Adv Sci | 邵世鹏/张宏晨合作开发一种紧凑型高保真RNA成像平台—CDegSR在RNA单分子成像领域取得重要进展|rna|信号|张宏晨|成像平台|细胞|荧光|蛋白|邵世鹏|高保真

活细胞中 RNA 的动态变化是基因表达调控的关键环节，然而，传统成像策略长期受制于技术瓶颈，荧光蛋白类探针因背景干扰强、信噪比低，难以实现对单个 RNA 分子的清晰识别；而以 CRISPR-Cas13 为代表的可编程工具虽具优势，但其效应蛋白分子量过大（约 130–150 kDa ），不仅对靶标 RNA 产生显著的空间阻碍，也因载体容量限制而难以经由腺相关病毒等小型递送系统高效转入细胞。因此，在不显著扰动靶分子前提下实现内源 RNA 的高灵敏度、单分子级可视化，始终是该领域悬而未决的核心科学挑战。

针对上述难题，西南大学生命科学学院含弘研究员张宏晨与重庆医科大学基础医学院邵世鹏教授团队合作，在Advanced Science期刊发表题为Single-Molecule Imaging of Endogenous RNA UsingaMiniaturizedand Circularly Permuted CRISPR-Cas13Degron-Masking SystemCDegSR的研究文章。从蛋白质结构工程入手成功开发了一种紧凑型高保真RNA成像平台—CDegSR（ CRISPR-mediated Degron -based Signal Restoration ）（图1），通过融合蛋白质工程改造与条件性蛋白稳定性调控策略，在活细胞中实现了对内源性RNA的高信噪比单分子实时追踪，为解析基因表达的时空动态规律提供了有力的工具支撑。

图 1 ：高保真 RNA 成像平台 — CDegSR （ CRISPR-mediated Degron -based Signal Restoration

基于冷冻电镜解析的 PspCas13b-crRNA-tgRNA 三元复合物结构，研究者有选择性地去除 HEPN1 与 HEPN2 两个核酸酶结构域，将效应蛋白压缩至仅含核心识别区（ REC lobe ）的约 70 kDa 微型版本，命名为 miniCas13 。该设计不仅使蛋白尺寸缩减至原有的一半，也有效削弱了其对 RNA 靶点的位阻效应，并提升了成像的持续稳定性。然而，精简后的 miniCas13 仍为 “ 常亮型 ” 荧光蛋白，溶液中游离的未结合效应器会持续产生非特异性背景。为此，研究团队引入环状排列（ Circular Permutation ）策略，将蛋白的天然末端通过柔性连接子融合，并在靠近 RNA 结合界面的第 423 位氨基酸处开辟新的末端。在此基础上，在新末端融合了富含精氨酸的降解信号（ RRRG degron ），使得未结合靶标的 miniCas13 被蛋白酶体快速清除，而一旦结合 RNA ，该降解信号因空间位阻被遮挡，蛋白随之稳定存留。这种 “ 结合即稳定 ” 的智能调控机制，最终赋予 CDegSR 近二十倍的荧光诱导倍数，其信噪比远优于传统 dCas13 系统。

在单分子成像应用层面，团队靶向 POLR2A （ RNA 聚合酶 II 最大亚基） mRNA ，设计了 24 条 crRNA 组合，并通过慢病毒文库高效共递送，实现单个 mRNA 分子上多价 CDegSR 效应器的协同招募，从而突破衍射极限，达到单分子分辨能力。正交验证结果显示， CDegSR 标记的荧光 puncta 与单分子 RNA 荧光原位杂交（ smFISH ）信号高度共定位，皮尔逊相关系数达 0.77 ，假阳性率和假阴性率均低于 10% ，且标记本身不改变目标 RNA 的表达丰度与周转速率。研究团队还成功将该技术应用于多种 RNA 类型的成像，包括 NEAT1 、 7SK 、 SatIII 以及表达丰度极低（ nTPM =5.2 ）的 ZNF530 mRNA ，充分证明了 CDegSR 系统的普适性与灵敏度。

利用 CDegSR 平台，研究团队实现了对活细胞中 POLR2A mRNA 的高频单分子示踪，定量揭示了细胞核与细胞质之间 mRNA 扩散行为的显著差异。核内 mRNA 呈现亚扩散或受限迁移特征，暗示染色质结构、核体及蛋白网络所形成的密集核环境对转录本形成物理束缚；而胞质中的 mRNA 则扩散更为自由。进一步实验表明，当使用嘌呤霉素阻断翻译后， mRNA 的跳跃距离、扩散系数、异常扩散标度指数及分形维数均发生明显变化，提示翻译机器本身也参与调节 mRNA 的胞质扩散行为。这一发现为深入理解 mRNA 在细胞质中的命运调控机制提供了崭新的视角。

原文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.77533

制版人：十一

学术合作组织

（*排名不分先后）