死亡。我们最近的研究表明，Sig-1R在OTA诱导的人近端肾小管上皮（HK-2）细胞线粒体途径细胞凋亡导致的肾毒性中起着重要作用。然而，Sig-1R在OTA诱导其他形式的调节性细胞死亡导致的肾毒性中的作用还未见相关研究报道。
鉴于Sig-1R在细胞死亡中的重要作用，以及Sig-1R涉及OTA诱导的线粒体途径细胞凋亡的调节，进一步研究Sig-1R是否参与OTA诱导的其他形式的调节性细胞死亡是十分有必要的。因此，遵义医科大学研究生姚松和遵义医科大学公共卫生学院教授谌小立等以线粒体途径细胞凋亡和铁死亡为重点，通过体外实验来阐明Sig-1R参与调节OTA诱导的肾毒性的机制。
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Results and Discussion
OTA增加胆固醇的生物合成和运输
胆固醇积聚会导致细胞毒性，并对肾功能产生负面影响。甲羟戊酸途径负责胆固醇的从头生物合成，从乙酰辅酶A开始，涉及20多种酶，其中大多数位于内质网膜中。该途径中的一种关键酶是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR），它位于内质网中，是胆固醇生物合成的限速酶。HMGCR基因在低甾醇浓度下被核固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）激活。SREBP2作为主要的转录调节因子，选择性地控制与胆固醇生物合成相关的基因，如HMGCR。尽管内质网是从头合成胆固醇的主要位点，但内质网中只发现了一小部分，占细胞总胆固醇的0.5%~1.0%。在胆固醇流动期间，内质网和线粒体通过MAMs上的物理接触点，在将磷脂和胆固醇从内质网运输到线粒体方面发挥核心作用。值得注意的是，与线粒体或内质网相比，MAMs的胆固醇含量很高。因此，各种MAMs蛋白，如含线粒体类固醇生成急性调节蛋白（StARD1）和GRAM结构域的蛋白1B（GRAMD1B），与线粒体胆固醇转运和类固醇生成有关，是胆固醇转运到线粒体的限速蛋白。如图2A-B和图4A-B所示，随着OTA的加入，SREBP2、HMGCR、StARD1和GRAMD1B的蛋白表达呈显著上升趋势，细胞的总胆固醇水平以剂量依赖的方式显著增加。这表明OTA增加了胆固醇的生物合成和从内质网到线粒体的转运。
图1 OTA和/或Sig-1R激动剂（Anavex 2-73）处理对HK-2细胞存活率和凋亡率的影响
图 2 OTA和/或Anavex 2-73处理对胆固醇和线粒体谷胱甘肽（mGSH）的影响
OTA诱导的氧化还原失衡加剧了胆固醇稳态的紊乱
细胞质中游离胆固醇的积累可能导致内质网应激（ERS）延长并破坏细胞内胆固醇稳态。相反，ERS还可以激活SREBP2和StARD1，促进胆固醇生物合成和向线粒体转运的增加。线粒体中胆固醇的过度积累通过多种机制损害线粒体功能，包括谷胱甘肽（GSH）氧化还原循环等关键抗氧化防御的活性降低、活性氧簇（ROS）的产生增加。此外，胆固醇超载阻碍了GSH从细胞质到线粒体基质的运输，导致mGSH耗竭，从而增加了ROS的产生。如图4A和B所示，添加OTA导致ERS的标志蛋白（GRP78和CHOP）、SREBP2和StARD1的蛋白表达呈显著上升趋势，而线粒体2-酮戊二酸/苹果酸载体蛋白（SLC25A11）的蛋白表达则呈显著下降趋势。这与图2B和3A所示的线粒体胆固醇和ROS水平的上升趋势以及图2E所示的mGSH水平的下降趋势是一致的。这些发现表明，OTA诱导ERS和氧化应激失衡，导致胆固醇生物合成和从内质网到线粒体的转运增加。此外，OTA诱导的ERS、氧化应激和胆固醇稳态失衡形成了一个恶性反馈回路。
图 3 OTA和/或Anavex 2-73处理对HK-2细胞ROS的影响
图4 OTA和/或Anavex 2-73处理对HK-2细胞相关蛋白表达的影响
OTA通过破坏氧化还原和胆固醇稳态诱导线粒体途径细胞凋亡和铁死亡
线粒体通透性转换孔（MPTP）的打开被认为是线粒体途径凋亡的关键事件。BCL-2同源拮抗剂/杀伤剂（BAK）、B细胞淋巴瘤-2-相关X蛋白（BAX）、亲环蛋白D（CypD）和肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（TRAP1）等蛋白在MPTP开放中具有重要作用。如图4A和B所示，OTA导致CypD、cleaved-Caspase-3和BAX的蛋白表达显著增加，呈剂量依赖性，而TRAP1和B细胞淋巴瘤-2-样蛋白1（BCL-XL）的蛋白表达则呈显著剂量依赖性下降（P < 0.05）。这与图1C和1E中观察到的凋亡率的显著上升趋势一致，表明OTA诱导了线粒体途径细胞凋亡。
高水平的ROS对线粒体功能有不利影响，导致MPTP的形成和最终的细胞死亡。而线粒体胆固醇的积累导致膜流动性丧失，进一步损害线粒体外膜渗透性并引发细胞凋亡。综合图1A中的细胞存活率、图1C和E中的凋亡率、图2A-B中的胆固醇水平、图2E中的mGSH水平、图3A中的ROS水平以及图4A-B中的蛋白质表达结果，很明显，OTA通过提高总胆固醇、线粒体胆固醇和ROS水平、降低mGSH含量、上调SREBP2、HMGCR、GRAMD1B、StARD1、GRP78、CHOP、CypD、BAX、Cleaved-caspase-3和ACSL4，以及下调SLC25A11、TRAP1、BCL-XL和GPX4来诱导线粒体途径细胞凋亡和铁死亡。简而言之，OTA可以通过破坏氧化还原和胆固醇稳态来诱导线粒体途径细胞凋亡和铁死亡。
Sig-1R通过调节氧化还原和胆固醇稳态在OTA诱导的线粒体途径细胞凋亡和铁死亡中起关键作用
Sig-1R在调节ERS和氧化应激中起着至关重要的作用，进而影响细胞凋亡和铁死亡。如图4A-B所示，OTA处理以剂量依赖的方式显著下调Sig-1R的蛋白表达（P < 0.05）。为了进一步阐明Sig-1R在OTA诱导的线粒体途径细胞凋亡和铁死亡中的关键作用，使用Anavex 2-73激活Sig-1R。如图4C-D所示，Anavex 2-73处理有效地激活了Sig-1R（P < 0.05）。Anavex 2-73预处理可以显著减轻OTA诱导的所有这些有害影响，表明Sig-1R在OTA诱导的线粒体途径细胞凋亡和铁死亡中起着关键作用。总之，OTA通过抑制Sig-1R进而促进SREBP2、HMGCR、GRAMD1B、StARD1、GRP78、CHOP、CypD、cleaved-Caspase-3、BAX和ACSL4，抑制TRAP1、SLC25A11、BCL-XL和GPX4，降低mGSH水平，增加总胆固醇、线粒体胆固醇和ROS水平，从而诱导HK-2细胞线粒体途径细胞凋亡和铁死亡。
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Conclusion
OTA通过抑制Sig-1R破坏HK-2细胞氧化还原和胆固醇稳态诱导线粒体途径细胞凋亡和铁死亡（见图5）。本文首次报道了Sig-1R对胆固醇稳态的调节及其在OTA诱导的线粒体途径细胞凋亡和铁死亡中的作用。
图5 OTA通过抑制Sig-1R干扰HK-2细胞氧化还原和胆固醇稳态诱导线粒体途径细胞凋亡和铁死亡的机制图
第一作者简介
姚松，男，医学硕士，2024年6月毕业于遵义医科大学卫生毒理学专业，研究生期间的研究方向为真菌毒素毒理；现为遵义市第一人民医院职工，主要从事医院感染管理、疾病预防控制、突发院感事件应急等相关工作。
通信作者简介
谌小立，教授，博导，研究方向为食品营养与毒理，主要从事真菌毒素和环境持久性污染物毒理及生物活性物质对其毒性的缓解研究。主持国家自然科学基金2 项，省级项目2 项。在Food Hydrocolloids、Archives of Toxicology、Food and Chemical Toxicology和Chemico-Biological Interactions等SCI杂志上以第一/通信作者发表论文20余篇。担任《Food Science and Human Wellness》第一届青年编委&第三届编委会编委，《Food and Health》编委，《食品安全质量检测学报》第三届编委，《食品研究与开发》第一届&第二届&第三届青年编委，《Frontiers in Microbiology》、《Frontiers in Nutrition》和《Foods》客座编辑，贵州省千层次人才，遵义市高校优秀科技工作者，遵义医科大学首批学科带头人。担任Environment International, Cell Death & Disease, Journal of Advanced Research, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Food Science and Human Wellness, Food Frontiers, International Journal of Biological Macromolecules, Food Bioscience, Advanced Functional Materials, Chemico-Biological Interactions, Aquaculture, Critical Reviews in Toxicology, Toxicology, Food and Chemical Toxicology, Toxicology and Applied Pharmacology, Journal of Functional Foods, Nutrients, Toxins等80多个SCI期刊审稿专家。
Ochratoxin A induces mitochondrial apoptosis and ferroptosis by inhibiting sigma-1 receptor to disrupt redox and cholesterol homeostasis
Song Yaoa,b,c,1, Wenying Chena,b,1, Hongwei Wanga, Ruiran Yanga, Yao Zhoua, Shuangchao Liua, Xiao Li Shena,b,*
a School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China
b Key Laboratory of Maternal and Child Health and Exposure Science, Guizhou Provincial Department of Education, Zunyi 563000, China
c Depatment of Hospital Infection Control, The First People’s Hospital of Zunyi (The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University), Zunyi 563000, China
*Corresponding author.
Abstract
Ochratoxin A (OTA), a secondary fungal metabolite known for its nephrotoxic effects, is widespread in various foods and animal feeds. Our recent investigation suggests a correlation between OTA-induced nephrotoxicity and sigma-1 receptor (Sig-1R)-mediated mitochondrial apoptosis in human proximal tubule epithelial-originated kidney-2 (HK-2) cells. However, the involvement of Sig-1R in OTA-induced nephrotoxicity, encompassing other forms of regulated cell death like ferroptosis, remains unexplored. In this research, cell viability, apoptotic rate, cholesterol levels, mitochondrial glutathione (mGSH) levels, reactive oxygen species (ROS) levels, and protein expressions in HK-2 cells treated with OTA and/or blarcamesine hydrochloride (Anavex 2-73) were evaluated. The results suggest that OTA induces mitochondrial apoptosis and ferroptosis by inhibiting Sig-1R, subsequently promoting sterol regulatory element-binding protein 2,3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, GRAM domain-containing protein 1B, steroidogenic acute regulatory protein, mitochondrial, 78 kDa glucose-regulated protein, CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, cyclophilin D, cleaved-caspase-3, B-cell lymphoma-2-associated X protein, and long-chain fatty acid-CoA ligase 4, inhibiting tumor necrosis factor receptor-associated protein 1, mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein, B-cell lymphoma-2-like protein 1, and glutathione peroxidase 4, reducing mGSH levels, and increasing total cholesterol, mitochondrial cholesterol, and ROS levels. In conclusion, OTA induces mitochondrial apoptosis and ferroptosis by inhibiting Sig-1R, thereby disrupting redox and cholesterol homeostasis in vitro. The regulation of cholesterol homeostasis by Sig-1R and its involvement in OTA-induced mitochondrial apoptosis and ferroptosis are reported here for the first time.
Reference:
YAO S, CHEN W Y, WANG H W, et al. Ochratoxin A induces mitochondrial apoptosis and ferroptosis by inhibiting sigma-1 receptor to disrupt redox and cholesterol homeostasis[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250372. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250372.
本文编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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